Ssr引物組及利用該引物組構(gòu)建麥芽指紋圖譜的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明創(chuàng)造屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種構(gòu)建麥芽指紋圖譜的方法，尤其涉 及一種利用SSR引物構(gòu)建麥芽指紋圖譜，進(jìn)而進(jìn)行麥芽品種鑒定的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 啤酒是以麥芽、酒花、水為主要原料，經(jīng)酵母發(fā)酵作用釀制而成的飽含二氧化碳的 低酒精度酒。麥芽作為啤酒的主要原料，是大麥經(jīng)浸麥、發(fā)芽、干燥和焙焦等工藝制得的，麥 芽的質(zhì)量直接決定啤酒的質(zhì)量。麥芽的品種鑒定是評(píng)價(jià)大麥質(zhì)量和麥芽質(zhì)量最重要的指 標(biāo)，二者均是保證啤酒品質(zhì)的重要指標(biāo)。由于缺乏麥芽品種鑒定的技術(shù)手段，啤酒企業(yè)在麥 芽采購(gòu)時(shí)不僅蒙受巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且摻假的麥芽由于均一性差，將直接影響糖化、過(guò)濾 和釀造性能，降低啤酒品質(zhì)，最終影響啤酒企業(yè)的品牌形象。因此啤酒行業(yè)內(nèi)急需開(kāi)發(fā)一種 麥芽品種的鑒定技術(shù)，進(jìn)而從源頭上保障啤酒原料的品質(zhì)。
[0003] 近年來(lái)以微衛(wèi)星（SSR)分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的大麥、小麥等農(nóng)作物DNA指紋庫(kù)的構(gòu)建 已逐步開(kāi)展，基于聚丙稀酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE)技 術(shù)在大麥遺傳多樣性及純度鑒定等方面的研究也有相關(guān)報(bào)道。傳統(tǒng)的SSR操作通過(guò)聚丙烯 酰胺凝膠電泳（PAGE)配合銀染分析進(jìn)行基因多態(tài)性分析，方法成熟，卻耗時(shí)、耗力、非自動(dòng) 化，尤其是進(jìn)行大規(guī)模、多批次的數(shù)據(jù)收集和分析時(shí)，該方法存在相當(dāng)大的難度：（1)不能 準(zhǔn)確讀出擴(kuò)增片段大??；（2)不同等位基因的變異難以準(zhǔn)確識(shí)別；(3)不同批次反應(yīng)數(shù)據(jù)難 以統(tǒng)一處理。與聚丙烯酰胺凝膠電泳相比，毛細(xì)管電泳具有高靈敏度、高分辨率、快速、自動(dòng) 化、樣品少、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。毛細(xì)管電泳（capillaryelectrophoresis,CE)是以彈性 石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，依據(jù)樣品中各組分之間的淌度和分配 行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離分析方法。毛細(xì)管電泳在檢測(cè)時(shí)要求引物必須攜帶熒 光檢測(cè)器能識(shí)別的熒光染料，熒光檢測(cè)器對(duì)標(biāo)記有熒光染料的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行信號(hào)采集，通 過(guò)與各泳道的分子量?jī)?nèi)標(biāo)進(jìn)行比對(duì)，可自動(dòng)讀取產(chǎn)物片段大小。發(fā)明專(zhuān)利ZL201310119954. X公開(kāi)了"一種小麥SSR指紋圖譜構(gòu)建方法"。所述小麥SSR指紋圖譜構(gòu)建方法包括如下步 驟：首先提取供試品種的DNA，然后用13對(duì)基本核心SSR熒光標(biāo)記引物和12對(duì)擴(kuò)展核心SSR 熒光標(biāo)記引物分別對(duì)供試品種DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物經(jīng)五色熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)構(gòu) 建小麥品種的SSR指紋圖譜。該方法提高了試驗(yàn)效率，具有快速、準(zhǔn)確、操作方便等優(yōu)勢(shì)，并 且鑒定結(jié)果不易受環(huán)境影響。然而，與普通引物僅30-50元的成本相比，目前10D熒光引物 的成本過(guò)高，約600-1000元。
