芳香環(huán)丙基胺類化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽、其制備方法及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種結(jié)構(gòu)如通式(I)所示的芳香環(huán)丙基胺類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽，及其該類化合物的制備方法和該類化合物在制備預(yù)防或治療耳聾的藥物中的用途。其中，本發(fā)明所涉及的通式(I)中的R1、R2、R3、R4和R5如說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中所定義。
【專利說(shuō)明】
芳香環(huán)丙基胺類化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽、其制備方法及 其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明設(shè)及一種具有耳聾防治作用的芳香 環(huán)丙基胺類化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽、其制備方法及其在制備預(yù)防和治療耳聾的藥物 中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 耳聾是高發(fā)病率的人類感官或功能缺陷性疾病。耳毒性藥物是臨床上造成聽(tīng)力損 失或障礙的重要原因，同時(shí)也是臨床上兒童聽(tīng)力損失或障礙的重要原因。由于內(nèi)耳毛細(xì)胞 損傷后缺乏再生能力，并且毛細(xì)胞的損傷會(huì)導(dǎo)致與其相連的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元退化，因此， 毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷保護(hù)及其機(jī)制的研究在耳聾防治中尤為重要。
[0003] 目前耳毒性藥物所致毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的損傷保護(hù)研究主要集中在W 下幾個(gè)方面:1)減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷，如抗氧化劑和自由基清除劑等;2)抑制調(diào)亡信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)通路，如JNK信號(hào)通路、X連鎖調(diào)亡抑制蛋白（X-Iinked inhibitor of apoptosis proteins，XIAP)等；3)表觀遺傳學(xué)調(diào)控，如非編碼微小RNA(miRNA)調(diào)控、DNA甲基化及組蛋 白調(diào)控等。國(guó)內(nèi)在耳毒性藥物損傷聽(tīng)覺(jué)保護(hù)研究方面已經(jīng)取得了一定成果。薬樹(shù)生等研究 表明，TrkB受體激動(dòng)劑可W保護(hù)螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元抵抗慶大霉素?fù)p傷(Yu Q,化ang Q,Liu X,Wang Y,Li H,Gong S et al. Protection of spiral ganglion neurons from degeneration using small-molecule TrkB receptor agonists. The Journal of neuroscience，2013; 33:13042-13052.)。李華偉等研究表明，過(guò)表達(dá)XIAP能夠使耳蝸毛細(xì) 胞抵抗新霉素造成的耳毒性損傷（Sun S，Sun M，Zhang Y，Cheng C，Waqas M，化H，He Y，Xu B,Wang L,Wang J, Yin S,Chai R, Li H. In vivo overexpression of X-I inked inhibitor of apoptosis protein protects against neomycin-induced hair cell loss in the apical turn of the cochlea during the ototoxic-sensitive period.Frontiers in cellular neuroscience 2014,8:248.)。
[0004] 近年來(lái)，表觀遺傳學(xué)調(diào)控是分子生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，運(yùn)種調(diào)控反映了環(huán)境-基 因-表型的相互作用，對(duì)于維持細(xì)胞穩(wěn)定性具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳調(diào)控在生物 早期發(fā)育、胚胎干細(xì)胞分化、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。組蛋白去 乙酷化轉(zhuǎn)移酶抑制劑通過(guò)調(diào)節(jié)巧穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因、調(diào)亡基因及突觸相關(guān)基因的表達(dá)，減輕順 銷所致的小鼠聽(tīng)力損傷，保護(hù)內(nèi)耳毛細(xì)胞。