一種利用谷氨酸棒桿菌和鈍齒棒桿菌提高精氨酸產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用微生物提高精氨酸產(chǎn)量的方法，尤其涉及一種利用谷氨酸棒 桿菌和鈍齒棒桿菌提高精氨酸產(chǎn)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] L-精氨酸是一種含有胍基的堿性氨基酸，在哺乳動(dòng)物中是半必需或條件性必需氨 基酸。近年來研究顯示，L-Arg能促進(jìn)各種免疫分子的合成從而可抑制癌細(xì)胞的生長，促進(jìn) 尿液循環(huán)并降低血液中氨的含量，同時(shí)作為生成NO的前體代謝產(chǎn)物，L-Arg還具備放松和 擴(kuò)張血管等重要功能。因此，L-Arg在醫(yī)藥和食品方面有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，備受國內(nèi)外研發(fā) 和生產(chǎn)機(jī)構(gòu)的關(guān)注。目前，全世界L-Arg年需求量在15000噸以上，而實(shí)際年產(chǎn)量卻不到 8000噸，生產(chǎn)商主要集中在日本、美國和歐洲等國家，L-Arg在我國還主要依賴進(jìn)口，是藥 用氨基酸生產(chǎn)的瓶頸，每年在進(jìn)口 L-Arg這一個(gè)產(chǎn)品上的費(fèi)用達(dá)4到5億元人民幣，所以加 強(qiáng)L-Arg的生產(chǎn)研究是很有現(xiàn)實(shí)意義的。
[0003] 目前L-精氨酸發(fā)酵工程菌株主要集中于棒桿菌屬，特別是C. glutamicum和與 其DNA序列極其類似的C. crenatumo國內(nèi)外有關(guān)提高精氨酸產(chǎn)量的研究已有很多報(bào)道， 對(duì)其生產(chǎn)菌分子育種策略主要是對(duì)其合成途徑的疏通、截流、增流等方法。如，Ikeda等 通過解除反饋?zhàn)瓒艉头答佉种频姆椒▽?duì)傳統(tǒng)的精氨酸產(chǎn)生菌種C. glutamicum A-27、 C. glutamicum I_30、C. glutamicum D-77與野生型C. glutamicum的精氨酸操縱子進(jìn)行測(cè)序 比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)這三株菌中分別存在argB26、argB31和argR123等點(diǎn)突變。為探究該突變對(duì) C. glutamincum發(fā)酵產(chǎn)精氨酸的影響，Ikeda等以不產(chǎn)精氨酸的野生型C. glutamicum為親 本，對(duì)其argB的26和31位點(diǎn)分別或組合突變并與argR的致死突變結(jié)合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)argB26、 argB31兩個(gè)位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變且負(fù)調(diào)控蛋白ArgR缺失時(shí)，其精氨酸產(chǎn)量發(fā)生了零的突破，達(dá) 到8. 76g/L。Xu等通過PCR方法獲得了與精氨酸合成相關(guān)的基因簇argCJBDF-argGH，并將 其克隆至穿梭表達(dá)質(zhì)粒PJC1，再導(dǎo)入C. crenatum SYPA5-5,利用該基因簇自身的啟動(dòng)子實(shí) 現(xiàn)了 arRCJBDF-argGH在C. crenatum SYPA 5_5體內(nèi)表達(dá)上調(diào)，其產(chǎn)精氨酸能力較親本提高 了 24.9%。三羧酸循環(huán)代謝支路生成的谷氨酸不僅是精氨酸合成的前體，而且還是脯氨酸 合成的前體，脯氨酸與精氨酸的合成形成競爭關(guān)系。因此，切斷脯氨酸合成支路有利于細(xì)菌 體內(nèi)代謝流向精氨酸合成方向。李小曼等運(yùn)用同源重組技術(shù)構(gòu)建了一株缺失了 γ-谷氨酰 激酶編碼基因（proB)的工程菌C. crenatum 8-193,該菌種體內(nèi)γ-谷氨酰激酶活性嚴(yán)重下 降，精氨酸產(chǎn)量卻能達(dá)到13. 78g/L，較出發(fā)菌株提高了 13. 6%。
