金針菇f101菌種的ssr標(biāo)記引物及其指紋圖譜應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及菌種檢測(cè)鑒定領(lǐng)域，具體為一種金針茹F101菌種的SS財(cái)示記引物及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 金針茹(Flammulina velutipes(F;r. )Sing.)隸屬于真菌口，擔(dān)子菌亞口，層菌綱， 無(wú)隔擔(dān)子菌亞綱，傘菌目，口磨科，小火焰菌屬，因形似金針菜而得名。金針茹又稱構(gòu)菌、、金 茹、攝茸、毛柄金錢菌和冬茹。金針茹的自然分布很廣泛。金針茹作為一種食用菌，是當(dāng)今市 場(chǎng)上十分走俏的天然保健食品之一。白金針茹蛋白質(zhì)含量高，氨基酸種類豐富，具有抗癌功 能，經(jīng)常食用具有預(yù)防高血壓、治療肝病和胃潰瘍等功效。金針茹特別W富含賴氨酸而著 稱，可W活化神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)智力發(fā)育，素有"增智茹"之美稱。金針茹也是中國(guó)主要栽培食 用菌和現(xiàn)代工廠化生產(chǎn)主要食用菌之一，2013年國(guó)內(nèi)工廠化日生產(chǎn)量達(dá)到2700噸。
[0003] 優(yōu)質(zhì)菌種在金針茹單產(chǎn)和質(zhì)量中的貢獻(xiàn)率舉足輕重，運(yùn)決定了金針茹菌種在金針 茹產(chǎn)業(yè)中的重要地位。1999年我國(guó)簽署了《國(guó)際植物新品種保護(hù)法》，運(yùn)不僅要求我們尊重 其它國(guó)家的品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)，同時(shí)也要加強(qiáng)保護(hù)我們國(guó)家自己的品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)，為了建立食 用菌新品種登記制度來(lái)真正保護(hù)我國(guó)的品種產(chǎn)權(quán)，必須首先建立成熟的品種鑒定技術(shù)，為 新品種登記奠定基礎(chǔ)。尤其日本2004年4月1日開始實(shí)行《種苗法修正案》，對(duì)我國(guó)食用菌尤 其是金針茹的生產(chǎn)構(gòu)成了極大的威脅。就國(guó)內(nèi)而言，金針茹栽培菌種"同種異名，異種同 名"的現(xiàn)象，不僅給茹農(nóng)帶來(lái)了極大的損失，影響了他們的栽培積極性，也極大地影響了中 國(guó)金針茹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展;而且，隨著大規(guī)模的工廠化栽培方式的出現(xiàn)，對(duì)金針茹栽培菌株質(zhì) 量的要求越來(lái)越高，需要發(fā)展更為簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的菌株鑒定技術(shù)，W保證每批次的用種 都準(zhǔn)確無(wú)誤。面對(duì)運(yùn)種局勢(shì)，就需要我們進(jìn)一步加快菌種鑒定技術(shù)的研究，在金針茹的研究 中建立更為有效的菌種鑒定體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種金針茹F101菌種的SS財(cái)示記及指紋圖譜應(yīng)用。該標(biāo)記 與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)、括抗試驗(yàn)、出茹試驗(yàn)相比，具有檢測(cè)時(shí)間短，準(zhǔn)確 性高，重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。