在我們已有研究中，特異性抑制組蛋白甲基化轉(zhuǎn) 移酶G9a/化P能夠維持線粒體穩(wěn)定性，抑制Caspase-3等經(jīng)典細(xì)胞調(diào)亡通路，從而實(shí)現(xiàn)抑制 毛細(xì)胞調(diào)亡和毛細(xì)胞保護(hù)的作用。賴氨酸特異性去甲基化酶1 (lysine-spec if i C demethylasel，LSD1)是最早發(fā)現(xiàn)的組蛋白去甲基化酶，它通過(guò)與CoREST形成復(fù)合物，特異 性的作用于組蛋白冊(cè)K4產(chǎn)生去甲基作用。LSDl通過(guò)調(diào)節(jié)H3K4二甲基化水平在器官發(fā)育及細(xì) 胞存活等生命過(guò)程中發(fā)揮重要作用，抑制LSDl上調(diào)H3K4me2可W影響干細(xì)胞的定向分化和 腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與存活（肺yte WA,Bilodeau S,Orlando DA,Hoke HA,Frampton GM, Foster CT, Cowley SM, Young RA : Enhancer decommissioning by LSDl during embiyonic stem cell differentiation.Na1:ure 2012,482(7384):221-225.)。
[0005] 因此，仍需要能夠預(yù)防和治療耳聾、降低耳毒性、減少聽(tīng)力損傷、保護(hù)內(nèi)耳毛細(xì)胞 等方面的藥物化合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種如通式(I)所示的芳香環(huán)丙基胺類化合物及其藥 學(xué)上可接受的鹽：
[0007]
[000引 其中；
[0009]化、R2、R3和R4各自相同或不同地為氨、C1-C6烷基或面素；
[0010]優(yōu)選地，Ri、R2、R3和R4各自相同或不同地為氨或面素；
[00川更優(yōu)選地，Ri、R2、R3和R4各自相同或不同地為氨或氣；
[001^ 1?功直鏈或支鏈的Cl-I胞基、C3-1肺控基、C6-20芳基或芐基；
[001引優(yōu)選地，R日為直鏈或支鏈的打-婚基、C3-郝控基、C6-10芳基或芐基；
[0014] 更優(yōu)選地，Rs為直鏈或支鏈的Cl-6烷基、C3-7環(huán)烷基、C6-10芳基或芐基。
[0015] 術(shù)語(yǔ)"控基"是指烷基、締基或烘基，例如乂 1-6控基"意為具有1-6個(gè)碳原子的鏈控 基，例如甲基、乙基、-CH = C此、-C^CH、正丙基、異丙基、-CH = CH-C曲、-C此-CH = C此、正下 基、異下基、-CH=CH-C出-C出、-CH=CH-CH=C出、-C出-CH=CH-C出、仲下基、叔下基、正戊基、 正己基。
[0016] 所述面素指氣、氯、漠或艦，優(yōu)選氣、氯或漠，更優(yōu)選氣或氯。
[0017] 優(yōu)選地，所述芳香環(huán)丙基胺類化合物的藥學(xué)上可接受的鹽為所述芳香環(huán)丙基胺類 化合物的鹽酸鹽：
[001 引
[0019] 其中，虹、1?2、1?3、1?4和貼如上所定義和優(yōu)選。
[0020]更優(yōu)選地，所述芳香環(huán)丙基胺類化合物的藥學(xué)上可接受鹽為：
[002'
[0022] 對(duì)于所述芳香環(huán)丙基胺類化合物的藥學(xué)上可W接受的鹽，包括可藥用酸加成鹽， 其通過(guò)用無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸處理該化合物的游離堿，可W得到其藥學(xué)上可接受的鹽。所述的 無(wú)機(jī)酸為鹽酸、氨漠酸、憐酸或硫酸;所述的有機(jī)酸為抗壞血酸、煙酸、巧樣酸、酒石酸、乳 酸、馬來(lái)酸、丙二酸、富馬酸、乙醇酸、班巧酸，丙酸、乙酸、=氣醋酸或甲橫酸等。本發(fā)明的化 合物可W W未溶劑化的和與藥學(xué)上可接受的溶劑(例如水，乙醇等)溶劑化的形式存在。通 常，對(duì)于本發(fā)明的目的，認(rèn)為溶劑化的形式等同于未溶劑化的形式。
[0023] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種上述芳香環(huán)丙基胺類化合物或其藥學(xué)上可接受 的鹽的制備方法，該方法按如下反應(yīng)路線進(jìn)行，包括W下具體步驟：
[0024]
[002引其中，虹、1?2、1?3、1?4和化的定義如前所述，
[0026] 步驟a):在20~25°C的溫度下、在堿性條件下、在溶劑中將式I-I所示的取代的對(duì) 徑基苯甲醒和Rs化反應(yīng)16-18h得到式I -2化合物；
[0027] 其中，步驟a)中的所述堿性條件可W選擇碳酸鐘、碳酸鋼、叔下醇鐘、氨化鋼等，步 驟a)中的溶劑可W選擇DMF、DMSO、乙臘、二氧六環(huán)、THF等；
[0028] 其中，步驟a)中的所述溫度優(yōu)選為20°C，步驟a)中的所述溶劑優(yōu)選為DMF，步驟a) 中的反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為18小時(shí)；
[0029] 步驟b):在-15~-10°C的溫度下、在堿性條件下、在溶劑中將式1-2所示的化合物 和Witting試劑反應(yīng)30-60分鐘得到式1-3化合物；
[0030] 其中，步驟b)中的所述堿性條件可W選擇乙醇鋼、叔下醇鐘、氨化鋼、正下基裡等， 步驟b)中的溶劑可W選擇乙醇、DMF、DMSO、乙臘、THF等；
[0031] 步驟b)中的所述溫度優(yōu)選為-15°C，步驟b)中的所述溶劑優(yōu)選為THF，步驟b)中的
所述Wi tt ing試劑優(yōu)選為憐酸醋Wi tt ing試齊 步驟b)中的反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為30 分鐘；
