專利名稱：枯草桿菌酶變異體和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的突變體蛋白酶或酶變異體，它們可用于配制去污劑組合物和表現(xiàn)增強(qiáng)的蛋白自身酶解穩(wěn)定性；涉及含該酶的清潔用組合物和去污劑組合物；涉及當(dāng)插入到合適的宿主細(xì)胞或生物體中時(shí)編碼該酶表達(dá)的突變的基因；以及涉及這些經(jīng)轉(zhuǎn)化并能夠表達(dá)該酶變異體的宿主細(xì)胞。
背景技術(shù)：
在去污劑工業(yè)中，酶在洗滌制劑中已應(yīng)用了30多年。在這些制劑中使用的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶以及其它的酶或其混合物。商業(yè)上最重要的酶是蛋白酶。
盡管蛋白酶已在去污劑工業(yè)中應(yīng)用了30多年，但是有關(guān)這些酶如何與底物和/或與存在于如去污劑組合物中的其它底物相作用的細(xì)節(jié)還有許多未知的東西。一些涉及蛋白酶特殊殘基的因素和影響蛋白酶的特定性質(zhì)如通常的氧化和熱穩(wěn)定性的因素已被闡明，但仍有許多有待發(fā)現(xiàn)。而且，還不能確切知道在一種特定去污劑組合物中究竟是何種物理或化學(xué)特性與好的洗滌效果或蛋白酶的穩(wěn)定性有關(guān)。
目前使用的蛋白酶大部分是從自然界中分離蛋白酶并在去污劑制劑中進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的。
目前至少下列蛋白酶是已知可商業(yè)化得到的，其中許多是在世界上許多國家大量銷售的。
枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)BPN′或NOVO(可購自如SIGMA公司，美國圣.路易斯)，以及枯草桿菌蛋白酶Carlsberg,ALCALASE(NOVO NORDISK A/S)和MAXATASE(Genencor)。
一種遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)枯草桿菌蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶309，由NOVO NORDISK A/S作為SAVINASE銷售。該酶的一種蛋白質(zhì)工程變異體作為DURAZYM銷售。
與SAVINASE極為相似的酶，如枯草桿菌蛋白酶PB92，由Genencor公司銷售的MAXACAL(這種酶的一種蛋白質(zhì)工程變異體作為MAXAPEM銷售)，由SOLVAY et Cie公司銷售的OPTICLEAN，和GENENCOR國際公司銷售的PURAFECT。
一種遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶147，由NOVO NORDISK A/S作為ESPERASE銷售。
越來越多的商業(yè)化應(yīng)用的蛋白酶是天然產(chǎn)生的野生型蛋白酶的蛋白質(zhì)工程變異體，如DURAZYM(NOVO NORDISK A/S),RELASE(NOVO NORDISK A/S),MAXAPEM(Gist-Brocades N.V.公司)，PURAFECT(GENENCOR國際公司)。
所以，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供改良的蛋白質(zhì)工程蛋白酶變異體，特別是適用在去污劑工業(yè)中。蛋白酶斷裂蛋白質(zhì)底物中的酰胺鍵的酶被歸類為蛋白酶，或(可互換地)肽酶(參考Walsh,1979，酶反應(yīng)機(jī)制(Enzymatic Reaction Mechanisms),W.H.Freeman和Company,San Francisco，第三章)。芽孢桿菌種的細(xì)菌分泌兩種胞外型蛋白酶，即中性蛋白酶(或金屬蛋白酶)和堿性蛋白酶，其中功能上最重要的是絲氨酸內(nèi)肽酶并通常稱為枯草桿菌蛋白酶。絲氧酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶是一種催化肽鍵水解的酶，并且其中在活性位置中有一個(gè)必需絲氨酸殘基(White,Handler和Smith,1973生物化學(xué)原理(Principles of Biochemistry)第五版，McGraw-Hill出版公司，紐約，第271-272頁)。
細(xì)菌的絲氨酸蛋白酶具有20000到45000道爾頓范圍的分子量。它們被二異丙基氟磷酸抑制。它們水解簡單的末端酯類，在活力上與真核胰凝乳蛋白酶類似(它也是一種絲氨酸蛋白酶)。一個(gè)較窄的術(shù)語，堿性蛋白酶，包括一個(gè)亞組，反應(yīng)這些絲氨酸蛋白酶的最適pH較高，從pH9.0到11.0(參考Priest(1977)，細(xì)菌學(xué)綜述(Bacteriological Rev.)41.711-753)?？莶輻U菌酶被嘗試地定名為枯草桿菌酶的絲氨酸蛋白酶的一個(gè)亞組已由Siezen等在“蛋白質(zhì)工程”(Protein Engng.)4(1991)719-737)中提出。它們是根據(jù)以前稱為類枯草桿菌蛋白酶的絲氨酸蛋白酶的40多個(gè)氨基酸序列同源性分析而定義的。由革蘭氏陽性細(xì)菌或真菌產(chǎn)生的枯草桿菌蛋白酶以前被定義為絲氨酸蛋白酶，如今根據(jù)Siezen等的定義為枯草桿菌酶的一個(gè)亞組。大量的枯草桿菌蛋白酶已被鑒定，而且許多枯草桿菌蛋白酶的氨基酸序列已被測定。它們包括由芽孢桿菌菌種產(chǎn)生的多于六種的枯草桿菌蛋白酶，即枯草桿菌蛋白酶168，枯草桿菌蛋白酶BPN′，枯草桿菌蛋白酶Carlsberg，枯草桿菌蛋白酶Y，枯草桿菌蛋白酶Amylosaccharitiaus，以及mesentericopeptidase(Kurihara等(1972)，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.),247 5629-5631；Wells等，(1983)核酸研究(Nacleic Acids Res.11 7911-7925)；Stahl和Ferrari(1984)細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)159 811-819；Jacobs等(1985)核酸研究，13 8913-8926；Nedkov等(1985)生物化學(xué)(Biol.Chem.Hoppe-Seyler 366 421-430；Svendsen等(1986)FEBS Lett.196,228-232)，一種來自放線菌目的枯草桿菌蛋白酶，來自普通高溫放線菌(Thermoactinomyces vulgaris)的thermitase(Meloun等(1985)FEBS Lett.198 195-200)，和一種真菌枯草桿菌蛋白酶，來自Tritirachium album的蛋白酶K(Jany和Mayer(1985)生物化學(xué)，366 584-492)。為作進(jìn)一步參考，下面復(fù)制了Siezen等中的表Ⅰ。