[0005] 本發(fā)明第一目的在于提供一種金針茹F101菌種的SS財(cái)示記引物，所述標(biāo)記引物由 名稱為Fvml，尸￥1112、尸￥1]13、尸￥1]14、尸￥1]15、尸￥1116的6對(duì)851?引物中至少一對(duì)構(gòu)成；所述6對(duì)引物的正 反核巧酸序列如下： Fvml:GAGGCGTCACCAAGGGATG，CTCAAAGGAATGCGCTGCA; Fvm2：TTTCGCGCAGGTTTGG,TTGTGAGGGGACGGGTATG； Fvm3:GTGAAGAAGAATAAGAGGGAGC，TGAGACTAGTGATGACGATGAAG; Fvm4:TCATCTGTCCATTCATCATCA，GTTCAACACATTCACGCAA; Fvm5:CAGCCCATTTTTCCACCC，CGAAGATTCCATTGACGATTTC; Fvm6：CATTGTTCCTTCAGTCCGAGA,TTCCATCCGAATCCGTAGC 〇
[0006] FlOl是浙江省農(nóng)科院育成的黃色工廠化金針茹品種，該品種，桿直較整齊，周期短 (比白色品種工廠化快4天）、首潮產(chǎn)量稍低，但其仍有潛力，一般工廠化品種僅可收一巷，該 菌株可W采收兩巷，回潮快，二潮產(chǎn)量可接近第一潮，品質(zhì)接近。
[0007] 本發(fā)明的第二目的在于提供一種金針茹F101菌種的SSR標(biāo)記引物通過(guò)指紋圖譜在 菌種檢測(cè)鑒定中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的第Ξ目的在于提供該應(yīng)用的具體步驟，步驟如下： (1) 菌絲培養(yǎng):將金針茹菌種轉(zhuǎn)接到馬鈴馨葡萄糖培養(yǎng)基中，18°C~20°C下避光搖瓶培 養(yǎng)，5d-7d后收集菌絲； (2) 基因組DNA的提取：用CTAB(十六烷基Ξ甲基漠化錠）法提取上述菌絲的基因組 DNA，紫外分光光度法檢測(cè)總基因組DNA濃度和純度，調(diào)整樣品DNA的濃度一致； (3 ) SSR分子標(biāo)記的檢測(cè):對(duì)上述提取的DNA進(jìn)行基因 SSR標(biāo)記的PCR擴(kuò)增； PCR擴(kuò)增體系為：總體積20化，包括：10XPCR buffer化L，25mmol/L MgC12化L， lOmmol/L dNTP 0.化L，抓/μL Taq DNA酶0.化L，10ymol/L SSR標(biāo)記正向引物和反向引物總 體積各1.化L，濃度20ng~3化g/化提取的模板DNA化L，dd肥0 lO.^L PCR反應(yīng)條件:94°C5min; 94°C30second，W 引物的退火溫度30second，72°C30second， 30 個(gè)循環(huán);72°C5min; (4)電泳檢測(cè)：將上述PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物與化L加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣3.扣L于非變性 聚丙締酷胺凝膠上電泳，非變性聚丙締酷胺凝膠的體積百分比濃度為10%，電泳緩沖液為1 X TBE，電壓150v，電流200mA，功率200W，電泳45min，銀染，顯色，拍照，分析結(jié)果。
[0009] 巧)菌種鑒定:采用6對(duì)SSR引物對(duì)金針茹菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)照markerl可確 定各SSR引物擴(kuò)增的等位片段的數(shù)量和相對(duì)分子量，找到符合編號(hào)組合為：（1+化3)(1+2+ 3) (1+2) (1+2) 1(1+2)的菌種，即可確定該菌種為金針茹菌種。
[0010] 進(jìn)一步地，步驟(2)中CTAB法提取菌絲的基因組DNA工藝包括： ① 將液氮冷凍干燥的金針茹菌絲研磨成粉末，加入65°C預(yù)熱的2 X CTAB抽提液，于65°C 保溫45~60min，間或輕搖混勻； ② 12000rpm、4°C離屯、20min，取上清液； ③ 在上述上清液中加入體積比為25: 24:1的酪、氯仿和異戊醇的混合液，輕輕混勻 lOmin，12000巧m、4°C離屯、lOmin，取上清液移入離屯、管中； ④ 在上述離屯、管中加入體積比為24:1的氯仿和異戊醇混合液，輕輕混勻lOmin， 1200化pm、4°C離屯、lOmin，取上清液移入另一離屯、管中； @在上述離屯、管中加入2/^3體積(相對(duì)于步驟(4)中的上清液)的-20°〇預(yù)冷的異丙醇， 輕輕搖動(dòng)5min，8000巧m、4°C離屯、lOmin，去上清； ⑥ 將得到的沉淀用75vol%乙醇和lOmmol/L醋酸鐘洗涂2~3次，每次8000巧m，室溫離屯、 5min； ⑦ 加入預(yù)冷的95vol%乙醇，輕輕上下顛倒，80(K)rpm室溫離屯、lOmin，棄乙醇，真空抽干 或自然驚干； ⑧ 加入10化L 10 X TE(Tris/邸TA)緩沖液，輕輕敲打使沉淀溶解； ⑨ 加入化L lOmg/mL的RNaseA于37°C水浴比，去除RNA; ⑩ 將得到的DM提取物于-20°C冰箱膽藏備用； 進(jìn)一步地，重復(fù)實(shí)施步驟1-4Ξ次，驗(yàn)證準(zhǔn)確率。
