基于磁性分離和量子點標記的人a群鏈球菌快速檢測方法和試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學檢測技術領域，具體為一種基于磁性分離和量子點標記的檢測人 A群鏈球菌（groupAstreptococci,GAS) (111，3,5,6,24血清型）抗原的快速檢測方法及 檢測試劑盒，以及該檢測試劑盒的制備及使用方法。
【背景技術】
[0002] 鏈球菌廣泛分布于自然界和動物體內，可長期寄居于人體鼻咽部和腸道中。為革 蘭氏陽性菌，呈球狀或卵圓形，為需氧或兼性厭氧菌，對營養(yǎng)要求較高。鏈球菌種類繁多，根 據溶血能力分為a、P、Y溶血性鏈球菌，又稱之甲型、乙型、丙型溶血性鏈球菌。根據鏈球 菌胞壁所含多糖（C抗原）的不同分為A~V等20族（其中缺I和J)，（Lancefield分型）。 對人類有致病性的鏈球菌90%屬于A群。鏈球菌C抗原的外層還具有M、T、R、S4種型特 異性抗原。M抗原主要見于A群，根據M抗原的不同又可分為90多個血清型，其中在我國能 引起風濕熱的臨床上最常見的血清型為組，10』5，116，1118，1124等。八群鏈球菌&仰即八 streptococci,GAS)又稱化膿性鏈球菌（streptococcuspyogenes)，為0溶血性鏈球菌。 A群鏈球菌感染和后遺癥一直是困擾公共健康和國民經濟的嚴重問題，尤對兒童和青年影 響最大。A群鏈球菌感染最常發(fā)生于冬春季和雨季，在兒童發(fā)病年齡多見于5~15歲，臨床 可把A群鏈球菌感染分為四類：①淺表部位感染：咽炎、皮膚和軟組織感染、膿皰瘡、丹毒、 陰道炎、產后感染；②深部感染：菌血癥、壞死性筋膜炎、深部組織感染、蜂窩織炎、肌炎、膿 毒敗血癥、心包炎、腦膜炎、肺炎、化膿性關節(jié)炎；③毒素介導：猩紅熱、鏈球菌中毒性休克 綜合征；④免疫介導：風濕熱、鏈球菌感染后腎小球腎炎、反應性關節(jié)炎。
[0003] 臨床病人由于不同的呼吸道病原體（如副流感病毒、流感嗜血桿菌、流感病毒、呼 吸道合胞病毒、腺病毒等）感染引起疾病癥狀可以十分相似，這導致了流行診斷比較困難， 確診往往依賴于實驗室診斷?？焖儆行У脑\斷方法應該是在疾病的發(fā)病初期就可以得到明 確的診斷，便于實施針對性的治療，阻止病情的發(fā)展遷延。
[0004] 盡管A群鏈球菌在全球范圍內傳播，但可用于實驗室診斷的標準化商品試劑的種 類極少。目前，A群鏈球菌的檢測主要有以下幾種方法：
[0005] 一、常規(guī)實驗室檢測
[0006] 1、細菌分離
[0007] 細菌培養(yǎng)是診斷A群鏈球菌感染的"金標準"。樣本采集后最好立即接種到血瓊脂 培養(yǎng)基上。若無條件及時接種，應使用轉運培養(yǎng)基。將標本接種在血瓊脂平皿，35~37°C， 含有5 %~10 %CO2或厭氧條件下孵育，可增加A群鏈球菌的分離率。血瓊脂平皿孵育24~ 48h。A群鏈球菌菌落常不能與其他P-溶血性鏈球菌區(qū)別，特別是C群和G群，需采用血 清學方法進行最后鑒定。該法培養(yǎng)所需時間長，操作步驟繁多，且若采樣前患者使用過抗菌 藥物，會造成培養(yǎng)結果的假陽性。這樣在臨床方面對病人的治療就有一定的局限性。
[0008] 2、血清學檢測
[0009]即采用酶聯免疫法、放免法、微量免疫熒光法等，檢測被檢者血清中A群鏈球菌抗 體水平，可間接提示A群鏈球菌感染的存在。然而，血清學試驗只能提供一種回顧性的診 斷，它需要同時檢測患者急性期和恢復期的雙份血清，如果恢復期中抗人A群鏈球菌抗體 效價比急性期高4倍或4倍以上才有診斷意義。另外，臨床上主要檢測的抗體為抗鏈球菌 素0,而統(tǒng)計學研究表明大約20%的病人并不出現出現抗鏈球菌素0水平的升高，故現有血 清學方法的檢測質量受到一定限制。
[0010] 二、快速診斷
[0011] 直接檢查人A群鏈球菌蛋白抗原和菌體核酸可達到快速診斷的目的，目前主要有 免疫熒光法、免疫酶法和PCR法等。免疫熒光法和免疫酶法均不能進行一步檢測，均存在操 作步驟復雜，需要專業(yè)人員操作，檢測時間長（2h以上），成本較高等缺點。PCR法主要是檢 測鏈球菌特異性rRNA序列，其檢測快速、靈敏、特異，是目前研究A群鏈球菌感染的重要手 段，但由于PCR對實驗設備以及操作要求較高，且易出現假陽性，在我國還不能作為常用的 臨床診斷方法。目前，檢測人A群鏈球菌抗原的方法主要為膠體金法檢測其C多糖抗原，但 是膠體金法敏感度較低，對樣品材料質量要求較高，同時在檢測前還必須對樣品進行細胞 裂解以釋放C多糖，而添加細胞裂解液的量又對檢測靈敏度有較大的影響。因此，建立具備 高靈敏度的A群鏈球菌特異性抗原快速診斷法十分必要。