已經(jīng)從物理上和化學(xué)上詳細(xì)表征了枯草桿菌蛋白酶的特征。除了這些酶的一級結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)的知識以外，還測定了枯草桿菌蛋白酶的50多種高分辯率X-射線結(jié)構(gòu)，其描述了底物的結(jié)合、過渡狀態(tài)、產(chǎn)物，至少三種這些不同的蛋白酶抑制劑，以及說明了對天然變異體的結(jié)構(gòu)推斷(Kraut(1977)生物化學(xué)年度綜述(Ann.Rev.Biochem.)46331-358)。
枯草桿菌酶(subtilase)的一個(gè)亞組，I-S1，包括“經(jīng)典的”枯草桿菌蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶168，枯草桿菌蛋白酶BPN’，枯草桿菌蛋白酶Carlsberg(ALCALASE,NOVO NORDISK A/S)以及枯草桿菌蛋白酶DY。
另一個(gè)枯草桿菌酶的亞組，I-S2，是由Siezen等(出處同前)發(fā)現(xiàn)的。亞組I-S2蛋白酶被描述為高度堿性的枯草桿菌蛋白酶，包括如枯草桿菌蛋白酶PB92(MAXACAL,Gist-Brocades NV)，枯草桿菌蛋白酶309(SAVINASE,NOVO NORDISK A/S)，枯草桿菌蛋白酶147(ESPERASE,NOVO NORDISK A/S)，以及堿性彈性蛋白酶YaB。
枯草桿菌酶基因的隨機(jī)和定點(diǎn)突變都來自于對該酶的物理和化學(xué)性質(zhì)的了解，并歸因于涉及枯草桿菌酶的催化活力、底物特異性、三級結(jié)構(gòu)等信息(Wells等，(1987)美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A)84；1219-1223；Wells等(1986)Phil.Trans.R.Soc.Lond.A.317,415-423；Hwang和Warshel(1987)生物化學(xué)(Biochem.)26 2669-2637；Rao等(1987)自然(Nature)328 551-554)。
覆蓋這一領(lǐng)域的較新的出版物是Carter等，(1989)蛋白質(zhì)(Proteins)6,240-248，涉及切割底物中特定靶序列的變異體的設(shè)計(jì)(位點(diǎn)24和64)；Graycar等(1992)紐約科學(xué)院年報(bào)(Annals of the New YorkAcademy of Sciences)672,71-79，討論了一系列以前發(fā)表的結(jié)果；以及Takagi(1993)國際生化雜志(Int.J.Biochem.),25,307-312中也評述了以前的結(jié)果。
枯草桿菌蛋白酶基因的定點(diǎn)突變已引起很大的關(guān)注，以下專利申請和專利中描述了各種突變以前表征的蛋白酶變異體許多資料描述了蛋白酶變異體的構(gòu)建。為了對以前本領(lǐng)域的總體狀況較容易地加以綜觀，將參考資料分為兩部分。
第一部分文獻(xiàn)描述目前被認(rèn)為與本發(fā)明中公開的變異體無關(guān)的技術(shù)背景和蛋白酶變異體的鑒定。這些資料的引入主要是為了概述在為不同目的構(gòu)建蛋白酶變異體這一領(lǐng)域內(nèi)本領(lǐng)域的狀況。
第二部分文獻(xiàn)描述被認(rèn)為與本發(fā)明的變異體有某種相關(guān)性的蛋白酶變異體的鑒定。概述本領(lǐng)域的參考文獻(xiàn)(第一部分)EP130756(GENENTECH)(相應(yīng)于美國Reissue專利34,606(GENENCOR)涉及定點(diǎn)或隨機(jī)產(chǎn)生的“羰基水解酶”突變及隨后篩選具有不同性質(zhì)的突變的酶，如Kcat/km比值、pH-活力范圍和氧化穩(wěn)定性。這些公開文本要求了枯草桿菌蛋白酶BPN’在特定位點(diǎn)的定點(diǎn)突變，即-1Tyr,32Asp,155Asn,104Tyr,222Met,166Gly,64His,169Gly,189Phe,33Ser,221Ser,217Tyr,156Glu或152Ala，以提供性質(zhì)改變了的酶。因?yàn)槌宋稽c(diǎn)-1以外，所有這些位點(diǎn)在該申請?zhí)峤灰郧耙阎獏⑴c酶的功能，該申請無助于解決確定在何處引入突變以獲得特定所需性質(zhì)的酶這一問題。
EP214435(HENKEL)涉及枯草桿菌蛋白酶Carlsberg及其兩個(gè)突變體的克隆和表達(dá)。在該申請中未提供158Asp到158Ser和161Ser到161Asp的突變的原因。
在WO87/04461(AMGEN)中，設(shè)想減少在母體酶中的Asn-Gly序列的數(shù)目以獲得表現(xiàn)出增強(qiáng)的pH和熱穩(wěn)定性的突變的酶，該申請的重點(diǎn)放在去除、誘變或改造枯草桿菌蛋白酶BPN’中的109Asn和218Asn殘基。沒有舉出任何缺失或改造Gly-殘基的實(shí)施例。
WO87/05050(GENEX)公開了許多枯草桿菌蛋白酶BPN’突變體的隨機(jī)突變和隨后篩選大量的改善性質(zhì)的枯草桿菌蛋白酶BPN′突變體。在該申請中描述了在位點(diǎn)218Asn,131Gly,254Thr,166Gly,116Ala,188Ser,126Leu，和53Ser進(jìn)行的突變。
EP260105(GENENCOR)描述了對含有一個(gè)催化三體(Triad)的酶的某些性質(zhì)的改造，即通過從催化三體中選擇一個(gè)約15之內(nèi)的氨基酸殘基并用另一個(gè)殘基取代被選定的氨基酸殘基。本發(fā)明書中描述的枯草桿菌酶型的酶特定地指屬于含催化三體的一類酶。在枯草桿菌蛋白酶中位點(diǎn)222和217是替換的優(yōu)選位點(diǎn)。
而且，Thomas、Russell和Fersht(1985)在自然318,375-376中指出在枯草桿菌蛋白酶BPN’中將99Asp換成99Ser改變了該酶的pH依賴性。
在后一篇文章(1987)分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)193,803-813中，相同的作者還討論了用156Ser替換156Glu。
所有這些突變都在距活性64His約15的距離內(nèi)。
