miRNA-Pa化合物在制備慢性疼痛的診斷標(biāo)志物及治療藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微小RNA分子的新用途，尤其涉及HiiRNA-Pa的新用途，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]微小RNA(miRNA)是新近發(fā)現(xiàn)的一類在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的18?22bp單鏈RNA小分子。miRNA參與細(xì)胞分化、凋亡和代謝等多種生物學(xué)過(guò)程，這一調(diào)節(jié)進(jìn)程異?？梢鸲喾N疾病發(fā)生。近來(lái)研究表明miRNA作為基因表達(dá)調(diào)控的重要體調(diào)節(jié)因子在神經(jīng)生理和病理發(fā)生過(guò)程，像神經(jīng)元發(fā)育、神經(jīng)元可塑性變化以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。慢性疼痛是當(dāng)今危害人類健康和降低人們生活質(zhì)量的最常見(jiàn)臨床病癥之一，已成為臨床和基礎(chǔ)科學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。中樞神經(jīng)元(如脊髓、背根和三叉神經(jīng))是慢性疼痛發(fā)生和維持的重要組織，這些組織神經(jīng)元可塑性改變導(dǎo)致中樞敏化是慢性疼痛形成的關(guān)鍵。miRNA在神經(jīng)中樞中表達(dá)極為豐富，但對(duì)于其調(diào)控慢性疼痛研究尚處于起步階段。Miska等利用Northern印跡方法對(duì)特定組織器官表達(dá)的miRNA進(jìn)行了研究時(shí)發(fā)現(xiàn)7個(gè)miRNA在人腦中有特異表達(dá)，這些 miRNA 分別是 miRNA-9，miRNA-124a, miRNA-135, miRNA-153,miRNA-183和miRNA-Pa。中國(guó)專利201010565517公開了 miRNA-Pa化合物用于制備腦腫瘤藥物中的用途。以往研究表明 miRNA-103 (EMB0J.2011, 30:3830 - 3841)、miRNA-7a(Brain.2013，136:2738 - 2750)以及 let-7b (Neuron.2014，82:47 - 54)等都能參與痛敏形成過(guò)程。但至今未見(jiàn)有能用于防治慢性疼痛有效的miRNA分子能夠用于慢性疼痛診斷標(biāo)志物。由于miRNA對(duì)神經(jīng)元環(huán)路活性具有廣泛的調(diào)控作用，很可能成為慢性疼痛防治的重點(diǎn)研究基因之一，因系迫切需要通過(guò)大規(guī)模測(cè)序方法充分挖掘和開發(fā)屬于本國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新的miRNA基因，為慢性疼痛的防治藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。因此，miRNA-Pa是申請(qǐng)者新近發(fā)現(xiàn)的微小miRNA分子，關(guān)于miRNA-Pa作為一種抑制慢性疼痛基因的用途和作為慢性疼痛診斷標(biāo)志物的用途目前也尚未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]發(fā)明目的:本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)中治療慢性疼痛藥物的不足，通過(guò)對(duì)miRNA深入研究，在高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)的新miRNA-Pa基礎(chǔ)上，通過(guò)驗(yàn)證和篩選，開發(fā)出miRNA-Pa新用途。
[0004]技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:
[0005]本發(fā)明提供miRNA-Pa在制備慢性疼痛疾病臨床診斷標(biāo)志物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明另一個(gè)目的是提供miRNA-Pa化合物在制備治療慢性疼痛藥物中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明另一個(gè)目的是提供miRNA-Pa化合物在制備治療慢性炎癥性疼痛藥物中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明所述的miRNA-Pa化合物在制備治療慢性關(guān)節(jié)炎疼痛藥物中的應(yīng)用，所述的藥物劑型為口服制劑。
[0009]作為優(yōu)選方案，本發(fā)明所述的miRNA-Pa化合物在制備治療慢性關(guān)節(jié)炎疼痛藥物中的應(yīng)用，所述的藥物劑型為片劑，顆粒劑，膠囊劑，丸劑或注射劑。
[0010]本發(fā)明提供miRNA-Pa的核苷酸序列為UGGGA UGAAG CACUG UAGCU，如序列表I。
[0011]Solexa克服了常規(guī)miRNA克隆技術(shù)的缺點(diǎn)，具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，能夠檢測(cè)出最少一個(gè)小RNA分子，并且準(zhǔn)確性高，檢出的小RNA分子堿基錯(cuò)誤率極低。HiSeq2000是Illumina公司2010年推出的一款新的測(cè)序儀，采用穩(wěn)定的可逆終止法邊合成邊測(cè)序技術(shù)。該技術(shù)使用4種含有末端阻斷基團(tuán)和不同熒光信號(hào)的堿基進(jìn)行模板互補(bǔ)鏈的合成，不僅確保了測(cè)序的高精確性和高順序性，而且排除了由重復(fù)序列和同聚物導(dǎo)致的測(cè)序錯(cuò)誤。融合了最新的光學(xué)系統(tǒng)和制造工藝，該光學(xué)系統(tǒng)采用2個(gè)激光源對(duì)Flowcell進(jìn)行掃描，并使用4臺(tái)照相機(jī)對(duì)4種堿基分別進(jìn)行記錄，大幅度減少了不同堿基之間的信號(hào)干擾，提高了測(cè)序系統(tǒng)的準(zhǔn)確度。同時(shí)，HiSeq2000使用了新穎的雙表面成像技術(shù)，增加了 Flowcell的有效面積，從而提高測(cè)序產(chǎn)量和降低成本。每個(gè)文庫(kù)的測(cè)序量至少達(dá)到1500萬(wàn)條小RNA序列以上。基于這種最新的測(cè)序手段，將有望識(shí)別棉花中特定發(fā)育時(shí)期特定組織特異表達(dá)的新miRNA。