[0011]進(jìn)一步地，步驟(4)中銀染的具體工藝為銀染的具體工藝為電泳完成后卸下并拆 開玻璃板，膠板卸下后，用去離子水水洗5-8秒，漸干水分后，在銀染液（1.5克硝酸銀和 1500ml水）中避光銀染8分鐘，銀染后，用去離子水水洗5-8秒，漸干水分，放入顯影液(16克 氨氧化鋼、1000ml水和8ml甲醒）中，至顯影后取出水洗后即可讀數(shù)。
[001引有益效果 本發(fā)明與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)、括抗試驗(yàn)、出茹試驗(yàn)相比，具有檢測(cè)時(shí)間短，準(zhǔn)確性高，重復(fù) 性好的優(yōu)點(diǎn)。檢測(cè)所需時(shí)間只需要3~4天，而常規(guī)的括抗試驗(yàn)所需時(shí)間至少需要兩周時(shí)間， 出茹試驗(yàn)則需要至少3個(gè)月的時(shí)間；該方法在所收集的我國(guó)25個(gè)通過(guò)國(guó)審的金針茹主栽菌 種中，具有F101菌種的專一性，具有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[001引圖巧金針茹F101菌種SSR標(biāo)記指紋圖譜（其中Μ是天根Markerl，數(shù)字代表的是所 用的6對(duì)SSR引物，C是空白對(duì)照，箭頭所指的是金針茹F101菌種的特異性SSR等位片段組 合)。
[0014]圖2為引物Fvm巧所選金針茹栽培材料中的擴(kuò)增圖譜。
[001引圖3為引物Fvm2在所選金針茹栽培材料中的擴(kuò)增圖譜。
[0016 ]圖4為引物Fvm3在所選金針茹栽培材料中的擴(kuò)增圖譜。
[0017] 圖5為引物Fvm4在所選金針茹栽培材料中的擴(kuò)增圖譜。
[0018] 圖6為引物Fvm5在所選金針茹栽培材料中的擴(kuò)增圖譜。
[0019 ]圖7為引物Fvm6在所選金針茹栽培材料中的擴(kuò)增圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)W便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠W很多 不同于在此描述的其它方式來(lái)實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做 類似推廣，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施例的限制。
[0021] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】做進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0022] 實(shí)施例1 在本實(shí)施例中，結(jié)合附圖1-7，對(duì)本發(fā)明的進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0023] 具體實(shí)驗(yàn)步驟如下： (1) 菌絲培養(yǎng):將金針茹菌種轉(zhuǎn)接到馬鈴馨葡萄糖培養(yǎng)基中，18°c~20°C下避光搖瓶培 養(yǎng)，5d-7d后收集菌絲； (2) 基因組DNA的提取：用CTAB(十六烷基Ξ甲基漠化錠）法提取上述菌絲的基因組 DNA，紫外分光光度法檢測(cè)總基因組DNA濃度和純度，調(diào)整樣品DNA的濃度一致； 其中，CTAB法提取菌絲的基因組DNA工藝包括： ①將液氮冷凍干燥的金針茹菌絲研磨成粉末，加入65°C預(yù)熱的2 X CTAB抽提液，于65°C 保溫45~60min，間或輕搖混勻； ② 12000rpm、4°C離屯、20min，取上清液； ③ 在上述上清液中加入體積比為25: 24:1的酪、氯仿和異戊醇的混合液，輕輕混勻 lOmin，1