多能干細(xì)胞-遺傳性心肌病心肌細(xì)胞及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及人類多能干細(xì)胞-遺傳性心肌病心肌細(xì)胞及其制備技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]人類遺傳性心肌病包括五種心肌病:肥厚型心肌病(hypertrophiccard1myopathy, HCM)、擴(kuò)張型心肌病(dilated card1myopathy, DCM)、限制型心肌病(restricted card1myopathy)、左心室致密化不全型心肌病(left ventricularnoncompact1n, LVNC)及致心率失常性右室心肌病(arrhythmogenic right ventricularcard1myopathy, ARVC)，是由多種單一基因突變?cè)斐傻闹卮笮呐K疾病。這些單一基因包括表達(dá)肌小節(jié)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、離子通道蛋白、核纖層蛋白、線粒體蛋白的基因，如肌球蛋白重鏈MHC、肌球蛋白輕鏈MLC、肌鈣蛋白TNNT2、肌球蛋白結(jié)合蛋白MBPC3、鈉離子通道蛋白SCN5a、鉀離子通道蛋白KCNH2、核纖層蛋白Iamin等(詳細(xì)描述請(qǐng)見(jiàn)Morita H and SeidmanCE, Journal of Clinical Investigat1n, 2005)。這些基因上的不同位點(diǎn)發(fā)生突變后，可以導(dǎo)致遺傳性心肌病的發(fā)生。需要注意的是，同一基因上不同位點(diǎn)發(fā)生突變后，可以導(dǎo)致相同類型的遺傳性心肌病，也可以導(dǎo)致發(fā)生不同類型的遺傳性心肌病。例如肌鈣蛋白TNNT2基因R92Q與DE160突變均導(dǎo)致肥厚型心肌病，而TNNT2 R141W導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病。
[0003]目前對(duì)于遺傳性心肌病并無(wú)有效的、針對(duì)疾病本質(zhì)的、特定治療手段或治療藥物。現(xiàn)今臨床上的治療措施以預(yù)防心源性猝死和改善心功能為主，但僅僅能改善患者的一些臨床癥狀，并不直接針對(duì)遺傳性心肌病的發(fā)病機(jī)制而起到明顯的治愈效果，也不改變心肌病的自然病史。因此，尋找導(dǎo)致遺傳性心肌病的早期的分子通路，進(jìn)一步搞清發(fā)病機(jī)制，對(duì)于開發(fā)有效、新型的治療藥物至關(guān)重要。
[0004]但是目前對(duì)于遺傳性心肌病疾病機(jī)制的研究進(jìn)展緩慢。這主要是由于缺乏能大量方便獲取的且能忠實(shí)重現(xiàn)疾病過(guò)程的疾病模型。
[0005]從患者的心臟活體獲取遺傳性心肌病的病變?nèi)祟愋募〖?xì)胞非常困難，因?yàn)閬?lái)源非常稀少且在體外不易長(zhǎng)期存活，并且這些病變心肌細(xì)胞已經(jīng)處于疾病的晚期，對(duì)于疾病發(fā)生的早期機(jī)制研究并無(wú)太多作用。雖然遺傳性心肌病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型也已經(jīng)建立，并且對(duì)遺傳性心肌病的研究起到了重要作用，但是動(dòng)物模型由于其心臟的生理功能及分子基礎(chǔ)與人類有較大差別(比如小鼠的心率達(dá)500次/秒，是人的10倍)，無(wú)法完全重現(xiàn)人類疾病表型，并且針對(duì)遺傳性心肌病動(dòng)物模型的研究也多集中于疾病晚期，并不能作為疾病早期階段心肌肌小節(jié)導(dǎo)致何種病變的有效研究對(duì)象。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服上述現(xiàn)有遺傳性心肌病疾病模型的限制，利用TALEN或CR ISPR/CAS9基因編輯技術(shù)介導(dǎo)基因重組，將能導(dǎo)致人類家族性遺傳性心肌病的基因突變，導(dǎo)入人類多能干細(xì)胞(包括人類胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞)基因組并替換相對(duì)應(yīng)的正常基因，建立人遺傳性心肌病多能干細(xì)胞疾病細(xì)胞株，進(jìn)而通過(guò)多能干細(xì)胞定向分化心肌細(xì)胞技術(shù)(該技術(shù)為已公開的成熟技術(shù)，具體實(shí)施步驟見(jiàn)Lian et al., NatureProtocols, 2012 ;8:162-75)，制備可用于研究與應(yīng)用的人類遺傳性心肌病疾病心肌細(xì)胞。
[0007]本發(fā)明提供了一種建立各種人類遺傳性心肌病特異的多能干細(xì)胞細(xì)胞株方法，利用新型的TALEN或CRISPR/CAS9基因組編輯技術(shù)，通過(guò)基因重組方法編輯人類多能干細(xì)胞基因組，構(gòu)建人類遺傳性心肌病多能干細(xì)胞。
