一種鏈霉菌藥物高效生物合成的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鏈霉菌藥物高效生物合成的構(gòu)建方法，具體 涉及鏈霉菌梯度誘導(dǎo)表達(dá)體系的建立，揭示鏈霉菌藥物生物合成途徑中的限速反應(yīng)及其限 速酶的適配性，改善鏈霉菌藥物生物合成效率，以提高藥物的產(chǎn)量，屬于工業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 納他霉素（Natamycin)，也稱匹馬菌素（Pimaricin)，游霉素，是一種多烯大環(huán) 內(nèi)酯類抗生素。納他霉素主要由恰塔努加鏈霉菌5： cAgiiafloogeftsis、納塔爾鏈霉菌5： 褐黃孢鏈霉菌51 和利迪鏈霉菌51 Xn/iciA?等鏈霉菌產(chǎn)生。納 他霉素的分子式為C33H47O13，分子量665. 53,其具有26個(gè)碳原子的內(nèi)酯環(huán)，內(nèi)含4個(gè)共輒雙 鍵的多烯發(fā)色團(tuán)，在C4, 5位置有個(gè)環(huán)氧基團(tuán)，C12位有個(gè)環(huán)外羧基，C15位有個(gè)海藻氨基糖， 納他霉素結(jié)構(gòu)式如下：
[0003] 納他霉素是一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類廣譜抗真菌劑，能有效抑制和殺死霉菌、酵母、絲 狀真菌。由于其高效、廣譜、難溶于水和油脂、安全等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于食品防腐劑和藥物。美 國(guó)FDA (Food and Frug Administrition)已經(jīng)批準(zhǔn)納他霉素用作食品防腐劑。1997年，我 國(guó)食品添加劑委員會(huì)對(duì)納他霉素進(jìn)行評(píng)價(jià)并建議批準(zhǔn)使用。納他霉素還作為高效抗菌劑應(yīng) 用于滴眼液或軟膏等藥物中，用來治療真菌性角膜炎、腳蘚等真菌性皮膚感染疾病。
[0004] 微生物來源的天然產(chǎn)物通常屬于次級(jí)代謝產(chǎn)物，其生物合成過程受到生物體的嚴(yán) 密控制。微生物本身的生物經(jīng)濟(jì)學(xué)原理總是限制每種次級(jí)代謝產(chǎn)物的過度合成，特別是野 生菌的PKS途徑自然設(shè)立了許多限速步驟，其發(fā)酵產(chǎn)量往往較低，難以直接投入工業(yè)生產(chǎn)。 微生物來源的天然產(chǎn)物市場(chǎng)需求增大，高產(chǎn)菌株改造工作意義重大。隨著代謝調(diào)控機(jī)制研 究的逐步深入和DNA重組技術(shù)的發(fā)展，基于理性遺傳改造代謝途徑的代謝工程方法成為一 種替代策略。目前代謝工程改造策略主要有改造途徑特異性調(diào)控基因、高表達(dá)限速酶基因、 高表達(dá)自身抗性基因、增加目標(biāo)基因簇的拷貝數(shù)、敲除競(jìng)爭(zhēng)基因簇、異源表達(dá)靶基因簇等。 對(duì)于高表達(dá)限速酶基因這一策略，揭示合成途徑限速步反應(yīng)，改造關(guān)鍵合成元件的適配性， 是建立高效生物合成途徑的關(guān)鍵。揭示合成途徑限速步反應(yīng)經(jīng)常需要多個(gè)可獨(dú)立誘導(dǎo)的啟 動(dòng)子來控制不同基因的表達(dá)水平。迄今為止，許多誘導(dǎo)型啟動(dòng)子應(yīng)用于大腸桿菌等細(xì)菌。而 鏈霉菌中可用的誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子卻很少，尤其是能夠低表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子更少。為解決 這一問題，本發(fā)明基于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子啟動(dòng)子er??/，在沒有誘導(dǎo)劑IPTG的條件 下，的表達(dá)受到LacI蛋白的阻遏；當(dāng)加入誘導(dǎo)劑IPTG時(shí)，LacI對(duì)職7J且遏得到解 除。構(gòu)建了一系列誘導(dǎo)型質(zhì)粒，通過分析靶基因的表達(dá)量對(duì)藥物產(chǎn)量的影響，從而揭示藥物 生物合成途徑中的限速步反應(yīng)及其限速酶的適配性，構(gòu)建鏈霉菌藥物高效生物合成途徑， 以提高藥物產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供鏈霉菌梯度誘導(dǎo)表達(dá)體系的構(gòu)建方法，利用該體系分析藥物 生物合成途徑中的限速步反應(yīng)及其限速酶的適配性，從而理性優(yōu)化藥物的生物合成，為鏈 霉菌藥物高效生物合成提供一種新方法。
[0006] 本發(fā)明基于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組成型強(qiáng)啟動(dòng)子，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 編碼基因￡^印為報(bào)告基因，IPTG為誘導(dǎo)劑，在鏈霉菌中首次成功建立了梯度誘導(dǎo)表達(dá)體 系。同時(shí)利用該體系，在鏈霉菌靶基因缺失菌株中偶聯(lián)分析了靶基因表達(dá)量對(duì)靶藥物生物 合成產(chǎn)量的影響，揭示了藥物生物合成途徑中的限速反應(yīng)及其限速酶的適配性。最后，通過 在鏈霉菌中組成型串聯(lián)高表達(dá)相關(guān)限速酶編碼基因，構(gòu)建了藥物高效生物合成菌株。
