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      一種快速檢測灰葡萄孢菌對sdhi類殺菌劑抗性的方法及引物組合物的制作方法

      文檔序號:9344382閱讀:756來源:國知局
      一種快速檢測灰葡萄孢菌對sdhi類殺菌劑抗性的方法及引物組合物的制作方法
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及基于環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性的方法及引物組 合物,可用于灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性群體發(fā)展的動態(tài)監(jiān)測與抗性風險評估,為作 物灰霉病的抗性治理、流行預(yù)警及合理用藥指導提供重要的理論依據(jù)。
      【背景技術(shù)】
      [0002] 灰霉病是一類由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的植物真菌病害,可危害 200多種蔬菜、果樹以及觀賞性植物等重要的經(jīng)濟作物,該病的發(fā)生可引起植物幼苗、果實 及貯藏器官的猝倒、落葉、花腐、爛果及爛窯,造成嚴重的經(jīng)濟損失。近年來,隨著保護地蔬 菜生產(chǎn)的發(fā)展,加重了灰霉病的發(fā)生和流行。目前由于作物種質(zhì)資源缺少高抗灰霉病的品 種,采用化學藥劑是控制灰霉病最有效方便的途徑之一。多年來,灰霉病主要采用苯并咪 唑類、二甲酰亞胺類、嘧啶胺類、酰胺類、甲氧基丙烯酸酯類(Qols)、琥珀酸脫氫酶抑制劑類 (SDHI)等化學藥劑進行防治,但隨著使用年限的增長和使用劑量的增加,田間逐漸產(chǎn)生了 抗藥性群體,從而導致該病防效顯著下降?;移咸焰呔鷮ΤS脷⒕鷦┛顾幮缘谋O(jiān)測不僅能 應(yīng)用于作物灰霉病的抗藥性流行預(yù)警,而且也能為作物灰霉病的抗性治理提供用藥指導。 傳統(tǒng)的殺菌劑抗性檢測或監(jiān)測的方法主要是通過分離培養(yǎng)病原菌,然后在含藥培養(yǎng)基上培 養(yǎng),根據(jù)藥劑對菌絲生長的抑制作用鑒定是否為抗藥性菌株,該方法檢測周期較長,從分離 到鑒定長達1周,甚至數(shù)周,且在病原菌培養(yǎng)過程中存在雜菌污染,給實驗結(jié)果帶來誤差; 同時,還需投入大量的人力資源,增加檢測成本。近年來,隨著核酸相關(guān)分子檢測技術(shù)的發(fā) 展,PCR技術(shù)為植物病原菌的抗藥性檢測提供了快速、靈敏、準確的優(yōu)勢,但是檢測需要昂貴 的實驗儀器及繁瑣的電泳過程,檢測時間長,檢測成本高昂等,不能滿足經(jīng)濟高效檢測的需 求,并且在鑒定過程中還需要接觸大量有毒有害試劑,對實驗操作人員存在較大的安全隱 患。因此,開發(fā)對植物病原菌抗藥性檢測的新技術(shù)已迫在眉睫。
      [0003] 環(huán)介導恒溫擴增反應(yīng)(LAMP)是2000年由日本學者Notomi等發(fā)明的一種新穎的 恒溫核酸體外擴增技術(shù),廣泛應(yīng)用于動物、植物等疾病的基因診斷。該技術(shù)原理是:利用一 套(4種)特異性引物,在一種高活性鏈置換DNA聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應(yīng), 60~65°C范圍60min內(nèi),大量合成目標DNA的同時伴隨有副產(chǎn)物--白色的焦磷酸鎂沉淀 產(chǎn)生。羥基萘酚藍(HNB)是一種金屬離子指示劑,根據(jù)反應(yīng)液中鎂離子的變化而呈現(xiàn)出不 同的顏色,陰性(沒有擴增出產(chǎn)物)時為紫色,陽性(有產(chǎn)物擴增)時為天藍色。LAMP方法 的最大特點就是實現(xiàn)恒溫擴增,不需要循環(huán)儀等昂貴的儀器;擴增反應(yīng)極快;擴增產(chǎn)生的 產(chǎn)物量大,通過肉眼即可判定結(jié)果,不需要繁瑣的電泳過程;靈敏度高、特異性強;操作簡 便、快捷,極適于病原的快速診斷及抗性檢測。
      [0004] 經(jīng)過多年的研究發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑的抗藥性主要是由灰葡萄孢 菌琥珀酸脫氫酶基因B亞基(SdhB)突變造成,該基因編碼第225、230或272位氨基酸 密碼子的突變可引起灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗藥性的產(chǎn)生。225位氨基酸突變的 基因型為P225Y(CCC -TTC) ;230為氨基酸突變的基因型為N230I(AAC -ATC) ;272位 氨基酸的突變可分為3種突變基因型,分別為H272R(CAC - TAC)、H272Y(CAC - CGC)和 H272L(CAC - CTC)。