[0032] 步驟C):在30~40°C的溫度下、在堿性條件下、在溶劑中將式1-3所示的化合物和 亞甲基轉(zhuǎn)移試劑反應(yīng)30-60分鐘得到式1-4化合物；
[0033] 其中，步驟C)中的所述堿性條件可W選擇叔下醇鐘、氨化鋼、正下基裡等，步驟C) 中的溶劑可W選擇DMF、DMSO、THF等；
[0034] 步驟C)中的所述溫度優(yōu)選為30°C，步驟C)中的所述溶劑優(yōu)選為DMS0,步驟C)中的 所述亞甲基轉(zhuǎn)移試劑優(yōu)選為=甲基硫化巧步驟C)中的反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為30分 鐘；
[0035] 步驟d):在40-45°C的溫度下、在堿性條件下、在溶劑中將式1-4所示的化合物反應(yīng) 3-4小時(shí)得到式1-5化合物；
[0036] 其中，步驟d)中的所述堿性條件可W選擇氨氧化裡、氨氧化鋼、氨氧化鐘、乙醇鋼 等，步驟d)中的溶劑可W選擇甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇等；
[0037] 步驟d)中的所述溫度優(yōu)選為40°C，步驟d)中的所述溶劑優(yōu)選為甲醇，步驟d)中的 所述堿性條件優(yōu)選為氨氧化鋼，步驟d)中的反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為3小時(shí)；
[0038] 步驟e):在85-90°C的溫度下、在堿性條件下、在溶劑中將式1-5所示的化合物和疊 氮化試劑反應(yīng)16-1化得到式1-6化合物；
[0039] 其中，步驟e)中的所述堿性條件可W選擇DIPEA、S乙胺、化晚等有機(jī)堿，步驟e)中 的溶劑可W選擇甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正下醇、叔下醇等；
[0040] 步驟e)中的所述溫度優(yōu)選為85 °C，步驟e)中的所述溶劑優(yōu)選為叔下醇，步驟e)中 的所述疊氮化試劑優(yōu)選為DPPA，步驟e)中的反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為16h;
[0041] 步驟f):在20-25°C的溫度下、在HX下、在溶劑中將式1-6所示的化合物反應(yīng)3-4h得 到式1-7化合物；
[0042] 其中，步驟f)中的所述HX可W選擇鹽酸、S氣醋酸等，步驟f)中的溶劑可W選擇乙 酸、乙酸乙醋、二氧六環(huán)等；
[0043] 步驟f)中的所述溫度優(yōu)選為20°C，步驟f)中的所述溶劑優(yōu)選為二氧六環(huán)，步驟f) 中的所述反應(yīng)試劑優(yōu)選為鹽酸，步驟f)中的反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為3h。
[0044] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述通式(I)所示化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽在制 備預(yù)防或治療與內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷相關(guān)的疾病的藥物中的用途；
[0045] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述通式(I)所示化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽在預(yù) 防或治療與內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷相關(guān)的疾病中的用途；
[0046] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種預(yù)防或治療與內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷相關(guān)的疾病的方 法，其特征在于，向受試者施用治療有效量的一種或多種上述通式(I)所示化合物及其藥學(xué) 上可接受的鹽；
[0047] 所述與內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷相關(guān)的疾病包括神經(jīng)性耳聾、混合性耳聾等；
[0048] 本發(fā)明的另一目的在于提供了一種藥物組合物，其含有治療有效量的選自上述通 式（I)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽中的一種或多種，W及含有一種或多種可藥用的載 體;該藥用組合物還可W進(jìn)一步包含氣味劑、香味劑等。
[0049] 本發(fā)明所述的藥物組合物優(yōu)選含有重量比為1~99%的活性成份，其優(yōu)選的比例 是，通式（I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性成分占總重量比65%~99%。
[0050] 本發(fā)明所述的化合物和藥物組合物可W是多種形式，如片劑、膠囊、粉劑、糖漿、溶 液狀、懸浮液和氣霧劑等，并可W存在于適宜的固體或液體的載體或稀釋液中和適宜的用 于注射或滴注的消毒器具中。
【附圖說(shuō)明】
[0051 ]圖1是斑馬魚(yú)側(cè)線系統(tǒng)模型的示意圖；
[0化2] 圖2是正常組、對(duì)照組、Al至A8化合物處理組的神經(jīng)丘免疫巧光情況；
[0化3] 圖3是正常組、對(duì)照組、Al至A8化合物處理組的肌球蛋白7a+細(xì)胞數(shù)的柱狀圖；