在自然328,496-500(1987)中，Russel和Fersht討論了他們實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并提出了通過誘變酶以獲得表面電荷的改變從而改變pH-活性范圍的規(guī)則。
WO88/08028(GENEX)和WO88/08033(AMGEN)都涉及在枯草桿菌蛋白酶BPN’的鈣結(jié)合位點(diǎn)上的氨基酸殘基的改造。據(jù)說通過用更多帶負(fù)電荷的殘基替代原來的殘基穩(wěn)定了該酶。
WO95/27049(SOLVAY S.A)描述了具有下列突變的一個(gè)枯草桿菌蛋白酶309型的蛋白酶N43R+N116R+N117R(BPN’編號)。數(shù)據(jù)顯示，與野生型相比，相應(yīng)的變異體具有更高的穩(wěn)定性。
WO95/30011、WO95/30010和WO95/29979(PROCTER&GAMBLE公司)描述了在枯草桿菌蛋白酶BPN’和枯草桿菌蛋白酶309中的6個(gè)區(qū)域，特別是位點(diǎn)199-220(BPN’編號)，其經(jīng)設(shè)計(jì)改變(即減小)酶對表面結(jié)合土的吸附。這提示減小酶對底物的吸附導(dǎo)致更佳的去污劑清潔效果。沒有提供任何變異體或特定去污劑洗滌效果的數(shù)據(jù)。與本發(fā)明具有某些相關(guān)性的以前表征的蛋白酶(第二部分)在EP251446(GENENCOR)中描述了如何應(yīng)用在初級和三級結(jié)構(gòu)上的同源分析以確定等效的氨基酸殘基的保留與否。其要求保護(hù)這種信息以及發(fā)明者對枯草桿菌蛋白酶BPN’的三級結(jié)構(gòu)的了解，這使得發(fā)明者選擇許多突變敏感位點(diǎn)以期獲得性質(zhì)改變的突變體。這些位點(diǎn)確定為124Met,222Met,104Tyr,152Ala,156Glu,166Gly,169Gly,189Phe,217Tyr,Also155Asn,21Tyr,22Thr,24Ser,32Asp,33Ser,36Asp,46Gly,48Ala,49Ser,50Met,77Asn,87Ser,94Lys,95Val,96Leu,107Ile,110Gly,170Lys,171Tyr,172Pro,197Asp,199Met,204Ser,213Lys,221Ser，這些位點(diǎn)是根據(jù)期望影響該酶的不同性質(zhì)而確定的。而且，列出了許多突變以支持這些建議。除了在這些位點(diǎn)的單突變外，發(fā)明者還進(jìn)行了大量多重突變。發(fā)明者進(jìn)一步確定了215Gly、67His、126Leu、135Leu和感興趣的片段97-103、126-129,213-215和152-172內(nèi)的氨基酸殘基，但是任何一個(gè)這些位點(diǎn)的突變都沒有舉例。
對本發(fā)明的意圖感興趣的是，EP251446的發(fā)明者建議替換170Lys(在枯草桿菌蛋白酶BPN’，類型I-S1中)，特別是他們建議在原來的Lys處引入Glu或Arg。產(chǎn)生了Glu變異體而且發(fā)現(xiàn)它對自身酶解性的降解高度敏感(參考第48,121,123頁(表ⅩⅪ包含一個(gè)明顯的錯(cuò)誤，但是說明自身酶解半壽期從86減小到13分鐘)和圖32)。
在WO89/06279(NOVO NORDISK A/S)中指出，位點(diǎn)170是感興趣的位點(diǎn)并建議用Tyr替代現(xiàn)有的殘基。然而，沒有給出關(guān)于這樣的變異體的數(shù)據(jù)。在WO91/00345(NOVO NORDISK A/S)中做了同樣的建議，并指出枯草桿菌蛋白酶309(類型I-S2)中位點(diǎn)170的Tyr變異體表現(xiàn)出在大約pH8時(shí)提高了去污劑的洗滌效果(變異體S003，在表Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅹ中)。相同的替換并結(jié)合其它位點(diǎn)的替換也顯示出提高了與所述申請一般概念相符的洗滌效果(s004,s011-s014,s022-s024,s019,s020,s203,s225,s227在相同的表和表Ⅶ中)。
在EP525 610 A1(SOLVAY)中建議通過減小在其上特定表面區(qū)域的親水性來提高酶對離子張力的穩(wěn)定性(一種與枯草桿菌蛋白酶PB92密切相關(guān)的I-S2型枯草桿菌酶)。建議在位點(diǎn)164(170，如果以BPN’編號)以Gln替換Arg。該申請中沒有公開含有這種替換的變異體。
在WO94/02618(GIST-BROCADES N.V.)中描述了I-S2型枯草桿菌蛋白酶PB92位點(diǎn)164(170，如果以BPN’編號)的許多變異體。給出的實(shí)施例說明了以Met、Val、Tyr和Ile替換原始的Arg。變異體的粉狀去污劑中的洗凈效果試驗(yàn)顯示略有改善。特別是Ile變異體對可可子的洗滌效果試驗(yàn)顯示提高了約20-30％。沒有提供穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。
在PCT/DK96/00207(未公開)中描述了許多提高了洗滌效果和/或貯存穩(wěn)定性的蛋白酶變異體。
發(fā)現(xiàn)通過將一個(gè)比原殘基更疏水的氨基酸殘基替換一個(gè)或多個(gè)母體枯草桿菌酶中或疏水結(jié)構(gòu)域附近的氨基酸殘基，可以獲得洗滌效果提高的枯草桿菌酶變異體，所說的疏水結(jié)構(gòu)域包括相應(yīng)于BLS309(BASBPN編號)的殘基I165、Y167、Y171的殘基，所說的在其附近的殘基包括相應(yīng)于BLS309(BASBPN編號)的殘基E136,G159,S16,R170,A19和G195的殘基(PCT/DK96/00207)。
US5.543.302描述了在不同野生型蛋白酶中重要的蛋白自身酶解切割位點(diǎn)的鑒定(MILEZYME,SAVINASE和ESPERASE)。
本發(fā)明重點(diǎn)在特定的蛋白酶變異體，此變異體影響在我們的未決專利申請PCT/DK96/00207中描述的一組蛋白酶變異體的蛋白自身酶解切割位點(diǎn)的位置。與US5.543.302中描述的相應(yīng)野生型蛋白酶的蛋白自身酶解降解模式相比，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的變異體表現(xiàn)出不同的蛋白自身酶解降解模式。