[0004] TP-M13-SSR技術(shù)是基于熒光測(cè)序技術(shù)的SSR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)體系，也是SSR技術(shù)與 熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)的完美整合。M13熒光引物具有通用性，只需合成一次。如果試驗(yàn)中需要 增加新的SSR引物時(shí)，只要合成普通引物即可，不用再合成新的熒光引物，因此試驗(yàn)成本大 幅降低。因此，TP-M13-SSR技術(shù)結(jié)合了SSR技術(shù)與熒光檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)--簡(jiǎn)便、可靠、低成本。 發(fā)明專(zhuān)利ZL201310127570. 2公開(kāi)了"一種棗樹(shù)SSR標(biāo)記分子遺傳圖譜的構(gòu)建方法"。該本 發(fā)明所述的構(gòu)建方法，包括如下步驟：1)提取待測(cè)棗樹(shù)親本和子代的基因組DNA ;2)以親本 材料篩選SSR引物；3)分別利用上述SSR引物，各自以待測(cè)棗樹(shù)親本和子代的基因組DNA為 模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；4)利用生物學(xué)軟件分析PCR擴(kuò)增結(jié)果，構(gòu)建棗樹(shù)SSR標(biāo)記分子遺傳圖 譜。該發(fā)明建立了棗樹(shù)SSR標(biāo)記技術(shù)體系，獲得的SSR標(biāo)記和核心引物組，具有高效性、穩(wěn) 定性和共顯性等優(yōu)點(diǎn)。但目前還未見(jiàn)關(guān)于應(yīng)用基于毛細(xì)管電泳技術(shù)的SSR分子標(biāo)記進(jìn)行麥 芽品種鑒定的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)目前麥芽品種鑒定缺少成本低、靈敏、準(zhǔn)確定量檢測(cè)手段的問(wèn)題，本發(fā)明提 供了SSR引物組以及利用所述SSR引物組構(gòu)建麥芽品種指紋圖譜的方法，該方法基于 TP-M13-SSR標(biāo)記結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)，并利用所構(gòu)建的SSR指紋圖譜進(jìn)行麥芽品種鑒定。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0007]SSR引物組，包括4對(duì)核心SSR引物，分別為Scssrl0148、HVM68、HVWAXYG和 EBmac755 ;其中正向引物的5'端和M13引物相連合成帶有M13尾巴的引物，即TP-M13引 物。所述4對(duì)核心SSR引物序列如下：
[0008]
[0009] 利用上述SSR引物組構(gòu)建麥芽品種指紋圖譜的方法，包括以下步驟：
[0010] (1)提取供試樣品的DNA:
[0011] 取單粒麥芽樣品于1. 5ml離心管中，約25-45mg，加入7-8mm鋼珠，利用Thmorgan CK1000D高通量組織研磨儀進(jìn)行粉碎。樣品中加入65°C預(yù)熱的CTAB提取緩沖液600ul， 渦旋混勻裂解樣品。由于麥芽中富含蛋白質(zhì)、多糖、多酚等物質(zhì)，分離難度大，因此添加 4ul0 -巰基乙醇和1 %PVP(聚乙烯吡咯烷酮），防止多酚氧化褐變和DNA降解，有效去除多 酚和多糖。65°C水浴15min，期間輕輕搖動(dòng)混勻。加600ul氯仿/異戊醇（24:1)，渦旋劇烈 混勻20s，使成乳狀液。室溫下，lOOOOrpm離心10分鐘，吸取300ul的上清液到新離心管中， 加10ul的RNaseA放置20min。小心抽取上清液加入預(yù)冷的等體積的異丙醇，直至白色線 狀DNA形成塊狀沉淀。-20°C條件下放置20分鐘以上，lOOOOrpm離心3分鐘收集沉淀。加 650ul的70%乙醇沖洗液，輕搖幾分鐘，lOOOOrpm離心2min，棄濾液。打開(kāi)蓋，平放潔凈場(chǎng) 所揮發(fā)乙醇。加適量TE緩沖液溶解DNA，2-8°C保存DNA。
[0012] (2)用3條引物PCR擴(kuò)增：
[0013] 第1條引物是SSR正向引物的5'端和M13引物相連合成帶有M13尾巴的引物，即 TP-M13引物；第2條引物為正常的SSR反向引物；第3條引物是5'端標(biāo)記有AlexaFluor 680熒光的M13通用引物。所述M13通用引物的引物序列為T(mén)GTAAAACGACGGCCAGT。
[0014] PCR體系反應(yīng)體積為20yL，含MgCl2 2. 5mmol/L，dNTP 0? 20mmol/L，帶有M13尾巴 序列的特異正向引物〇? 04ymol/L、反向引物0? 16ymol/L，M13熒光引物0? 12ymol/L，Taq DNA聚合酶0. 5單位，2XPCR緩沖液（不含Mg2+)，樣品DNA10-50ng。反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變 性 3min;94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸lmin，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 10min，4°C保 存。
[0015](3)毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)：
[0016] a、制備SLS/DSS混合液：取0? 5y1的DSS-400分子量?jī)?nèi)標(biāo)，加入39. 5y1的SLS 甲酰胺上樣緩沖液，在渦旋震蕩器上混合均勻，加入樣品板中；
[0017] b、樣品孔中加入1y1稀釋后的PCR產(chǎn)物，加一滴石蠟油覆蓋樣品；
[0018] c、在緩沖液板與樣本板對(duì)應(yīng)孔內(nèi)加入3/4體積的分離緩沖液；
[0019] d、將上樣板和緩沖板放入BECKMANGeXP遺傳分析系統(tǒng)儀（BECKMAN公司，美國(guó)） 中，進(jìn)樣電壓2.OkV，時(shí)間30sec;90°C變性120sec;分離電壓6.OkV，時(shí)間50min。在毛細(xì)管 凝膠電泳過(guò)程中，PCR產(chǎn)物與DSS-400分子量?jī)?nèi)標(biāo)的熒光信號(hào)均由基因分析儀自動(dòng)保存。