[0054] 圖4是反應(yīng)慶大霉素?fù)p傷致小鼠耳蝸組蛋白H3K4二甲基化表達(dá)下調(diào)的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0055] 通過(guò)下列實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。然而，應(yīng)了解本發(fā)明保護(hù)的范圍不限于 運(yùn)些實(shí)施例中的特定細(xì)節(jié)，因?yàn)殍b于本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容，其他變化對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 是已知和顯而易見(jiàn)的。
[0056] 本發(fā)明的具有通式（I)的化合物可通過(guò)下列合成途徑合成，該途徑包括類似于化 學(xué)領(lǐng)域中所熟知的方法，特別是根據(jù)本文說(shuō)明部分的方法。起始物質(zhì)一般可由商業(yè)來(lái)源，如 Aldrich化學(xué)公司（美國(guó)威斯康辛州密爾瓦基)取得，或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法 即可制備（如通過(guò)下列書(shū)籍中所概述的方法制備：Louis F.Fieser與Mary Fieser之"用于 有機(jī)合成作用之試劑"第1-19冊(cè)（美國(guó)紐約Wil巧公司1967-1999版本）；或"Beilsteins Han化Uch der organischen畑emie"Auf 1.版第4冊(cè)及包括附刊（德國(guó)柏林Springer- Verlag公司出版)及亦可經(jīng)由Beilstein線上資料庫(kù)取得）。
[0057] 除非另有說(shuō)明，在下述反應(yīng)路線中，所述的化合物的各符號(hào)具有相同的含義。為了 說(shuō)明的目的，下列所示的反應(yīng)路線提供用于合成本發(fā)明的化合物W及關(guān)鍵中間產(chǎn)物的可能 途徑。有關(guān)個(gè)別反應(yīng)步驟的更詳細(xì)的說(shuō)明，請(qǐng)見(jiàn)后述的實(shí)施例部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解 可使用其他合成途徑合成本發(fā)明的化合物。雖然在反應(yīng)路線中顯示及于后述部分論及特定 的起始物質(zhì)與試劑，但其可輕易地W其他起始物質(zhì)與試劑替代，從而提供多種衍生物和/或 適用其他反應(yīng)條件。此外，鑒于本公開(kāi)內(nèi)容，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)化學(xué)反 應(yīng)，而進(jìn)一步修飾通過(guò)本文的方法所制備的眾多化合物。
[0058] 提供W下實(shí)驗(yàn)例W進(jìn)一步闡明本發(fā)明。
[0059] 實(shí)驗(yàn)樣品分析所用儀器及試劑
[0060] 核磁共振譜由Vari an公司的Mercury-AOO型核磁共振儀測(cè)定。LC-MS由!"Iiermo Finnigan LCQDECAXP型質(zhì)譜儀測(cè)定。柱層析分離所用硅膠為青島海洋化工廠產(chǎn)品（200~ 300目）?；疌硅膠板為煙臺(tái)化工生產(chǎn)的HSF-254薄層層析預(yù)制板，采用紫外燈，艦缸顯色。紫 外燈為上海顧村電光儀器廠ZF-I型S用紫外分析儀。合成中所用原料為市售產(chǎn)品；或者通 過(guò)本領(lǐng)域已知的方法制備;或者根據(jù)本文所述方法制備。
[0061] 實(shí)施例1:2-(4-節(jié)氧基-3-氣苯基)環(huán)丙基胺鹽酸鹽(Al)的制備
[0062]
[0063] 步驟1:中間體A1-2的制備
[0064] 取250mlS 口瓶，控溫0~5°C，依次加入DMF，Al-I和K2CO3，再緩慢滴加化化，滴加完 畢，維持溫度20~25°C攬拌反應(yīng)16-1化，TLC檢測(cè)原料Al-I基本反應(yīng)完全(PE/EA= 10:1 ,Rf =0.4)。將反應(yīng)液傾倒入冰水中，攬拌5~IOmin。抽濾，濾餅用冰水淋洗，20~25 °C真空干 燥，得白色固體物16.3g，摩爾收率99%。所得粗品無(wú)需純化，直接投入下一步反應(yīng)。
[00化]步驟2:中間體A1-3的制備
[0066] 取250mlS 口瓶，控溫-5~0°C，依次加入干燥THF，t-BuOK;降溫至-15~-10°C滴加 TEPA，滴加完畢，維持溫度-15~-10°C攬拌反應(yīng)30min;再滴加 A1-2/THF溶液，滴加完畢，維 持溫度-15~-10°C攬拌反應(yīng)30min JLC檢測(cè)原料A1-2基本反應(yīng)完全(PE/EA= 10 :1 ,Rf = 0.45)。將反應(yīng)液傾倒入冰水中，用EA提取2次，合并有機(jī)相，飽和鹽水洗涂，無(wú)水硫酸儀干 燥，35°(：減壓濃縮溶劑，得油狀物粗品。柱層析純化。6/64=10:1)，得6.1邑白色固體物，摩 爾收率93 %。
[0067] HNMR
[006引 Al-3(400MHz ,CDCb):S(ppm) 1.312-1.347(t，J = 6.SHz，3H),4.226-4.280(9, J = 6.8Hz，2H)，5.175(s，2H)，6.266-6.306(d，J=16Hz，lH),6.961-7.450(m，8H),7.548-7.588 (d，J = 16Hz，lH)。
[0069] 步驟3:中間體Al-4的制備