5 種突變基因型 P225Y、N230I、H272R、H272Y 和 H272L 約占抗性突變 類型的比例分別為5. 26%、8. 77%、68. 42%、15. 79%和1. 75%。因此,在本發(fā)明中,依據(jù)灰 葡萄孢菌琥珀酸脫氫酶基因B亞基(SdhB)272位氨基酸的3種突變基因型(H272R/H272Y/ H272),基于環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)(LAMP)建立了灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性的快速分 子檢測技術(shù)。該檢測技術(shù)具有簡單、快速、成本低,靈敏性高等特點,能大大提高檢測效率, 對灰霉病的有效防治、抗藥性流行預(yù)警具有重要的現(xiàn)實意義。然而,經(jīng)檢索目前國內(nèi)外尚未 有灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗藥性菌株的LAMP快速分子檢測的相關(guān)報道。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0005] 已報道的灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性菌株的鑒定及檢測方法存在費時、費 力、成本高的缺點。針對這一缺點,根據(jù)灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性菌株的基因型,通 過實驗條件優(yōu)化,建立了一種快速檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性菌株的方法。該方 法具有簡便、快速、省時省力、靈敏度高、檢測成本低等特點,對灰霉病的抗藥性監(jiān)測、控制 病害發(fā)生與流行、指導合理用藥及減少經(jīng)濟損失具有實用價值。目前在國內(nèi)外,本發(fā)明是 LAMP技術(shù)在檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性的首次報道。
      [0006] 田間采集的SDHI類殺菌劑抗性灰葡萄孢菌株約86%的突變類型是由于灰葡萄孢 菌琥珀酸脫氫酶基因B亞基(SdhB)第272位氨基酸密碼子突變造成的。該位點的突變可 分為 3 種突變基因型,分別為 H272R(CAC - TAC)、H272Y(CAC - CGC)和 H272L(CAC - CTC)。 本發(fā)明所述的快速檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性菌株的分子生物學方法,可同時 檢測上述3種突變基因型,本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):
      [0007] SEQIDNO. 1所示的灰葡萄孢菌琥珀酸脫氫酶基因B亞基作為靶標在LAMP檢測灰 葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性中的應(yīng)用。
      [0008] 用于檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性的LAMP引物組合物:由SEQIDN0. 2 所示的正向內(nèi)引物FIP、SEQIDNO. 3所示的反向內(nèi)引物BIP、SEQIDNO. 4所示的正向外引 物F3、SEQIDN0. 5所示的反向外引物B3、SEQIDN0. 6所示的環(huán)引物LF組成。
      [0009] 本發(fā)明所述的LAMP引物組合物在檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性中的應(yīng) 用。
      [0010] 本發(fā)明所述的LAMP引物組合物在制備灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性LAMP檢 測試劑盒中的應(yīng)用。
      [0011] -種檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性的LAMP檢測試劑盒,含有本發(fā)明所述 的引物組合物。
      [0012] 本發(fā)明所述的檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性的LAMP檢測試劑盒,包含 的檢測溶液為:240U/mLBstDNA聚合酶,20mMTris-HCl,10mMKCl,10mM(NH4)2S04,2mM MgS04,0.1%TritonX-100,2.0mMMgCl2,0.6mMdNTPs,0.32M甜菜堿,0.2mM羥基溴酚藍 (HNB),0. 8yM正向內(nèi)引物FIP,0. 8yM反向內(nèi)引物BIP,0. 2yM正向外引物F3,0. 2yM反向 外引物B3,0. 4yM環(huán)引物LF,加入無菌超純水制備得到。