[0020] (4)數(shù)據(jù)分析和圖譜構(gòu)建：
[0021] 用GeneMapper-V3. 0軟件對(duì)BECKMAN GeXP遺傳分析系統(tǒng)儀收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分 析，通過(guò)人工分析與軟件統(tǒng)計(jì)得出不同麥芽的SSR標(biāo)記片段。利用軟件將SSR標(biāo)記片段與 DSS-400分子量?jī)?nèi)標(biāo)比較，得到SSR標(biāo)記片段長(zhǎng)度大小，從而構(gòu)建麥芽品種的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖 譜。
[0022] -種利用上述麥芽標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行麥芽品種鑒定的方法，將待測(cè)樣品每粒麥芽 DNA的4對(duì)SSR引物擴(kuò)增的電泳圖譜分別與麥芽標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜相比較，如果待測(cè)樣品的電泳 圖譜與已知麥芽品種的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜數(shù)據(jù)一致，可判定二者為相同品種；如果待測(cè)樣品的 電泳圖譜與已知麥芽品種的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜數(shù)據(jù)有差異，則判定二者為不同麥芽品種。
[0023] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種基于TP-M13-SSR標(biāo)記結(jié)合毛細(xì)管電泳 技術(shù)構(gòu)建麥芽品種指紋圖譜的方法，并利用所構(gòu)建的SSR指紋圖譜進(jìn)行麥芽品種鑒定。本 發(fā)明為SSR分子標(biāo)記技術(shù)在麥芽品種鑒定中的推廣和應(yīng)用提供了技術(shù)支持，并且提高了品 種鑒定的準(zhǔn)確性。
[0024] (1)該法結(jié)合了SSR標(biāo)記與毛細(xì)管熒光檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，克服了聚丙烯酰胺凝膠電泳 的不足，不僅能準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物片段的大小，精確度達(dá)到lbp之內(nèi)，而且成本低廉，極具應(yīng)用 價(jià)值。本發(fā)明所述的方法只需對(duì)M13通用引物標(biāo)記一次熒光，其他引物都按普通引物合成， 大大降低了合成熒光引物的成本。如果試驗(yàn)中需要增加新的SSR引物，不用再合成新的熒 光引物，引物數(shù)量越多則試驗(yàn)成本降低越顯著。
[0025] (2)本發(fā)明采用特異性的SSR引物組進(jìn)行麥芽品種鑒定，特異性高，擴(kuò)增效率好， 能快速鑒定麥芽的不同品種，具有快速、準(zhǔn)確、操作方便等優(yōu)勢(shì)，并且鑒定結(jié)果不易受環(huán)境 影響。該方法可以防止麥芽摻假問(wèn)題的出現(xiàn)，從源頭上保障麥芽的品質(zhì)，進(jìn)而保證啤酒的品 質(zhì)，維護(hù)啤酒企業(yè)的品牌形象。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為引物scssrl0148時(shí)麥芽Copeland毛細(xì)管電泳圖譜；
[0027] 圖2為引物HVM68時(shí)麥芽Copeland毛細(xì)管電泳圖譜；
[0028] 圖3為引物HVWAXYG時(shí)麥芽Copeland毛細(xì)管電泳圖譜；
[0029] 圖4為引物EBmac755時(shí)麥芽Copeland毛細(xì)管電泳圖譜；
[0030] 圖5為引物scssrl0148時(shí)麥芽Gairdner毛細(xì)管電泳圖譜；
[0031] 圖6為引物HVM68時(shí)麥芽Gairdner毛細(xì)管電泳圖譜；
[0032] 圖7為引物HVWAXYG時(shí)麥芽Gairdner毛細(xì)管電泳圖譜；
[0033] 圖8為引物EBmac755時(shí)麥芽Gairdner毛細(xì)管電泳圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0035] 實(shí)施例1 :構(gòu)建麥芽SSR指紋圖譜
[0036] 選擇21種不同產(chǎn)地的大麥樣品，經(jīng)發(fā)芽、干燥后制成麥芽，見(jiàn)表1。
[0037] 表1. 21種麥芽樣品
[0038]
[0039]SSR引物組，包括4對(duì)核心SSR引物，分別為Scssrl0148、HVM68、HVWAXYG和 EBmac755 ;其中正向引物的5'端和M13引物相連合成帶有M13尾巴的引物，即TP-M13引 物。所述4對(duì)核心SSR引物序列如下：
[0040]
[0041] 利用上述SSR引物組構(gòu)建麥芽品種指紋圖譜的方法，包括以下步驟：
[0042] (1)提取供試樣品DNA
[0043] 取單粒麥芽樣品于1. 5ml離心管中，約25-45mg，加入7-8mm鋼珠，利用Th