[0070] 取50mlS 口瓶，控溫20~25°C，依次加入DMS0，Me3S(0)I，攬拌溶清；控溫20~25 。(：，分批加入化H，攬拌反應(yīng)至反應(yīng)液溶清約30min;控溫20~25°C，滴加 A1-3/DMS0溶液，滴 加完畢，維持溫度30~40°C攬拌反應(yīng)約30min，檢測(cè)原料A1-3基本反應(yīng)完全(PE/EA= 10: 1，Rf = 0.5)。將反應(yīng)液傾倒入冰水中，用EA提取2次，合并有機(jī)相，飽和鹽水洗涂，無(wú)水硫酸 儀干燥，35°C減壓濃縮溶劑，得油狀物粗品。柱層析純化(PE/EA=10:1)，得0.86g白色固體 物，摩爾收率40 %。
[0071] HNMR
[0072] Al-4(400MHz, CDCb): 5 (ppm) 1.202-1.239(m,lH),l. 260-1.296(t, J = 7.2Hz, 3H)，I. 547-1.582(m, IH)，1.802-1.823(m, IH)，2.4:34-2.457(m，lH), 4.137-4.191(9, J = 7.2Hz，2H)，5.112(s，2H)，6.778-6.915(m，3H)，7.317-7.433(5H)。
[0073] 步驟4:中間體Al-5的制備
[0074] 取50mlS 口瓶，控溫20~25°C，依次加入MeOH，Al-4，攬拌溶清;控溫20~25°C，滴 加化OH水溶液，滴加完畢，維持溫度40~45°C攬拌反應(yīng)約化，TLC檢測(cè)原料A1-4基本反應(yīng)完 全。6/64 = 5:1，1?' = 0.1)。35°(：減壓濃縮溶劑至干，得白色固體殘余物；向殘余物中加入 水，用2N HCl調(diào)PH = 3~4，用EA提取2次，飽和鹽水洗涂，無(wú)水硫酸儀干燥，35 °C減壓濃縮溶 劑，得白色固體粗品，所得粗品無(wú)需純化，直接投入下一步反應(yīng)。
[0075] 步驟5:中間體A1-6的制備
[0076] 取50mlS 口瓶，控溫20~25 °C，依次加入t-BuOH，A1-5，攬拌溶清；再加入DPPA， TEA?？販?5~90°C，回流反應(yīng)16~1她，IlX檢測(cè)原料A1-5基本反應(yīng)完全(PE/EA = 5:1 ,Rf = 0.45)。45°(：減壓濃縮溶劑至干，再加入EA溶解，有機(jī)相依次用5%巧樣酸水溶液洗涂，飽和 鹽水洗涂，飽和化HC化溶液洗涂，飽和鹽水洗涂，無(wú)水硫酸儀干燥，35 °C減壓濃縮溶劑，得白 色固體粗品。柱層析純化(PE/EA = 15~10:1)，得0.25g白色固體物，摩爾收率40.3%。
[0077] HNMR
[007引 Al-6(400MHz，CDCl3): S(ppm)1.057-1.091(m，lH)，l.245-1.270(m，lH)，1.435(s, 9H),1.962-1.981(m,lH),2.620(br,lH),4.784(br,lH),5.086(s,2H),6.845-6.887(m, 3H)，7.245-7.397(m，5H)。
[0079] 步驟6:化合物Al的制備
[0080] 取50ml = 口瓶，控溫20~25°C，依次加入Al-6，鹽酸二氧六環(huán)溶液，攬拌溶清;控溫 20~25 °C，攬拌反應(yīng)化。TLC檢測(cè)原料A1-5基本反應(yīng)完全。45 °C減壓濃縮溶劑至干，得白色殘 余物，再加入丙酬，控溫20~25°C，攬拌反應(yīng)30min。抽濾，濾餅丙酬淋洗，20~25°C真空干燥 得產(chǎn)品105mg，摩爾收率56%。
[0081 ] HNMR/LCMS
[0082] H003-A1(400MHz,CDsOD):5(ppm)I.261-1.297I.392-1.402 2.330-2.356(m,IH)，2.770-2.789(m,IH)，5.I14(s，2H),6.890-7.079(m，3H),7.297-7.425 (111，5扣丄〔15[]\1+扣：98.8%，258。
[00831 出施徹19.9-M-巧氧甚-S-值黑Sn抹巧基胺鹽酸鹽(A2)的制備 [008
[008 ;實(shí)施例1中描述的相同的方法制備化合物 A20
[008 (m,1H),1.350-1.390(m,1H),2.306-2.331 (m,] 74-7.066(m，3H)，8.603(br，3H)丄CMS[M+ 扣：t
[008 基胺鹽酸鹽(A3)的制備
[008
[008 ;實(shí)施例1中描述的相同的方法制備化合物 A3 O
[009 83-1.3031.383-1.418(m,4H), 2.3^ -4.113(q J = 6.細(xì)z，2H)，6.921-7.041(m, 3H).
[009 巧基胺鹽酸鹽(A4)的制備
[009
[0093] 除了使用2-漠丙烷代替化化W外，按照與實(shí)施例1中描述的相同的方法制備化合 物A4。
[0094] 朋03-A4(400MHz,DMSO):S(PPm)1.121-1.155(m，1H)，1.208-1.223(d,J =細(xì)Z， 6H)，1.332-1.356(m，lH),2.280-2.285(m，lH),2.693-2.713(m，1H),4.503-4.5：M(m，2H)， 6.891-7.060(m，3H)，8.558(br，3H)丄CMS[M+扣：99.3%，210.
[OOM]實(shí)施例5:2-(4-丙氧基-3-氣苯基)環(huán)丙基胺鹽酸鹽(A5)的制備
[0096]
[0097] 除了使用漠丙烷代替化化W外，按照與實(shí)施例1中描述的相同的方法制備化合物 ASo
[009引 HNMR/MS
[0099] A5(400MHz，DMS0):S(wm)0.94~0.97(t，J = 6.4Hz，3H)，1.13~1.17(t，J = 6.4Hz，lH) ,1.:34~1.37(m，lH),
[0100] 1.68~1.74(m，2H)，2.28~2.32(m，lH)，2.72~2.76(m，lH)，3.94~3.97(m，2H), 6.93~7.08(m，3H)，8.51(s，3H).MS[]\Wl]:210.