【發(fā)明內容】

[0012] 針對【背景技術】中存在的這些技術問題，本發(fā)明提供了一種基于磁性分離和量子點 標記的能簡便、快速、高靈敏度的檢測人A群鏈球菌（Ml，3,5,6,24血清型）抗原的檢測方 法和試劑盒，以及該試劑盒的制備及使用方法。
[0013] 本發(fā)明是通過以下技術方案來實現的：
[0014] -種基于磁性分離和量子點標記的檢測人A群鏈球菌（Ml，3,5,6,24血清型）抗 原的方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：
[0015] 1)兔抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白多克隆抗體的制備；
[0016] 2)鼠抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白多克隆抗體的制備；
[0017] 3)將步驟1)制備得到的兔抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白多克隆抗體與納 米磁珠通過共價偶聯，制備抗人A群鏈球菌免疫納米磁珠；
[0018] 4)將步驟2)制備得到的鼠抗人A群鏈球菌1，3,5,6,24型11蛋白多克隆抗體與納 米量子點通過共價偶聯，制備量子點標記的抗人A群鏈球菌納米探針；
[0019] 5)取人呼吸道分泌物樣本（包括但不限于咽拭子），用PBST緩沖液溶解后，加入 步驟3)制備得到的抗人A群鏈球菌免疫納米磁珠，充分混合，反應10-45min后進行磁分 離，以PBST緩沖液洗滌2遍后，向磁分離得到的沉淀物中加入步驟4)制備得到的量子點標 記的抗人A群鏈球菌納米探針，反應10-45min后進行磁分離，以PBST緩沖液洗滌2遍后，使 用熒光酶標儀讀取熒光值；所述PBST緩沖液中各組分含量如下：8g/LNaCL，0. 2g/LKC1， 0? 24g/LKH2PO4,1. 44g/LNa2HPO4,0? 3g/LNaN3,0? 5ml/LTween-20;所述PBST緩沖液的pH =7. 4 ;
[0020] 6)根據步驟1)-步驟5)的方法分別檢測四份經臨床確定為人A群鏈球菌（Ml，3， 5,6,24血清型）陰性的人群的呼吸道分泌物樣品，讀取熒光值；所述人A群鏈球菌（Ml，3， 5,6, 24血清型）陰性的人群的呼吸道分泌物樣品簡稱人A群鏈球菌陰性對照樣品；所述四 份人A群鏈球菌陰性對照樣品的熒光值的平均值與3倍標準差之和即為CUT-OFF值；若步 驟5)中人呼吸道分泌物樣本的檢測熒光值大于⑶T-OFF值，則判斷為人呼吸道分泌物樣本 中人A群鏈球菌（111，3,5,6,24血清型）抗原為陽性；若步驟5)中人呼吸道分泌物樣本的 檢測熒光值小于⑶T-OFF值，則判斷為人呼吸道分泌物樣本中人A群鏈球菌（Ml，3, 5,6, 24 血清型）抗原為陰性。
[0021] -種基于磁性分離和量子點標記的檢測人A群鏈球菌（Ml，3,5,6,24血清型）抗 原的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒由具有富集人A群鏈球菌（M1，3, 5,6, 24血清型）抗 原功能的抗人A群鏈球菌免疫納米磁珠、量子點標記的抗人A群鏈球菌納米探針、質控品以 及PBST緩沖液所組成；所述質控品包括陽性質控品以及陰性質控品；所述陽性質控品由滅 活的人Ml血清型A群鏈球菌干燥結合到拭子上而成；所述陰性質控品是經臨床確定為人A 群鏈球菌（M1，3, 5,6, 24血清型）陰性的人群的咽拭子。
[0022] -種用于制備基于磁性分離和量子點標記的檢測人A群鏈球菌（M1，3, 5,6, 24血 清型）抗原的試劑盒的方法，其特征在于：所述制備方法包括以下步驟：
[0023] 1)抗人A群鏈球菌免疫納米磁珠的制備：
[0024] 1.1)兔及鼠抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白多克隆抗體IgG的制備
[0025] I.I. 1)重組M-His融合蛋白的制備、純化：
[0026]I.I.I. 1)對人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白進行生物信息學分析，分別獲取 其N端型特異性序列（高變區(qū)）中含胞外抗原表位且不與其他抗原抗體起交叉反應的的肽 段；