[0004] 但目前未見敲除dtsRl基因、在對(duì)數(shù)生長初期添加吐溫40或吐溫80及在發(fā)酵培 養(yǎng)基中添加吐溫80或油酸或二者混合物以提高精氨酸產(chǎn)量的報(bào)道。精氨酸的前體物質(zhì)是 谷氨酸，而谷氨酸的前體物質(zhì)是三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物α-酮戊二酸，α -酮戊二酸可 在 α -酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物（oxoglutarate dehydrogenase complex，0DHC)進(jìn)一步循 環(huán)為琥泊酰輔酶A，而ODHC的編碼基因 sucB、odhA和IpdA受dtsRl基因的正調(diào)控。當(dāng)敲 除dtsRl基因，sucB、odhA和IpdA基因的轉(zhuǎn)錄水平大幅下降，這有利于α -酮戊二酸流向 谷氨酸并進(jìn)一步流向精氨酸；同時(shí)，發(fā)現(xiàn)添加 Tween 40不僅有利于降低sucB、odhA和IpdA 基因的轉(zhuǎn)錄水平，而且提高了合成NADPH的磷酸戊糖途徑相關(guān)基因（如zwf基因）的表達(dá) 水平，且通過NADPH及NAD/NADPH比值的測(cè)定，證實(shí)NADPH的供應(yīng)得到了大幅提高，而Imol 精氨酸的合成需要消耗3mol NADPH。因此，二者共同促進(jìn)了精氨酸產(chǎn)量的大幅提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用谷氨酸棒桿菌和鈍齒棒桿菌提高精氨酸產(chǎn)量的 方法。
[0006] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種利用谷氨酸棒桿菌和鈍齒棒桿菌提高精氨酸產(chǎn)量的方 法，其實(shí)現(xiàn)的技術(shù)步驟為，1、dtsRl基因敲除同源臂的構(gòu)建及敲除質(zhì)粒的構(gòu)建：設(shè)計(jì)敲除谷 氨酸棒桿菌和鈍齒棒桿菌dtsRl基因的上下同源臂引物并分別在上下臂引物的5 '端和3' 端加上HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，分別通過PCR技術(shù)擴(kuò)增dtsRl的上下同源臂， 采用DNA純化試劑盒純化dtsRl的上下同源臂，并等摩爾混合后進(jìn)行重疊 PCR獲得dtsRl 基因敲除同源臂；通過HindIII和XbaI雙酶切，將dtsRl基因敲除同源臂克隆至蔗糖致死 質(zhì)粒pK18mobsacB中，獲得敲除質(zhì)粒pK18mobsacB_ Δ dtsRl，并將其分別電轉(zhuǎn)至谷氨酸棒桿 菌和鈍齒棒桿菌；
[0007] 2、誘導(dǎo)敲除了 dtsRl基因的谷氨酸棒桿菌和鈍齒棒桿菌高產(chǎn)精氨酸：先在28~ 30°C種子培養(yǎng)基中活化谷氨酸棒桿菌或鈍齒棒桿菌，培養(yǎng)14~16h后以1 %~2% v/v的接 種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28~30°C發(fā)酵生長至對(duì)數(shù)生長初期加入lmg/mL~15mg/mL 吐溫40或吐溫80誘導(dǎo)高產(chǎn)精氨酸，其中種子培養(yǎng)基配方如下：葡萄糖30g/L，玉米漿25g/ L，硫酸銨 45g/L，磷酸二氫鉀 0. 5g/L，MgS04 ·7Η20 0. 5g/L，尿素 I. 5g/L，pH = 7. 2 ;發(fā)酵培養(yǎng) 基配方如下：葡萄糖120g/L，玉米漿25g/L，硫酸銨45g/L，磷酸二氫鉀0. 05g/L，MgS04 ·7Η20 0. 5g/L，并加入了 0. 5g/L~2. Og/L油酸或吐溫80或二者混合物，如搖瓶發(fā)酵則需加30g/ L CaCO3;
[0008] 3、高密度發(fā)酵：對(duì)谷氨酸棒桿菌和鈍齒棒桿菌重組菌進(jìn)行高密度發(fā)酵，前期菌體 生長階段的參數(shù)為溫度28~30°C，溶氧控制在18~22 %的飽和溶氧濃度，pH為6. 5~ 7. 5 ;待OD6。。至5-6時(shí)，加吐溫40誘導(dǎo)，溶氧控制在28~32%左右的飽和溶氧濃度，pH 6. 5~7. 5,繼續(xù)培養(yǎng)70~108h收集菌液。
[0009] 所述的誘導(dǎo)劑是吐溫40,發(fā)酵培養(yǎng)基中是添加了油酸或吐溫80或二者混合物。
[0010] 所述谷氨酸棒桿菌和鈍齒棒桿菌的dtsRl基因被敲除。