[0101] 實(shí)施例6:2-(4-異下氧基-3-氣苯基)環(huán)丙基胺鹽酸鹽(A6)的制備
[0102]
[0103] 除了使用異下基漠代替化化W外，按照與實(shí)施例1中描述的相同的方法制備化合 物A6。
[0104] A6(400MHz，DMS0):S(卵m)0.95~0.97(d，J = 6.細(xì)z，細(xì)），1.13~1.18(m，lH)，1.35 ~1.36(m，lH)，1.98~2.02(m，lH)，2.28~2.32(m，lH)，2.73~2.75(t，J = 4.4Hz，lH)，3.77 ~3.78(d，6.4Hz，2H)，6.93~7.08(m，3H)，8.55(s，3H)，MS[]\Wl]:224。
[0105] 實(shí)施例7:2-(4-正下氧基-3-氣苯基)環(huán)丙基胺鹽酸鹽(A7)的制備
[010<
[0107]除了使用正下基漠代替化化W外，按照與實(shí)施例1中描述的相同的方法制備化合 物A7。
[010 引 A7(400MHz，DMS0):S(wm)0.90~0.94(m，3H)，1.07~1.18(m，lH)，1.35~1.45(m, 3H)，1.65~1.70(m，2H)，2.28~2.29(m，lH)，2.72~2.75(m，lH)，3.99~4.02(m，2H)，6.93 ~7.09(m，3H)，8.46~8.50(m，3H)eMS[M+W:224。
[0109] 實(shí)施例8:2-(4-正己氧基-3-氣苯基)環(huán)丙基胺鹽酸鹽(AS)的制備
[0110；
[0111] 除了使用正己基漠代替化化W外，按照與實(shí)施例1中描述的相同的方法制備化合 物A8。
[0112] A8(400MHz，CD3〇D):(wm)0.91~0.93(m，3H)，1.26~1.35(m，W)，1.44~1.48(m, 2H)，1.73~1.78(m，2H)，2.29~2.33(m，lH)，2.78~2.79(m，lH)，3.99~4.02(t，J = 6.4Hz， 2H)，6.92~7.03(m，3H)eMS[M+W:252。
[0113] 生物活性測(cè)試實(shí)施例
[0114] 1)斑馬魚(yú)側(cè)線系統(tǒng)模型的建立
[0115] 如圖1所示，建立了斑馬魚(yú)側(cè)線系統(tǒng)模型其中顯示了化n3c :mGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的 側(cè)線神經(jīng)系統(tǒng)毛細(xì)胞表達(dá)綠色巧光蛋白。
[0116] 具體而言，圖1顯示了5dpf化n3c:GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)側(cè)線器及神經(jīng)丘的整體觀，其 中箭頭代表初級(jí)側(cè)線系統(tǒng)神經(jīng)丘L1-L5和尾部神經(jīng)丘T1-T3,星號(hào)代表次級(jí)側(cè)線系統(tǒng)神經(jīng) 丘D
[0117] 2)芳香環(huán)丙基胺類化合物對(duì)斑馬魚(yú)側(cè)線系統(tǒng)毛細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
[0118] 通過(guò)上述斑馬魚(yú)側(cè)線系統(tǒng)模型，發(fā)明人將毛細(xì)胞分為八組，正常組W斑馬魚(yú)飼養(yǎng) 水培養(yǎng)，對(duì)照組W暴露于含400測(cè)新霉素的斑馬魚(yú)飼養(yǎng)水中1小時(shí)，去除新霉素后，巧光顯微 鏡觀察斑馬魚(yú)側(cè)線系統(tǒng)毛細(xì)胞損傷情況。A1-A8組W本發(fā)明相應(yīng)的化合物A1-A8+含400測(cè)新 霉素的斑馬魚(yú)飼養(yǎng)水中培養(yǎng)，W檢查經(jīng)本申請(qǐng)化合物A1-A8處理后的毛細(xì)胞存活數(shù)。
[0119] 其結(jié)果顯示于圖巧日?qǐng)D3中。在圖2中，第一列為化n3c:mGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)側(cè)線器神 經(jīng)丘自帶GFP綠色巧光，其表明斑馬魚(yú)毛細(xì)胞存活狀態(tài)；第二列為毛細(xì)胞標(biāo)志物肌球蛋白 7a，其代表毛細(xì)胞存活率;第S列為DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核，其代表毛細(xì)胞細(xì)胞核;第四列為第 一、=列合并的圖示，其代表斑馬魚(yú)毛細(xì)胞自帶巧光與毛細(xì)胞特異性標(biāo)志物的共標(biāo)結(jié)果，驗(yàn) 證其存活率。
[0120] 在圖2中，從第一列圖像可W看出，所有經(jīng)本申請(qǐng)化合物A1-A8處理的斑馬魚(yú)均表 現(xiàn)有巧光，表明所有化合物均具有抗毛細(xì)胞損傷的保護(hù)作用;此外，A1-A8組巧光強(qiáng)于對(duì)照 組，表明所有化合物抗毛細(xì)胞損傷的保護(hù)作用高于參考物；同樣，在第二列圖像中，經(jīng)本申 請(qǐng)化合物處理組的毛細(xì)胞標(biāo)志物肌球蛋白7a顯著高于對(duì)照組，與正常組相當(dāng)，由此可W看 出本申請(qǐng)的化合物能夠有效抑制毛細(xì)胞死亡;在第四列圖像中，經(jīng)本申請(qǐng)化合物A1-A8處理 毛細(xì)胞存活率表明能夠有效抑制毛細(xì)胞死亡，且好于對(duì)照組。
[0121] 圖3是圖2中的毛細(xì)胞計(jì)數(shù)的柱狀圖，由圖3可W看出，經(jīng)本申請(qǐng)化合物處理組的毛 細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于對(duì)照組，特別是其中A1、A3、A6和A8的技術(shù)均達(dá)到對(duì)照組兩倍W上。