發(fā)明概述令人驚異地發(fā)現(xiàn)在位于相應(yīng)于BLS309(BASBPN編號)殘基P129、P131、E136、G159、S164、I165、Y167、R170、Y171的位點(diǎn)上的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行改造的枯草桿菌酶變異體與相應(yīng)的野生型相比，具有改變了的蛋白自身酶解降解模式?；镜母淖兪敲黠@位于殘基132-133(BASBPN編號)之間的自身酶解切割位點(diǎn)。
SAVINASE已知具有廣泛的底物特異性并且在充分溫育后在多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行自我切割。然而開始的1-5切割位點(diǎn)(初級位點(diǎn))與枯草桿菌蛋白酶的工業(yè)化應(yīng)用高度相關(guān)。
所說的位于殘基132-133的自身酶解切割位點(diǎn)現(xiàn)在據(jù)信是一個(gè)新的初級蛋白自身酶解切割位點(diǎn)?，F(xiàn)在相信這個(gè)蛋白自身酶解切割位點(diǎn)是被第一次確定為枯草桿菌蛋白酶中的初級蛋白自身酶解切割位點(diǎn)。作為進(jìn)一步詳細(xì)參考此處給出了一個(gè)有效實(shí)施例(參見下文)。
因而在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種枯草桿菌酶變異體，其特征在于衍生自在殘基132和133(BASBPN編號)之間具有蛋白自身酶解切割位點(diǎn)的前體枯草桿菌酶，其還通過在位于相應(yīng)于BLS309(BASBPN編號)殘基129、130、131、132、133、134、135、136位點(diǎn)上替換、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)殘基加以改造；籍此所說的變異體與該前體枯草桿菌酶相比表現(xiàn)出增強(qiáng)的蛋白自身酶解穩(wěn)定性。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種枯草桿菌酶變異體，其特征在于衍生自在相應(yīng)于BLS309(BASBPN編號)的殘基G159、S164、I165、Y167、R170、Y171位點(diǎn)上具有1個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的改變的前體枯草桿菌酶變異體，其還通過在相應(yīng)于殘基129、130、131、132、133、134、135、136(BASBPN編號)的位點(diǎn)中替換、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)殘基加以改造；籍此所說的變異體與在任何所說的位點(diǎn)129-136上都沒有改變的前體枯草桿菌酶變異體相比表現(xiàn)出增強(qiáng)的蛋白自身酶解穩(wěn)定性。
US5.543.302指出SAVINASE在位于殘基192-193(BASBPN編號)之間有一個(gè)蛋白自身酶解切割位點(diǎn)，并且建議在圍繞該位點(diǎn)的廣泛區(qū)域(殘基180-210之間)進(jìn)行改造以獲得蛋白自身酶解穩(wěn)定性增強(qiáng)的變異體。
本發(fā)明已經(jīng)證實(shí)了在SAVINASE和SAVINASE變異體中殘基192-193(BASBPN編號)之間的這個(gè)蛋白自身酶解位點(diǎn)，變異體具有在位于相應(yīng)于BLS309(BASBPN編號)的殘基P129、P131、E136、G159、S164、I165、Y167、R170、Y171上的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的改變。本發(fā)明者建議特定的改造(突變)，是在殘基192-193(BASBPN編號)之間蛋白自身酶解位點(diǎn)的附近，如S190P和G193A(BASBPN編號)。
這些特定的突變在US5.543.302中沒有被討論或指出過，其中只是描述了一個(gè)較廣泛的區(qū)域(位于殘基180-210之間)而且在US5.543.302中也沒有公開導(dǎo)致增加蛋白自身酶解穩(wěn)定性的特定突變。
作為進(jìn)一步詳細(xì)參考，此處給出了有效實(shí)施例(參見下文)。
因此，在第三個(gè)方面中本發(fā)明涉及一種枯草桿菌酶變異體，其特征在于衍生自在殘基192和193之間(BASBPN編號)具有蛋白自身酶解切割位點(diǎn)的前體枯草桿菌酶，其還通過在位于相應(yīng)于殘基189、190、191、192、193、194、195和196(BASBPN編號)的位點(diǎn)上替換、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)殘基加以改造；籍此該變異體與前體枯草桿菌酶相比具有增強(qiáng)的蛋白自身酶解穩(wěn)定性。
在第四個(gè)方面中本發(fā)明涉及一種枯草桿菌酶變異體，其特征在于衍生自在位于相應(yīng)于BLS309(BASBPN編號)的殘基P129、P131、E136、G159、S164、I165、Y167、R170、Y171上具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的改變的前體枯草桿菌酶變異體，其還通過在位于相應(yīng)于BLS309(BASBPN編號)的189、190、191、192、193、194、195、196的位點(diǎn)上替換、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)殘基加以改造；籍此所說的變異體與在任何位點(diǎn)189-196上都沒有改變的前體枯草桿菌酶變異體相比表現(xiàn)出增強(qiáng)的蛋白自身酶解穩(wěn)定性。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及能夠表達(dá)本發(fā)明的酶的DNA構(gòu)建體，當(dāng)它以合適的方式插入到宿主細(xì)胞中隨后表達(dá)第一個(gè)方面中的枯草桿菌蛋白酶。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的枯草桿菌蛋白酶的生產(chǎn)，其通過根據(jù)第二方面將DNA構(gòu)建體插入合適的宿主，培養(yǎng)宿主以表達(dá)所需的枯草桿菌酶并回收酶產(chǎn)物。
本發(fā)明部分涉及，但并不限于，表達(dá)I-S2亞組酶的突變基因和上述相應(yīng)的酶變異體。
本發(fā)明包括的其它枯草桿菌酶基因變異體，諸如枯草桿菌酶I-S1亞組的酶，如枯草桿菌蛋白酶BPN′和枯草桿菌蛋白酶carlsberg基因，以及由其產(chǎn)生的變異體枯草桿菌蛋白酶BPN′、蛋白酶K和枯草桿菌蛋白酶Carlsberg,它們在濃縮的液體去污劑中表現(xiàn)出增強(qiáng)的穩(wěn)定性。