[0012]本發(fā)明采用國(guó)際上先進(jìn)的Solexa高通量測(cè)序技術(shù)，最新的HiSeq2000測(cè)序儀結(jié)合生物信息學(xué)分析、首次從miRNA轉(zhuǎn)錄組組水平發(fā)現(xiàn)miRNA-Pa，并利用定量PCR及疼痛行為學(xué)試驗(yàn)，結(jié)果表明miRNA-Pa在完全弗氏佐劑(CFA)慢性疼痛小鼠脊髓中出現(xiàn)明顯下調(diào)表達(dá)，表明miRNA-Pa表達(dá)下調(diào)和慢性疼痛的直接相關(guān)性，因此，通過(guò)miRNA-Pa化合物過(guò)表達(dá)可以抑制疼痛。
[0013]本發(fā)明采用慢病毒介導(dǎo)的過(guò)表達(dá)技術(shù)檢測(cè)到，當(dāng)CFA慢性疼痛小鼠脊髓miRNA-Pa過(guò)表達(dá)時(shí)，其痛敏明顯降低；而在正常小鼠miRNA-Pa下調(diào)表達(dá)時(shí)，小鼠出現(xiàn)明顯痛敏增加行為，表明miRNA-Pa化合物可提高疼痛閾值上升，發(fā)揮很好的抑制慢性疼痛功效。
[0014]另外，本發(fā)明對(duì)miRNA-Pa在慢性疼痛病人血液中的表達(dá)進(jìn)行了定量檢測(cè)。研究證實(shí)miRNA-Pa存在于慢性疼痛病人血液中，其表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著下調(diào)，也表明本發(fā)明所述的miRNA-Pa可以作為慢性疼痛的診斷標(biāo)志物，同時(shí)也可以作為防治慢性疼痛的藥物。
[0015]有益效果:本發(fā)明通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究篩選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miRNA-Pa在慢性疼痛發(fā)生和維持過(guò)程中的重要調(diào)控作用，作為疼痛抑制基因，miRNA-Pa能顯著抑制慢性疼痛的發(fā)生，可作為制備防治慢性疼痛的藥物，同時(shí)也可作為慢性疼痛疾病臨床診斷標(biāo)志物。并且本發(fā)明研究結(jié)果表明通過(guò)檢測(cè)或干涉神經(jīng)中樞中miRNA-Pa的表達(dá)可為慢性疼痛診斷或治療方案。
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1是miRNA-Pa在CFA慢性疼痛小鼠模型中的差異表達(dá)。
[0017]圖2是miRNA-Pa在慢性疼痛病人血樣中的差異表達(dá)結(jié)果。
[0018]圖3是HiiRNA-PaCFA慢性疼痛小鼠中過(guò)表達(dá)㈧和在正常小鼠中下調(diào)表達(dá)⑶的疼痛行為學(xué)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的各種等價(jià)形式的修改均落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求所限定的范圍。
[0020]實(shí)施例1
[0021]1.完全弗氏佐劑(CFA)慢性關(guān)節(jié)炎疼痛模型制備:
[0022]選取SPF級(jí)雄性6周昆明雄性小鼠在異氟醚麻醉下，圍繞左后足足跖關(guān)節(jié)部選擇兩點(diǎn)皮內(nèi)注射無(wú)菌完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant, CFA ;Sigma公司)10 μ 1，該注射濃度可誘導(dǎo)產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎。在注射后24小時(shí)即出現(xiàn)熱和機(jī)械痛覺(jué)閾值的降低并可維持3周以上，作為慢性疼痛造模合格小鼠。
[0023]疼痛行為監(jiān)測(cè):熱痛覺(jué)過(guò)敏:將有機(jī)玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，按Hargreaves法用熱輻射刺激以照射小鼠足底緊貼玻璃板部位。記錄照射開始至小鼠出現(xiàn)抬足時(shí)間，截止時(shí)間為20s。每只動(dòng)物測(cè)定3次，取其平均值，每次測(cè)定時(shí)間間隔5min。
[0024]2.RNA 提取
[0025]按照Trizol法抽提總RNA，測(cè)定濃度后取500ng總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA產(chǎn)物稀釋兩倍用于RT-PCR的模板。
[0026]3.參考之前國(guó)外文獻(xiàn)對(duì)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析的成功方法(Jones-RhoadesM W， Bartel D P.Computat1nal identificat1n of plant miRNAs and theirtargets, including a stress-1nduced miRNA.Mo 1.Cell, 2004, 14:787-799.)，建立一套計(jì)算機(jī)分析方法用來(lái)發(fā)現(xiàn)和鑒定測(cè)序數(shù)據(jù)中的棉花miRNA。①將獲得的5個(gè)小RNA文庫(kù)中的原始序列通過(guò)計(jì)算機(jī)方法去掉3'接頭，并過(guò)濾掉序列長(zhǎng)度在ISnt以下的序