[0122] 通過(guò)上述的斑馬魚(yú)平臺(tái)篩選，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，芳香環(huán)丙基胺類化合物A3，A6，A8能夠 有效的抑制毛細(xì)胞死亡，達(dá)到斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞保護(hù)的目的，運(yùn)種差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義。計(jì)數(shù)結(jié)果顯示新型化合物處理后毛細(xì)胞殘留數(shù)均高于對(duì)照組。
[0123] 3)組蛋白冊(cè)K4me2在毛細(xì)胞損傷過(guò)程中表達(dá)下調(diào)
[0124] Wlmmol慶大霉素處理小鼠耳蝸基底膜，然后用Leica sp5激光共聚焦顯微鏡觀測(cè) 其巧光強(qiáng)度。結(jié)果參見(jiàn)圖4。圖4中，第1列表示肌球蛋白7a標(biāo)記的毛細(xì)胞，第2列表示二甲基 化的H3K4組蛋白，第3列表示DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核，第4列是前3列圖像組合的結(jié)果。其中A-C (即第1-3行)分別表示損傷0分鐘、2小時(shí)和4小時(shí)之后的二甲基化的組蛋白H3K4的免疫巧光 強(qiáng)度變化。從第2列的對(duì)比可W看出，由慶大霉素處理毛細(xì)胞過(guò)程中，二甲基化的H3K4組蛋 白的巧光強(qiáng)度明顯降低。從3行可W看出，慶大霉素處理的毛細(xì)胞形態(tài)受到損傷。結(jié)果可W 得出，毛細(xì)胞損傷可能與H3K4的二甲基化下調(diào)相關(guān);本申請(qǐng)化合物A1-A8作用機(jī)制可能在于 特異性的作用于LSDl，通過(guò)調(diào)節(jié)組蛋白H3K4發(fā)揮作用。
[01巧]D:對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組冊(cè)K4me2表達(dá)的Western blotting結(jié)果。
[01%] E:對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組冊(cè)K4me2表達(dá)的Western blotting灰度分析結(jié)果。
[0127] 用Bio-Rad蛋白質(zhì)印記裝置進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示正常組（即圖中nor 組)耳蝸組蛋白冊(cè)K4me2(l化化)有一定強(qiáng)度表達(dá)；Immol慶大霉素?fù)p傷4h后（即圖中crl 4h 組)耳蝸毛細(xì)胞冊(cè)K4me2表達(dá)強(qiáng)度明顯下調(diào)。E:用image J軟件進(jìn)行灰度分析，繪制柱狀圖結(jié) 果發(fā)現(xiàn)，慶大霉素?fù)p傷組組蛋白H3K4me2(l化化)表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱，與正常組相比差異具 有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<〇.05)。
[0128] 上述例子僅作為說(shuō)明的目的，本發(fā)明的范圍并不受此限制。對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員 來(lái)說(shuō)進(jìn)行修改是顯而易見(jiàn)的，本發(fā)明W所附權(quán)利要求保護(hù)的范圍為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種如通式(I)所示的芳香環(huán)丙基胺類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽：其中： Ri、R2、R3和R4各自相同或不同地為氫、C1-C6烷基或鹵素； Rs為直鏈或支鏈的&-1()烴基、C3-1Q環(huán)烴基、C 6-2Q芳基或芐基。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的芳香環(huán)丙基胺類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽， 其中，所述Rl、R2、R3和R4各自相同或不同地為氫或鹵素； 所述R5為直鏈或支鏈的&-6烴基、C3-7環(huán)烴基、C6-1Q芳基或芐基。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的芳香環(huán)丙基胺類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽， 其中，所述Ri、R2、R3和R4各自相同或不同地為氫或氟； 所述R5為直鏈或支鏈的&-6烷基、C3-7環(huán)烷基、C6-1Q芳基或芐基。