[0007] 本發(fā)明通過以下步驟實(shí)現(xiàn)： (1)將報(bào)告基因6^//汾別置于強(qiáng)啟動(dòng)子和由阻遏蛋白控制的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子后，構(gòu)建 梯度誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒，通過結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)整合至宿主鏈霉菌恰塔努加鏈霉菌LlO基因組中。所述 恰塔努加鏈霉菌LlO由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，分類命名： 恰塔努加鏈霉菌保藏號(hào)：CGMCC No. 2644,保藏日期： 2008年8月27日，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0008] (2)無菌條件下，將恰塔努加鏈霉菌LlO的突變菌株接種于斜面培養(yǎng)基中，置于 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，所述斜面培養(yǎng)基為：酵母提取物4. Og/L，麥芽提取物10.0 g/L，葡萄糖 4.0 g/L，瓊脂糖15.0-20.0 g/L，其余為水，pH值調(diào)至6.0。
[0009] (3)斜面培養(yǎng)后，將培養(yǎng)好的孢子塊接入盛有搖瓶種子培養(yǎng)基的三角瓶中，搖床 培養(yǎng)18-22小時(shí)，所述種子培養(yǎng)基為：葡萄糖17. 5g/L，蛋白胨15 g/L，NaCl 10 g/L，其余 為水，pH自然。
[0010] ⑷將步驟⑶所得的種子液轉(zhuǎn)接至4%YEME培養(yǎng)基中，對(duì)于誘導(dǎo)型突變株，12小 時(shí)后加入誘導(dǎo)劑，繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)至48小時(shí)。所述4%YEME培養(yǎng)基為酵母提取物3. Og/L，麥芽 提取物3.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，葡萄糖40 g/L，其余為水，pH自然。
[0011] (5)吸取適量步驟（4)所得的鏈霉菌菌液，離心收集菌體，采用PBS緩沖液清洗菌 體一次。加入適量的蛋白裂解緩沖液[!^8!1(：1501111(?!18.0)，恥(：1150111140了4 51111， Glycerol 5%，Triton X-100 1%]和蛋白水解酶抑制劑PMSF，超聲破碎細(xì)胞。4。C、12000 r/min 離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至新的1.5 ml離心管中；對(duì)蛋白進(jìn)行定量后，取適量蛋白樣品分別 進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)。與此同時(shí)，取少量液體培養(yǎng)的鏈霉菌菌液，通過 激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光強(qiáng)度。
[0012] (6)分析不同誘導(dǎo)條件下和不同啟動(dòng)子活性下eGFP的表達(dá)變化曲線，初步建立 鏈霉菌梯度誘導(dǎo)表達(dá)體系。
[0013] (7)將四個(gè)限速酶編碼基因 scM；此/?/、sci (SEQ ID NO :5-8)分別置 于強(qiáng)啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子后，構(gòu)建梯度誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒，分別通過結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)入對(duì)應(yīng)的靶 基因缺失菌株中，構(gòu)建突變菌株。
[0014] (8)偶聯(lián)分析目的藥物和靶基因的表達(dá)量的對(duì)應(yīng)關(guān)系，揭示納他霉素合成途徑中 的限速反應(yīng)及其限速酶的適配性。
[0015] (9)將限速酶基因分別置于強(qiáng)啟動(dòng)子后，構(gòu)建質(zhì)粒，通過結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)入恰塔努加 鏈霉菌LlO中，獲得恰塔努加鏈霉菌L12。所述恰塔努加鏈霉菌株L12 cAgiiafloogeftsis)已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏號(hào)： CGMCC No. 10157,分類命名：恰塔努加鏈霉菌，保藏日期：2014年12月11日，保藏地址：北 京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0016] (10)將恰塔努加鏈霉菌L12接種于種子培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)18-22小時(shí)后轉(zhuǎn)接入 新鮮的種子培養(yǎng)基中，形成二級(jí)種子液；其中的種子培養(yǎng)基同步驟（3)。
[0017] (11)將步驟（10)中的二級(jí)種子液轉(zhuǎn)接至50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)基[大豆蛋白粉20 g/ L，酵母粉8 g/L，葡萄糖40 g/L，其余為水，pH自然]中，控制發(fā)酵罐溫度30° C，溶氧40%， 在不同的發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)取樣。
[0018] (12)使用甲醇浸提發(fā)酵培養(yǎng)液中的納他霉素，通過高效液相色譜檢測(cè)其產(chǎn)量。
[0019] 步驟（1)誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子為，具有SEQ ID NO :1的核苷酸序列；強(qiáng)啟動(dòng)子為 組成型啟動(dòng)子eiTf/，具有SEQ ID N0:2的核苷酸序列；報(bào)告基因￡^印具有SEQ ID N0:3 的核苷酸序列。
[0020] 步驟（1)阻遏蛋白的編碼基因及其啟動(dòng)子為/5Je扮7-Jac/，具有SEQ ID NO :4的 核苷酸序列。
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