      [0013] -種檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性的LAMP試劑盒在檢測灰葡萄孢菌對 SDHI類殺菌劑抗性中的應(yīng)用。
      [0014] -種檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性的LAMP檢測方法,取待檢灰葡萄孢菌 的DNA為模板,利用本發(fā)明的引物組合物或本發(fā)明所述的LAMP檢測試劑盒進行LAMP擴增, 擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,在紫外光下檢測結(jié)果,若存在梯狀條帶,則證明所檢測灰葡 萄孢菌為灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑272位抗性突變型菌株;若無梯狀條帶,則證明所檢 測灰葡萄孢菌為非272位抗性突變型菌株;或觀察LAMP反應(yīng)溶液顏色變化,若為天藍色,判 定為灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑272位抗性突變型菌株;若為紫色,判定為非272位抗性 突變型菌株。
      [0015] 本發(fā)明所述的檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性的LAMP檢測方法,LAMP反應(yīng) 參數(shù)為 59 ~61°C,15 ~120min。
      [0016] 本發(fā)明提供的快速檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性的分子生物學方法,具 有靈敏度高,特異性強等特點,與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的有益結(jié)果是:
      [0017] 1、簡便易行:該檢測方法通過恒溫水浴鍋或有穩(wěn)定熱源的設(shè)備就能進行實驗,通 過反應(yīng)產(chǎn)物顏色變化即可判定結(jié)果,省去了昂貴的儀器設(shè)備及繁瑣的電泳操作過程;
      [0018] 2、檢測高效性:該檢測方法所用檢測時間僅需45min,當加入環(huán)引物LF后,15min 就可以完成檢測,大大提高了檢測效率,而傳統(tǒng)的室內(nèi)生物測定法需要幾天時間,PCR檢測 需要繁瑣的電泳過程,也要數(shù)小時;
      [0019] 3、靈敏度高:將構(gòu)建的質(zhì)粒載體稀釋成不同的濃度,作為模板,進行靈敏度檢測, 最低檢測下限為普通PCR檢測下限的100倍;
      [0020] 4、特異性強:該方法通過2對引物特異性識別靶序列上的6個獨立區(qū)域,相對于 PCR引物識別靶序列的2個獨立區(qū)域而言,特異性大大提高,假陽性出現(xiàn)的概率也隨之降 低;
      [0021] 5、準確性高:該方法幾乎不受反應(yīng)混合液中存在的大量外源DNA和雜質(zhì)的影響, 不需要從樣本中純化DNA,可直接利用發(fā)病組織及病殘體提取DNA進行快速檢測,大大提高 檢測準確度;
      [0022] 6、本發(fā)明是針對灰葡萄孢菌琥珀酸脫氫酶基因B亞基(SdhB)第272位氨基酸的 3種突變類型進行同時檢測,均能表現(xiàn)出較好的特異性,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的抗性監(jiān)測和抗性流 行預(yù)警具有重要的應(yīng)用前景;
      [0023] 7、本發(fā)明是國內(nèi)外首次利用LAMP技術(shù)對SDHI類殺菌劑抗性的灰葡萄孢菌株進行 檢測,這種方法簡便快捷,對抗性菌株的準確診斷、及時了解抗性群體發(fā)展動態(tài)、指導科學 用藥、降低成本及減少環(huán)境污染具有重要的現(xiàn)實意義;
      【附圖說明】
      [0024] 圖1 :LAMP檢測的反應(yīng)溫度優(yōu)化
      [0025] 圖2 :LAMP檢測的反應(yīng)時間優(yōu)化
      [0026] 圖3 :LAMP檢測的靈敏度優(yōu)化
      [0027] 圖4 :LAMP檢測的重復(fù)性優(yōu)化。圖中顯示第1-3管呈紫色,為陰性;4-15管呈天 藍色,為陽性。其中,1-3為灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑的敏感菌株;4-7為灰葡萄孢菌對 SDHI類殺菌劑的H272R突變基因型菌株;8-11為灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑的H272Y突 變基因型菌株;12-1
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