[0011] 本發(fā)明的技術(shù)效果是：本發(fā)明將dtsRl基因敲除后，使其調(diào)控的α -酮戊二酸脫氫 酶復(fù)合物（oxoglutarate dehydrogenase complex，0DHC)的轉(zhuǎn)錄水平大幅下降，使α-酮 戊二酸流向了精氨酸；同時(shí)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加吐溫80或油酸或二者混合物彌補(bǔ)了 dtsRl 缺失造成的營養(yǎng)缺失，在發(fā)酵培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長初期添加吐溫40誘導(dǎo)了磷酸戊糖途徑的基因 轉(zhuǎn)錄水平大幅提高，從而為精氨酸的合成提供了足量的NADPH，省去了采用其他繁瑣的分子 育種手段來提高NADPH供應(yīng)及提高三羧酸循環(huán)途徑中α -酮戊二酸的其他積累方法。
【附圖說明】
[0012] 圖1為PCR方法擴(kuò)增敲除dtsRl上下同源臂及重疊 PCR圖。
[0013] 圖2為敲除dtsRl的單交換圖。
[0014] 圖3為敲除dtsRl的雙交換子的篩選圖。
[0015] 圖4為熒光定量PCR圖。
[0016] 在圖1中，1為上臂片斷；2為下臂片斷；3為重疊片斷；4為DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量。
[0017] 在圖2中，M為DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；1為陰性對(duì)照；2-3為陽性對(duì)照；4-6為 dtsRl-single-F和dtsRl-down-R引物單交換子篩選片斷。
[0018] 在圖3中，M為DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；1-2為陰性對(duì)照；3、5、7和9為dtsRl-inner check-F和dtsRl-inner check-R引物篩選的雙交換子片斷；4、6、8和10為dtsRl-up-F和 dtsRl-down-R引物雙交換子篩選片斷。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面將結(jié)合附圖1-4來詳細(xì)說明本發(fā)明所具有的有益效果，旨在幫助閱讀者更好 地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，但不能對(duì)本發(fā)明的實(shí)施和保護(hù)范圍構(gòu)成任何限定。
[0020] 實(shí)施例1
[0021] 重組菌C. glutamicumA dtsRl和C. crenatumA dtsRl的構(gòu)建過程及在搖瓶規(guī)模下 精氨酸生產(chǎn)的方法，包括以下步驟：
[0022] (1)敲除dtsRl質(zhì)粒的構(gòu)建及其重組菌的構(gòu)建：根據(jù)C. glutamicum(登錄號(hào)： BX927147. 1)和 C crenatum(登錄號(hào)：NZ_AQPS01000045. 1)中的 dtsRl 上下同源序列設(shè) 計(jì)引物，引物序列見表1(雙下劃線為限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，單下劃線為重疊序列），分別以 C. glutamicum和C. crenatum的單菌落為PCR反應(yīng)模板，PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性lOmin， 95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，最后在72°C延伸lOmin，擴(kuò)增出 二條與預(yù)期大小相符的DNA片段，參照?qǐng)D1所示，泳道4為DNA marker，泳道1、2分別為 dtsRl的上下同源臂；上下同源臂純化回收、等摩爾數(shù)混合后，再通過重疊 PCR反應(yīng)獲得敲 除dtsRl重疊片段，其PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性lOmin，95°C變性10s，56°C退火30s，72°C 延伸1.5min，共30個(gè)循環(huán)，最后在72°C延伸10min，圖I泳道3為重疊 PCR結(jié)果。
[0023] 重組菌的構(gòu)建：將獲得的敲除dtsRl同源片段，通過HindIII和XbaI雙酶切，克隆 至經(jīng)同樣雙酶切的鹿糖致死質(zhì)粒pK18mobsacB中，