[0027]I.I. 1. 2)找到步驟I.I.I. 1)中所得到五個肽段一一對應的基因編碼序列，按 M1-M3-M5-M6-M24的順序進行序列拼接并根據大腸桿菌中密碼子的偏好性對該序列進行密 碼子優(yōu)化，在上述經密碼子優(yōu)化后的重組基因的序列的5'端及3'端引入酶切位點并化學 合成全基因序列，同時標記記為m;其基因序列參見序列表；
[0028]I. 1. 1.3)將步驟I. 1. 1.2)中所得到的m按分子生物學方法克隆入表達載體 pET-28a(+)后轉入大腸桿菌中表達重組M-His融合蛋白；所述重組M-His融合蛋白以可溶 性表達方式存在于菌體中；
[0029]I.I. 1. 4)用鎳柱純化步驟I.I. 1. 3)所得到的重組蛋白，SDS-PAGE檢測其純度后， 以Bradford法測定蛋白質濃度，調整蛋白濃度為0. 2mg/mL后備用；
[0030]I. 1. 2)兔及鼠抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白多克隆抗體IgG的制備：
[0031]I. 1. 2. 1)以步驟I.I. 1. 4)中所得到的重組M-His融合蛋白為完全抗原，分別免疫 新西蘭大白兔及豚鼠；分別制備兔抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白抗血清及鼠抗人A 群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白抗血清；所述兔抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白抗血 清及鼠抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白抗血清的間接ELISA效價均大于IXIO5 ;所述 間接ELISA是重組M-His融合蛋白作為包被抗原為基礎；
[0032]I. 1. 2. 2)采用ProteinG親和層析柱分別純化兔抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型 M蛋白抗血清及鼠抗人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白抗血清中的多克隆抗體IgG;
[0033]I. 1. 2. 3)用凱基Braford蛋白含量檢測試劑盒測定步驟I. 1. 2. 2)所得到的多克 隆抗體IgG的濃度，將其蛋白濃度均調整為lmg/mL后備用；
[0034]I. 2)免疫納米磁珠的包被：
[0035] 1. 2. 1)取5mg磁珠，用ImlMES緩沖液洗滌三次，置于納米磁分離器中進行磁分離 后移除上清；所述磁珠是以超順磁性Fe3O4為內核、粒徑為350nm的羧基磁珠；所述MES緩 沖液是質量濃度是2g/L的2-(N-嗎啉代）乙磺酸；所述MES緩沖液的pH= 6. 0 ;所述納米 磁分離器的磁性強度是〇. 4T;
[0036]L2. 2)依次加入用步驟L2. 1)中的MES緩沖液配制的濃度是8-12mg/ml的EDC 溶液以及用步驟1. 2. 1)中的MES緩沖液配制的濃度是6-12mg/ml的sulfo-NHS溶液各 0. 5ml，以10-40rpm/min于旋轉混合儀中活化lhr，置于納米磁分離器中進行磁分離后移除 上清，用Iml步驟1. 2. 1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后的磁珠；
[0037] 1. 2. 3)取5個離心管，在每個離心管中加入200iiL步驟1. 2. 2)所得到的活化后 的磁珠，置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清，向各離心管中加入用PBS緩沖液稀 釋的濃度為50-300iig/ml的由步驟I. 1)所制備的兔抗人A群鏈球菌1，3,5,6,24型M蛋 白多克隆抗體IgG溶液各lml，室溫下以15rpm/min于旋轉混合儀中反應2-6h，置于納米磁 分離器中進行磁分離后移除上清后，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液，室溫 下以15rpm/min于旋轉混合儀中反應2h以封閉磁珠上未與抗體反應的羧基；所述PBS緩沖 液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2PO4,1. 44g/LNa2HPO4，所述PBS 緩沖液的pH= 7. 4 ;
[0038]I. 2. 4)封閉反應完成后，將該5個離心管置于納米磁分離器中進行磁分離后移 除上清，各用Iml洗滌緩沖液洗滌三遍；所述洗滌緩沖液中各成分含量如下：8g/LNaCL， 0.2g/LKCl，0.2