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的芳香環(huán)丙基胺類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽，其中，所述芳 香環(huán)丙基胺類化合物的藥學(xué)上可接受的鹽為：5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的芳香環(huán)丙基胺類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽， 其中，所述芳香環(huán)丙基胺類化合物的藥學(xué)上可以接受的鹽，包括可藥用酸加成鹽，其通 過(guò)用無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸處理該化合物的游離堿而得到的藥學(xué)上可接受的鹽， 所述的無(wú)機(jī)酸為鹽酸、氫溴酸、磷酸或硫酸;所述的有機(jī)酸為抗壞血酸、煙酸、檸檬酸、 酒石酸、乳酸、馬來(lái)酸、丙二酸、富馬酸、乙醇酸、琥珀酸、丙酸、乙酸、三氟醋酸或甲磺酸。6. -種芳香環(huán)丙基胺類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽的制備方法，該方法包括以下步 驟：其中，Ri、R2、R3、R4和Rs的定義如權(quán)利要求1中所述， 步驟a):在20~25°C的溫度下、在堿性條件下、在溶劑中將式1-1所示的取代的對(duì)羥基 苯甲醛和RsBr反應(yīng)16-18h得到式I -2化合物； 其中，步驟a)中的所述堿性條件為碳酸鉀、碳酸鈉、叔丁醇鉀或氫化鈉，步驟a)中的溶 劑為DMF、DMSO、乙腈、二氧六環(huán)或THF; 步驟b):在-15~-10°C的溫度下、在堿性條件下、在溶劑中將式1-2所示的化合物和 Witting試劑反應(yīng)30-60分鐘得到式1-3化合物； 其中，步驟b)中的所述堿性條件為乙醇鈉、叔丁醇鉀、氫化鈉或正丁基鋰，步驟b)中的 溶劑為乙醇、DMF、DMSO、乙腈或THF; 步驟c):在30~40°C的溫度下、在堿性條件下、在溶劑中將式1-3所示的化合物和亞甲 基轉(zhuǎn)移試劑反應(yīng)30-60分鐘得到式1-4化合物； 其中，步驟c)中的所述堿性條件為叔丁醇鉀、氫化鈉或正丁基鋰，步驟c)中的溶劑為 DMF、DMSO或THF; 步驟d):在40-45Γ的溫度下、在堿性條件下、在溶劑中將式1-4所示的化合物反應(yīng)3-4 小時(shí)得到式1-5化合物； 其中，步驟d)中的所述堿性條件為氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀或乙醇鈉，步驟d)中 的溶劑為甲醇、乙醇、正丙醇或異丙醇； 步驟e):在85-90°C的溫度下、在堿性條件下、在溶劑中將式1-5所示的化合物和疊氮化 試劑反應(yīng)16-18h得到式1-6化合物； 其中，步驟e)中的所述堿性條件為DIPEA、三乙胺或吡啶，步驟e)中的溶劑為甲醇、乙 醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇或叔丁醇； 步驟f):在20-25°C的溫度下、在HX的存在下、在溶劑中將式1-6所示的化合物反應(yīng)3-4h 得到式1-7化合物； 其中，步驟f)中的所述HX為鹽酸或三氟醋酸，步驟f)中的溶劑為乙醚、乙酸乙酯或二氧 六環(huán)。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法， 其中，步驟a)中的所述溫度為20 °C，步驟a)中的所述溶劑為DMF，步驟a)中的反應(yīng)時(shí)間 為18小時(shí)； 步驟b)中的所述溫度為-15°C，步驟b)中的所述溶劑為THF，步驟b)中的所述Witting試劑為磷酸酯Witting試劑 步驟b)中的反應(yīng)時(shí)間為30分鐘； ， 步驟c)中的所述溫度為30°C，步驟c)中的所述溶劑為DMSO，步驟c)中的所述亞甲基轉(zhuǎn) 移試劑為三甲基硫化碘步驟c)中的反應(yīng)時(shí)間為30分鐘； 步驟d)中的所述溫度為40°C，步驟d)中的所述溶劑為甲醇，步驟d)中的所述堿性條件 為氫氧化鈉，步驟d)中的反應(yīng)時(shí)間為3小時(shí)； 步驟e)中的所述溫度為85°C，步驟e)中的所述溶劑為叔丁醇，步驟e)中的所述疊氮化 試劑為DPPA，步驟e)中的反應(yīng)時(shí)間為16h; 步驟f)中的所述溫度為20°C，步驟f)中的所述溶劑為二氧六環(huán)，步驟f)中的所述HX為 鹽酸，步驟f)中的反應(yīng)時(shí)間為3h。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的芳香環(huán)丙基胺類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備預(yù)防或 治療與內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷相關(guān)的疾病的藥物中的用途。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其中，所述與內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷相關(guān)的疾病為神經(jīng)性耳聾 或混合性耳聾。10. -種藥物組合物，其含有治療有效量的選自根據(jù)權(quán)利要求1所述的芳香環(huán)丙基胺類 化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽中的一種或多種，以及含有一種或多種可藥用的載體。
【文檔編號(hào)】C07C213/08GK105924362SQ201610082466
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年2月5日
【發(fā)明人】崔英杰, 孔令富, 唐方強(qiáng), 馮虓, 李華偉, 黎奧, 何英姿
【申請(qǐng)人】上海龍翔生物醫(yī)藥開(kāi)發(fā)有限公司, 復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院