[0008]具體而言，本發(fā)明的人類遺傳性心肌病_多能干細(xì)胞建立方法，其特征在于，利用新型的TALEN或CRISPR/CAS9基因組編輯技術(shù)，通過(guò)基因重組方法編輯人類多能干細(xì)胞基因組，構(gòu)建人類遺傳性心肌病_多能干細(xì)胞疾病細(xì)胞株；其包括步驟:
[0009]A、構(gòu)建針對(duì)不同靶基因(該靶基因突變導(dǎo)致遺傳性心肌病，描述見(jiàn)【背景技術(shù)】第一段)的 TALEN 或 CRISPR/CAS9 質(zhì)粒；
[0010]B、構(gòu)建帶有步驟A所述導(dǎo)致不同遺傳性心肌病的各種相應(yīng)基因突變的同源基因供體質(zhì)粒；
[0011]C、培養(yǎng)良好的未分化的人類胚胎干細(xì)胞或體外重編程正常人類個(gè)體的體細(xì)胞為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞；
[0012]D、將步驟A獲得的TALEN或CRISPR/CAS9質(zhì)粒與步驟B獲得的帶有相應(yīng)突變的同源基因供體質(zhì)粒共電轉(zhuǎn)人類多能干細(xì)胞，通過(guò)基因重組導(dǎo)入將遺傳性心肌病的特異突變導(dǎo)入人類胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞；
[0013]E、利用Puromycin藥物篩選出雜合或純合的遺傳性心肌病多能干細(xì)胞，并建立相應(yīng)細(xì)胞株。
[0014]本發(fā)明中，所述的細(xì)胞株為各種帶有導(dǎo)致人類遺傳性心肌病基因突變的人類胚胎干細(xì)胞和人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
[0015]本發(fā)明中，人類遺傳性心肌病_多能干細(xì)胞通過(guò)多能干細(xì)胞定向分化心肌細(xì)胞技術(shù)(該技術(shù)為已公開的成熟技術(shù)，具體實(shí)施步驟見(jiàn)Lian et al., Nature Protocols, 2012 ；8:162-75)得到的相應(yīng)的人類遺傳性心肌病變心肌細(xì)胞。
[0016]本發(fā)明的人類遺傳性心肌病_多能干細(xì)胞細(xì)胞的制備方法中，將篩選出的遺傳性心肌病_多能干細(xì)胞定向分化為遺傳性心肌病_疾病特異的心肌細(xì)胞。
[0017]本發(fā)明的人類遺傳性心肌病_多能干細(xì)胞細(xì)胞的制備方法中，將分化后的人類遺傳性心肌病特異的心肌細(xì)胞進(jìn)行純化，使其比例達(dá)到95%以上。
[0018]本發(fā)明的人類遺傳性心肌病_多能干細(xì)胞細(xì)胞的制備方法中，將分化后的人類遺傳性心肌病特異的心肌細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)疾病表型的驗(yàn)證。
[0019]進(jìn)一步，本發(fā)明的人類遺傳性心肌病_多能干細(xì)胞可用于通過(guò)多能干細(xì)胞定向分化心肌細(xì)胞技術(shù)制備得到人類遺傳性心肌病變心肌細(xì)胞。
[0020]以及，所述的人類遺傳性心肌病_多能干細(xì)胞在用于制備體外人類遺傳性心肌病疾病心肌組織，其中，將分化獲得的人類遺傳性心肌病變心肌細(xì)胞與任意支架材料結(jié)合，培養(yǎng)形成各類體外人類遺傳性心肌病疾病心肌組織。
[0021]本發(fā)明提供了上述人類遺傳性心肌病_多能干細(xì)胞的制備方法，即利用TALEN或CRISPR/CAS9基因組編輯技術(shù)，通過(guò)基因重組方法編輯人類多能干細(xì)胞基因組，構(gòu)建人類遺傳性心肌病多能干細(xì)胞疾病模型。
[0022]本發(fā)明采用分子生物學(xué)方法構(gòu)建針對(duì)不同基因突變靶位點(diǎn)的TALEN或CRISPR/CAS9質(zhì)粒及帶有相應(yīng)突變和藥物篩選基因的同源基因供體質(zhì)粒，將二者共電擊轉(zhuǎn)染進(jìn)入人類多能干細(xì)胞(包括人類胚胎干細(xì)胞human embryonic stem cells及人類誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells))，通過(guò)基因重組導(dǎo)入導(dǎo)致遺傳性心肌病的特異突變；進(jìn)而通過(guò)嘌呤霉素(Puromycin)等藥物篩選出雜合或純合的遺傳性心肌病多能干細(xì)胞系，通過(guò)已知的多能干細(xì)胞定向分化心肌細(xì)胞技術(shù)，將其定向分化為人類遺傳性心肌病疾病特異的心肌細(xì)胞；從而進(jìn)行相關(guān)的功能研究，探索導(dǎo)致遺傳性心肌病的早期分子通路，進(jìn)一步搞清發(fā)病機(jī)制，尋求新型、有效的治療手段和藥物篩選。
[0023]更具體的，本發(fā)明的人類遺傳性心肌病-多能干細(xì)胞的制備方法，包括步驟如下:
[0024]I) TALEN或CRISPR/CAS9質(zhì)粒