一種李輻射變異材料的早期鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于育種鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種輻射育種材料早期鑒定的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 輻射誘變育種是指人為地利用一定劑量的物理射線照射植物材料誘發(fā)使其變異， 并經(jīng)過人工選擇、鑒定、培育新的品種。輻射誘變是培育果樹新種質(zhì)和新品種的有效途徑。 果樹輻射誘變育種可以提高果樹基因突變頻率，縮短育種年限，可以在短期內(nèi)獲得常規(guī)育 種難以獲得的新種質(zhì)。然而，在輻射育種過程中，僅有部分材料發(fā)生了變異。果樹生長周期 較長，采用傳統(tǒng)的植物學(xué)特征形態(tài)鑒定法和花粉顯微電鏡掃描法等方法進(jìn)行變異材料的鑒 定較為困難。分子標(biāo)記技術(shù)以其快速、高效、中性的特點(diǎn)在育種材料早期選擇等方面日益顯 示出重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種進(jìn)行李輻射誘變材料早期鑒定的方法，加快李育種進(jìn) 程，降低育種成本。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 1.葉片采集：采集李母樹和輻射誘變植株的嫩葉。
[0005] 2.李葉片基因組DNA提取與檢測：采用傳統(tǒng)CTAB法或植物基因組DNA提取試劑 盒進(jìn)行李葉片基因組DNA的提取。取5yL DNA溶液用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA純度 檢測，電泳緩沖液為IX TAE Buffer，電泳20min后，凝膠用核酸染料進(jìn)行染色，并用凝膠成 像系統(tǒng)儀進(jìn)行凝膠圖像采集。最后將各材料的DNA濃度稀釋至40ng/ y L備用。
[0006] 3.卩0?反應(yīng)體系屮0?11^1〇1^，引物0.8 1^，模板11^，水8.2 1^，總體積為 20yL。PCR反應(yīng)程序?yàn)槌绦驗(yàn)椋?4°C預(yù)變性5 min;94°C變性30 s，50°C退火30 s，72°C延 伸1 min，35個循環(huán)；最后72°C延伸10 min。
[0007] 4.ISSR引物篩選：以部分材料的基因組DNA為模板，進(jìn)行ISSR適宜引物篩選。
[0008] 5.李輻射誘變材料的ISSR分析：以篩選出的引物進(jìn)行李輻射誘變材料DNA 的ISSR-PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，電泳緩沖液為1XTAE Buffer，電泳30min后，凝膠用核酸染料進(jìn)行染色，并用凝膠成像系統(tǒng)儀進(jìn)行凝膠圖像采 集。
[0009] 6.凝膠圖像分析：將輻射誘變李材料DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶，與母樹的條帶逐 一進(jìn)行比對。
[0010] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明提供的方法可以對李輻射誘變材料進(jìn)行早期鑒定，操 作方便，簡單易行，成本低廉。無需通過長時間的表型觀察，僅需取少量輻射誘變植株的葉 片，即可在早期將未發(fā)生的材料剔除，節(jié)約育種成本。
【附圖說明】
[0011] 圖1三月李及其突變體果實(shí)。其中A、B、C為三月李果實(shí)；D、E、F為突變體果實(shí)。 黑色粗線長度為lcm。
[0012] 圖2 ISSR引物篩選電泳圖譜，1 -22分別代表引物UBC811、UBC815、UBC816、 UBC821、UBC823、UBC825、UBC826、UBC827、UBC829、UBC836、UBC841、UBC842、UBC846、UBC847、 UBC848、UBC850、UBC853、UBC854、UBC855、UBC856、UBC857、UBC860 的擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0013] 圖3三月李I(lǐng)SSR-PCR電泳圖譜，1 :三月李；2 :紅肉遲熟突變單株；3-7代表5個 表型未發(fā)生顯著變異的輻射誘變的三月李材料。箭頭表示存在差異的條帶。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 實(shí)施例1 1.葉片采集：采集三月李、輻射遲熟紅肉突變體以及5個表型未發(fā)生顯著變異的輻射 誘變的三月李材料的嫩葉。三月李母樹及其突變體果實(shí)的性狀如下圖1。
[0015] 2.李葉片基因組DNA提取與檢測：植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN，北京)進(jìn) 行三月李葉片DNA提取。取5 y L DNA溶液用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA純度檢測，電 泳緩沖液為1 XTAE Buffer，電泳20min后，凝膠用核酸染料進(jìn)行染色，并用凝膠成像系統(tǒng) 儀進(jìn)行凝膠圖像采集。最后將各材料的DNA濃度稀釋至40ng/ y L備用。