本發(fā)明還包括枯草桿菌酶基因變異體如蛋白酶K和其它基因以及由其產(chǎn)生的變異體蛋白酶K和其它枯草桿菌酶，它們在濃縮的液體去污劑中表現(xiàn)出增強(qiáng)的穩(wěn)定性。
根據(jù)本發(fā)明可以被改造的母體枯草桿菌酶的其它實(shí)例列于表Ⅰ。
本發(fā)明還涉及突變酶在清潔用組合物和含有突變酶的清潔用組合物中的用途，特別是在含有突變的枯草桿菌蛋白酶的去污劑組合物中的用途。
根據(jù)本發(fā)明，這些去污劑組合物還可以含有一種或多種其它的酶，例如脂肪酶、纖維素酶、淀粉酶等等?？s寫氨基酸A=Ala=丙氨酸V=Val=纈氨酸L=Leu=亮氨酸I=Ise=異亮氨酸P=Pro=脯氨酸F=Phe=苯丙氨酸W=Trp=色氨酸M=Met=甲硫氨酸G=Gly=甘氨酸S=Ser=絲氨酸T=Thr=蘇氨酸C=Cys=半胱氨酸Y=Tyr=酪氨酸N=Asn=天冬氨酸Q=Gln=谷氨酰胺D=Asp=天冬酰胺E=Glu=谷氨酸K=Lys=賴氨酸R=Arg=精氨酸H=His=組氨酸X=Xaa=任何氨基酸核酸堿基A=腺嘌呤G=鳥嘌呤C=胞嘧啶T=胸腺嘧啶(僅在DNA中)U=尿嘧啶(僅在RNA中)變異體在描述根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的或構(gòu)思的不同酶變異體時(shí)，下列術(shù)語經(jīng)修改以便于參考最初的氨基酸位點(diǎn)替代的氨基酸據(jù)此，在位點(diǎn)195上的甘氨酸被谷氨酸替換命名為Gly 195Glu或G195E在同一位點(diǎn)缺失甘氨酸為Gly195*或G195*插入一個(gè)額外的氨基酸殘基如賴氨酸則為Gly195 Glylys或G195GK如果與用作編號的序列相比指出某一缺失，在該位點(diǎn)的插入記為*36Asp或*36D表示在位點(diǎn)36上插入了一個(gè)天冬氨酸。
多重突變以加號相隔，即Arg170Tyr+Gly195Glu或R170Y+G195E表示在位點(diǎn)170和195分別由酪氨酸和谷氨酸替換精氨酸和甘氨酸的突變。位點(diǎn)在描述本申請中和所附權(quán)利要求書中的變異體時(shí)，排列了Siezen等(出處同前)中的多種枯草桿菌酶。在其它涉及枯草桿菌酶的申請中使用了特定酶的其它排列和編號。對本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說在此處所用的編號中建立一個(gè)特定殘基位點(diǎn)是常規(guī)操作。參照

圖1說明來自大量枯草桿菌酶的本發(fā)明相關(guān)的殘基的排列。參照表Ⅰ和WO91/00345顯示了來自許多枯草桿菌酶的本發(fā)明相關(guān)的殘基的排列。表Ⅰ已建立的枯草桿菌(自Siezen等，出處同前)生物 cDNA 酶字首縮寫基因原核生物細(xì)菌革蘭氏陽性枯草芽孢桿菌168 aprA 枯草桿菌蛋白酶I168,aprABSS168解淀粉芽孢桿菌 apr 枯草桿菌蛋白酶BPN’(NOVO) BASBPN枯草芽孢桿菌DY -枯草桿菌蛋白酶DY BSSDY地衣芽孢桿菌 +枯草桿菌蛋白酶Carlsberg BLSCAR遲緩芽孢桿菌 +枯草桿菌蛋白酶147 BLS147嗜堿芽孢桿菌PB92 +枯草桿菌蛋白酶PB92BAPB92DSM4828芽孢桿菌 -堿性蛋白酶BDSM48YaB芽孢桿菌 ale 堿性彈性蛋白酶YaB BYSYAB枯草芽孢桿菌168 epr 最小胞外蛋白質(zhì)BSEPR枯草芽孢桿菌桿 Bpf 枯草桿菌肽酶F BSBPF枯草芽孢桿菌 ispl 胞內(nèi)絲氨酸蛋白酶I BSISP1IF03013枯草芽孢桿菌A50 -胞內(nèi)絲氨酸蛋白酶 BSIA50蘇云金芽孢桿菌 -胞外絲氨酸蛋白酶 BTFINI蠟狀芽孢桿菌 -胞外絲氨酸蛋白酶 BCESPR達(dá)松維爾擬諾卡氏菌 -堿性絲氨酸蛋白酶 NDAPII普通高溫放線菌 - Thermitase TVTHER糞腸球菌 cylA細(xì)胞溶素組分AEFCYLA表皮葡萄球菌 epiPEpiderminlead蛋白酶 SEEPIP化膿鏈球菌 scpAC5A肽酶 SPSCPA乳酸乳桿菌SK11 prtPSK11細(xì)胞壁蛋白酶 LLSK11細(xì)菌革蘭氏陰性Dichelobacter + 基本蛋白酶 DNEBPRnodosus甘蘭黑腐病菌 + 胞外蛋白酶 XCEXPR粘質(zhì)沙雷氏菌 + 胞外絲氨酸蛋白酶 SMEXSP水生棲熱菌YT-1 pstIAqualysin I TAAQUA棲熱菌rT41A+ T41A蛋白酶 TRT41A溶藻性弧菌AproA蛋白酶A VAPROA魯特介斯鏈霉菌 - 蛋白酶D SRESPD古細(xì)菌(Archaea)嗜鹽菌172P1- halophil胞外蛋白酶 ARB172藍(lán)細(xì)菌(Cynobacteria)可變項(xiàng)圈藻 prcA鈣依賴性蛋白酶 AVPRCA低等真核生物真菌Tritirachium album + 蛋白酶K TAPROKlimberTritirachium album + 蛋白酶R TAPRORTritirachium album proT蛋白酶T TAPROT米曲霉 + 堿性蛋白酶 AOALPRMalbranchea - 真核胞外酶 MPTHMYpulchella金色支頂孢 alp 堿性蛋白酶 ACALPR酵母乳酸克魯維酵母 kex1kex1絲氨酸蛋白酶 KLKEX1釀酒酵母kex2kex2絲氨酸蛋白酶 SCKEX2釀酒酵母Prb1蛋白酶B SCPRB1Yarrowia lipolytica Xpr2堿性胞外蛋白酶 LXPR2高等真核生物蠕蟲Caenorhabditis Bli4表皮蛋白酶 CEBLI4elegans昆蟲果蠅Fur1furin1 DMFUR1果蠅Fur2furin2 DMFUR2植物黃瓜- 黃瓜素 CMCUCU哺乳動(dòng)物人(及大鼠，小鼠)Fur furinHSFURJ人(及小鼠) + insulinoma PC2蛋白酶 HSIPC2鼠 + 垂體PC3蛋白酶MMPPC3人 + 三肽酰肽酶Ⅱ HSTPP表Ⅰ中采用的參考文獻(xiàn)氨基酸序列的參考資料(GenBank/EMBL數(shù)據(jù)庫登記號示于括號中)ARB172 Kamekura和Seno,(1990)生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)(Biochem.Cell Biol.)68,352-359(成熟蛋白酶殘基1-35的氨基酸序列；殘基I4
沒有確定)。BSS168 Stahl.和Ferrari.(1984)細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)。158,411-418(K01988)。Yoshimoto,Oyama等(I488)生物化學(xué)雜志(J.