[0016] 3.PCR反應(yīng)體系：商品化PCR mix 10 yL，引物0.8yL，模板lyL，水8.2yL，總 體積為20yL。PCR反應(yīng)程序?yàn)槌绦驗(yàn)椋?4°C預(yù)變性5 min;94°C變性30 s，50°C退火30 s， 72°C延伸1 min，35個循環(huán)；最后72°C延伸10 min。
[0017] 4. ISSR 引物篩選： 根據(jù)前人的李I(lǐng)SSR研究結(jié)果，初步選擇22條引物(表1)用于引物篩選。以三月李母樹 的基因組DNA為模板，進(jìn)行ISS R適宜引物篩選。如圖2所示，經(jīng)篩選共確定14條多態(tài)性好、 擴(kuò)增條帶清晰的引物（UBC811、UBC815、UBC816、UBC826、UBC827、UBC829、UBC836、UBC841、 UBC846、UBC847、UBC848、UBC855、UBC856、UBC857)，用于后續(xù)分析。
[0018] 表1三月李I(lǐng)SSR分析所用引物
5.李輻射誘變材料的ISSR分析：以篩選出的引物進(jìn)行三月李、輻射遲熟紅肉突變體以 及5個表型未發(fā)生顯著變異的輻射誘變材料DNA的ISSR-PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂 糖凝膠電泳進(jìn)行分離，電泳緩沖液為1 XTAE Buffer，電泳30min后，凝膠用核酸染料進(jìn)行 染色，并用凝膠成像系統(tǒng)儀進(jìn)行凝膠圖像采集，結(jié)果見圖3。
[0019] 6.凝膠圖像分析：將輻射誘變李材料DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶，與母樹的條帶逐 一進(jìn)行比對。從圖3可以看出，紅肉突變體和母樹的ISSR指紋圖譜之間存在很大的差異，而 其他輻射誘變材料與母樹的ISSR指紋圖譜之間無明顯差異。引物UBC811、UBC816、UBC826、 UBC829、UBC847、UBC855、UBC856和UBC857可將紅肉突變體和母樹區(qū)分開。
[0020] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種李輻射變異材料的早期鑒定方法，其特征在于：所述的方法包括葉片采集、李 葉片基因組DNA提取與檢測、PCR反應(yīng)體系、ISSR引物篩選、李輻射誘變材料的ISSR分析、 凝膠圖像分析。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種李輻射變異材料的早期鑒定方法，其特征在于：具體包 括以下步驟： 1) 葉片采集：采集李母樹和輻射誘變植株的嫩葉； 2) 李葉片基因組DNA提取與檢測：采用傳統(tǒng)CTAB法或植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn) 行李葉片基因組DNA的提取，取5 y L DNA溶液用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA純度檢測， 電泳緩沖液為I XTAE Buffer，電泳20min后，凝膠用核酸染料進(jìn)行染色，并用凝膠成像系 統(tǒng)儀進(jìn)行凝膠圖像采集，最后將各材料的DNA濃度稀釋至40ng/ y L備用； 3. PCR反應(yīng)體系：PCR mix 10 yL，引物0. 8yL，模板lyL，水8. 2yL，總體積為20yL， PCR反應(yīng)程序?yàn)槌绦驗(yàn)椋?4°C預(yù)變性5 min;94°C變性30 s，50°C退火30 s，72°C延伸I min， 35個循環(huán)；最后72°C延伸10 min ; 4. ISSR引物篩選：以部分材料的基因組DNA為模板，進(jìn)行ISSR適宜引物篩選； 5) 李輻射誘變材料的ISSR分析：以篩選出的引物進(jìn)行李輻射誘變材料DNA的 ISSR-PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，電泳緩沖液為IXTAE Buffer，電泳30min后，凝膠用核酸染料進(jìn)行染色，并用凝膠成像儀進(jìn)行凝膠圖像采集； 6) 凝膠圖像分析：將輻射誘變李材料DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶，與母樹的條帶逐一進(jìn) 行比對。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種輻射育種材料早期鑒定的方法，屬于育種鑒定技術(shù)領(lǐng)域，所述的方法包括葉片采集、李葉片基因組DNA提取與檢測、PCR反應(yīng)體系、ISSR引物篩選、李輻射誘變材料的ISSR分析、凝膠圖像分析。在輻射育種過程中，僅有部分材料發(fā)生了變異。果樹生長周期較長，采用傳統(tǒng)的植物學(xué)特征形態(tài)鑒定法和花粉顯微電鏡掃描法等方法進(jìn)行變異材料的鑒定較為困難。本發(fā)明提供的方法可以對李輻射誘變材料進(jìn)行早期鑒定，操作方便，簡單易行。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105063197
【申請?zhí)枴緾N201510472545
【發(fā)明人】方智振, 葉新福, 周丹蓉, 潘少霖, 姜翠翠
【申請人】福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年8月5日