Biochem.),103,1060-1065(來自B.amylosacchariticus的區(qū)別在于具有T130S和T162S的成熟枯草桿菌蛋白酶)。Svendsen等，(1986)FEBS Lett.196,228-232(PIR A23624；氨基酸測序；區(qū)別在于具有S85A,A88S,S89A,S183A和N259S的來自腸膜芽孢桿菌的成熟的堿性mesentericopeptidase)。BASBPN Wells等(1983)核酸研究，11,7911-7925(X00165)。Wasantha等，(1984)細(xì)菌學(xué)雜志，159,811-814(K02496)。BSSDY Nedkov等(1983)Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.3641537-1540(PIR A00969；氨基酸測序)。BLSCAR Jacobs等(1985)核酸研究，138913-8926(X03341)。Smith等(1968)生物化學(xué)雜志，243,2184-2191(PIR A00968；氨基酸測序；區(qū)別在于具有T103S,P129A,S158N,N161S和S212N的成熟蛋白酶序列)。BLS147 Hastrup等(1989)PCT專利申請WO8906279。
公開日1989年7月13日。(來自遲緩芽孢桿菌的Esperase)。Takami等(1990)應(yīng)用微生物生物技術(shù)(Appl.Microbiol.Biotechnol.),33,519-523(來自芽孢桿菌AH-101的成熟的堿性蛋白酶殘基1-20的氨基酸序列，該序列與BLS147的區(qū)別在于具有N11S)。BABP92 van der Laan等(1991)應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)(Appl.Environ.
Microbiol.)57,901-909.(Maxacal)。Hastrup等(1989)PCT專利申請WO8906279。
公開日1989年7月13日。(枯草桿菌蛋白酶309。
Savinase來自遲緩芽孢桿菌，區(qū)別僅在于具有N87S)。Godette等(1991)第5次蛋白質(zhì)學(xué)會討論會摘要，6月，巴爾的摩摘要M8(來自遲緩芽孢桿菌的高堿性蛋白酶區(qū)別在于具有N87S,S99D,S101R,S103A,V104I和G159S)。BDSM48 Rettenmaier等(1990)PCT專利申請WO90/04022，
公開日1990年4月19。BYSYAB Kaneko等(1989)細(xì)菌學(xué)雜志，171,5232-5236(M28537)。BSEPR Sloma等(1998)細(xì)菌學(xué)雜志，170,5557-5563(M22407)。
Bruckner(1990)普通分子遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)221,486-490(X53307)。BSBPF Sloma等(1990)細(xì)菌學(xué)雜志，172,1470-1477(M29035；修訂)。Wu等(1990)生物化學(xué)雜志，265,6845-6850(J05400；此序列區(qū)別在于具有A169V和由于移碼造成的586個(gè)短C-末端殘基)。BSISP1 Koide等(1986)，細(xì)菌學(xué)雜志，167,110-116(M13760)。BSIA50 Strongin等，(1978)細(xì)菌學(xué)雜志，133,1401-1411(成熟蛋白酶殘基1-54的氨基酸測序；殘基3、39、40、45、46、49和50沒有確定)。BTFINI Chestuknina等(1985),Biokhimiya 50,1724-1730(來自蘇云金芽孢桿菌以色列變種的成熟蛋白酶殘基1-14的，和幕蟲變種的殘基1-16和223-243氨基酸測序)。Kunitate等(1989)農(nóng)業(yè)生物化學(xué)(Agric.Biol.Chem.)53,3251-3256(來自庫斯塔克變種的成熟蛋白酶殘基6-20的氨基酸測序。BTKURS)。BCESPR Chestukhina等(1985),Biokhimiya 50,1724-1730(成熟殘基1-26和223-243的氨基酸測序)。NDAPII Tsujibo等(1990)農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，54,2177-2179(成熟殘基1-26的氨基酸測序)。TVTHER Meloun等(1985)FEBS Lett.183,195-200(PIR A00973；成熟蛋白酶殘基1-274的氨基酸測序)。EFCYLA Segarra等(1991)感染免疫(Infect.Immun.)59,1239-1246。SEEPIP Schnell等(1991)個(gè)人通訊(Sienen等，出處同前)。SPSCPA Chen等(1990)生物化學(xué)雜志，265,3161-3167(J05224)。DNEBPR Kortt等(1991)第5次蛋白質(zhì)學(xué)會討論會摘要，6月22-26日，巴爾的摩摘要S76。LLSK11 Vos等(1989)生物化學(xué)雜志，264,13579-13585(J04962)。
Kok等(1988)應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)，54,231-238(M24767)；來自菌株Wg2的序列區(qū)別在44個(gè)位點(diǎn)，包括蛋白酶結(jié)構(gòu)域的18處不同，以及殘基1617-1676的缺失。Kiwaki等(1989)分子微生物學(xué)(Mol.Microbiol.),3,359-369(X14130；來自菌株NCD0763的序列區(qū)別在46個(gè)位點(diǎn)，包括蛋白酶結(jié)構(gòu)域的22處不同，以及殘基1617-1676的缺失)。XCEXPR Liu等(1990)普通分子遺傳學(xué)220,433-440。SMEXSP Yanagida等(1986)細(xì)菌學(xué)雜志，166,937-994(M13469)。TAAQUA Terada等(1990)生物化學(xué)，265,6576-6581(J05414)。TRT41A McHale等(1990)第5次歐洲生物技術(shù)會議摘要，Christiansen,Munck和Villadsen(編)，Munksgaard國際出版公司，哥本哈根。VAPROA Deane等(1989)基因，76,281-288(M25499)。SRESPD Lavrenova等(1984)蘇聯(lián)生物化學(xué)(Biochemistry USSR.)49,447-454(殘基1-23的氨基酸測序；殘基13、18和19沒有確定)。AVPRCA Maldener等(1991)普通分子遺傳學(xué)225,113-120(發(fā)表的序列在靠近位點(diǎn)200-210處由于移碼閱讀錯(cuò)誤具有28個(gè)未確定的殘基)。TAPROK Gunkel和Gassen(1989)歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.
Biochem.)179,185-194(X14688/XI4689)。Jany等(1986)生物化學(xué)雜志Hoppe-Seyler,367,87(PIRA24541；氨基酸測序；成熟蛋白酶區(qū)別在于具有S745G、SILST204-208DSL和VNLL264-267FNL)。TAPROR Samal等(1990)分子微生物學(xué)，4,1789-1792(X56116)。TAPROR Samal等(1989)基因，85,329-333。AOALPR Tatsumi等(1989)普通分子遺傳學(xué)，219,33-38。
Cheevadhanarah等(1991)EMBL數(shù)據(jù)庫(X54726)。MPTHMY Gaucher和Stevenson(1976)酶學(xué)方法，45,415-433(殘基1-28的氨基酸測序，和具有活性位點(diǎn)絲氨酸的六肽LSGTSM)。ACALPR Isogai等(1991)農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，55,471-477。Stepanov等(1986)國際生物化學(xué)雜志，18,369-375(殘基1-27的氨基酸測序成熟蛋白酶區(qū)別在于具有H13[1]Q,R13[2]N和S13[6]A)。KLKEX1 Tanguy-Tougeau,Wesolowski-Liuvel和Fukuhara(1988)FEBS Lett.234,464-470(X07038)。SCKEX2 Mizuno等(1988)生物化學(xué)生物物理研究通訊(Biochem.
Biophys.Res.Commun.)156,246-254(M24201)。SCPRB1 Moehle等(1987)分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)7,4390-4399(M18097)。YLXYPR2 Davidow等(1987)細(xì)菌學(xué)雜志，169,4621-4629(M17741)。Matoba等(1988)分子細(xì)胞生物學(xué)，8,4904-4916(M23353)。CEBL14 Peter和Rose(1991)蠕蟲飼養(yǎng)者公告(The Worm Breeder’s Gazette)11,28。DMFUR1 Roebroek等(1991)FEBS Lett.289,133-137(X59384)。DMRUR2 Roebroek等(1992)267,17208-17215。CMCUCU Kaneda等(1984)生化雜志，95,825-829(具有活性絲氨酸的八肽NIISGTSM的氨基酸測序)。HSFURI van den Ouweland等(1990)核酸研究18,664(X04329)(鼠Furin的序列區(qū)別在51個(gè)位點(diǎn)，包括催化結(jié)構(gòu)域的5個(gè)A15E,Y21F,S223F,A232V和N258[2]D)。Misumi等(1990)核酸研究18,6719(X55660大鼠furin的序列區(qū)別在49個(gè)位點(diǎn)，包括催化結(jié)構(gòu)域的3個(gè)A15E,Y21F,H24R)。HSIPC2 Smeekens和Steiner(1990)生物化學(xué)雜志265,2997-3000(J05252)。Seidah等(1990)DNA細(xì)胞生物學(xué)(DNA Cell Boil.)9,415-424(鼠pituitary PC2蛋白酶區(qū)別在23個(gè)位點(diǎn)，包括蛋白酶結(jié)構(gòu)域的7個(gè)I4F,S42[2]Y,E45D,N76S,D133E,V134L和G239[1]D)。MMPPC3 Smeekens等(1991)美國國家科學(xué)院院報(bào)88,340-344(M58507)。Seidah等(1990)DNA細(xì)胞生物學(xué)，9,415-424
(M55668/M55669；部分序列)。HSTPP Tommkinson和Jonsson(1991)生物化學(xué)(Biochemisty),30,168-174(J05299)。
附圖簡述圖1表示表Ⅰ中提到的許多枯草桿菌蛋白酶的序列比較定義在進(jìn)一步詳細(xì)討論本發(fā)明之前，首先定義下列術(shù)語“改變的自身酶解穩(wěn)定性”術(shù)語“改變的自身酶解穩(wěn)定性”或“改變自身酶解穩(wěn)定性”意在指與原始蛋白酶相比增強(qiáng)或減小的自身酶解穩(wěn)定性。
“改變的蛋白自身酶解降解位點(diǎn)”術(shù)語“改變的蛋白自身酶解降解位點(diǎn)”意在指那些原始蛋白酶上改變了的蛋白自身酶解降解位點(diǎn)。此改變可能是完全的新位點(diǎn)的形成或是在原始蛋白酶中一個(gè)位點(diǎn)的去除。術(shù)語“改變的蛋白自身酶解降解位點(diǎn)”還意在指一個(gè)在原始蛋白酶中不是如初級或次級切割位點(diǎn)的蛋白自身酶解位點(diǎn)經(jīng)改變降解模式后變成了如初級或次級蛋白自身酶解位點(diǎn)。
“蛋白自身酶解切割位點(diǎn)”術(shù)語“蛋白自身酶解切割位點(diǎn)”用于指出蛋白酶的一個(gè)位點(diǎn)，據(jù)信蛋白酶的蛋白自身酶解發(fā)生在該處。該位點(diǎn)可以被定義為如位于氨基酸殘基X和Y之間。
通過下面步驟可鑒定切割位點(diǎn)制備蛋白酶水溶液；迅速失活蛋白酶以防止由自身酶解產(chǎn)生的肽段的進(jìn)一步降解；在防止蛋白酶復(fù)活的條件下分離肽段；以及鑒定所分離片段的N-端氨基酸。更詳細(xì)的說明參見此處的有效實(shí)施例(參見下文)。
術(shù)語“蛋白自身酶解切割位點(diǎn)”可替代地稱為“蛋白自身酶解斷裂位點(diǎn)”。
“初級蛋白自身酶解切割位點(diǎn)”術(shù)語“初級蛋白自身酶解切割位點(diǎn)”意指蛋白酶切割自身的第一個(gè)1-5個(gè)初始切割位點(diǎn)。
“枯草桿菌酶變異體的改造”術(shù)語“改造”與此處討論的枯草桿菌酶的改造聯(lián)用，它被定義為包括化學(xué)改造以及遺傳操作以減小自身酶解性降解的速率。改造可以通過在感興趣的氨基酸處進(jìn)行替換、缺失和/或插入。
當(dāng)術(shù)語“改造”與在自身酶解切割位點(diǎn)附近的替換、缺失和/或插入聯(lián)用時(shí)，它被定義為包括以減小自身酶解性降解的速率的改造。改造可能發(fā)生在某些氨基酸附近，它們含有那些氨基酸的敏感性的多肽鍵。詞組“在……附近”在此定義為指在那些形成敏感鍵的氨基酸的上游或下游三個(gè)氨基酸以內(nèi)的氨基酸。
“隨機(jī)誘變”術(shù)語“隨機(jī)誘變”用于以傳統(tǒng)的方式加以理解，就是說，在母體酶的隨機(jī)位點(diǎn)上引入一個(gè)或多個(gè)突變，或在選定的母體酶的位點(diǎn)或區(qū)域內(nèi)引入隨機(jī)的氨基酸殘基。隨機(jī)誘變通常伴隨著篩選，用于選擇與母體酶相比性質(zhì)改善的突變的酶。引入隨機(jī)突變和篩選改善的性質(zhì)的合適技術(shù)在這里進(jìn)行詳細(xì)的討論。
“洗滌效果”一種酶催化降解存在于待洗滌物質(zhì)上的不同的天然底物的能力，其中常稱為它的洗滌能力、洗滌力、去污性或洗滌效果。在整個(gè)本申請中術(shù)語洗滌效果用于包含這種性質(zhì)。
“SAVINASE”SAVINASE由NOVO NORDISK A/S銷售。它是來自遲緩芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶309，與BABP92的區(qū)別僅在于含有N98S(見這里的表Ⅰ)。
“前體枯草桿菌酶”術(shù)語前體枯草桿菌酶是根據(jù)Siezen等(蛋白質(zhì)工程4:719-737(1991))定義的枯草桿菌酶。詳細(xì)情況參考這里描述的名為“枯草桿菌酶”的部分。前體枯草桿菌還可以是從自然資源中分離到的枯草桿菌酶，隨后已對其進(jìn)行改造但保留枯草桿菌酶的特征。
“底物”術(shù)語“底物”與蛋白酶底物聯(lián)用，可以根據(jù)它的最廣泛的形式解釋為包括一種化合物，該化合物含有至少一個(gè)對枯草桿菌蛋白酶的水解作用敏感的肽鍵。
“產(chǎn)物”術(shù)語“產(chǎn)物”與從蛋白酶反應(yīng)得到的產(chǎn)物聯(lián)用，根據(jù)本發(fā)明的上下文可將其解釋為包含涉及枯草桿菌蛋白酶的水解反應(yīng)的產(chǎn)物。一種產(chǎn)物可以是下一步水解反應(yīng)的底物。
“枯草桿菌酶變異體”在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語枯草桿菌酶變異體或突變的枯草桿菌酶指由一種生物產(chǎn)生的枯草桿菌酶，該生物表達(dá)一種來自母本微生物的突變基因，該母本微生物具有一個(gè)產(chǎn)生相應(yīng)母體酶的原始的或母本基因，母本基因已被突變以產(chǎn)生突變基因，由此當(dāng)它在合適的宿主中表達(dá)時(shí)產(chǎn)生所說的突變的枯草桿菌蛋白酶。發(fā)明詳述具有改變的蛋白自身酶解降解模式的枯草桿菌酶變異體根據(jù)本發(fā)明，任何在位于或靠近殘基132-133(BASBPN編號)處具有初級蛋白自身酶解位點(diǎn)的前體枯草桿菌酶，通過在位于殘基132-133(BASBPN編號)的自身酶解切割位點(diǎn)上或在其附近(殘基129-136之間)進(jìn)行替換改造后，將表現(xiàn)出增強(qiáng)的自身酶解穩(wěn)定性。
根據(jù)本發(fā)明，在殘基132-133(BASBPN編號)之間有這種初級自身酶解切割位點(diǎn)的前體枯草桿菌酶可以是枯草桿菌酶變異體或野生型枯草桿菌酶。野生型枯草桿菌酶可以是表Ⅰ中具有上述特定切割位點(diǎn)的那些酶的任何一種。枯草桿菌酶變異體可以是，但并不限于表Ⅱ中描述的變異體?，F(xiàn)在相信除了表Ⅱ中討論的那些外，其它枯草桿菌變異體也可以在殘基132和133(BASBPN編號)之間具有初級自身酶解切割位點(diǎn)。
根據(jù)本發(fā)明在一個(gè)或多個(gè)下面(見表Ⅱ)提到的氨基酸殘基上有改造的枯草桿菌酶變異體導(dǎo)致改變了的蛋白自身酶解降解位點(diǎn)，優(yōu)選地是一個(gè)位于或靠近殘基132-133(BASBPN編號)的初級蛋白自身酶解位點(diǎn)。
根據(jù)本發(fā)明，在表Ⅱ中所示的任何一個(gè)氨基酸殘基上具有一個(gè)或多個(gè)改造的枯草桿菌酶變異體，通過在位于殘基132-133(BASBPN編號)的所述自身酶解切割位點(diǎn)上或在其附近進(jìn)行替換加以改造后表現(xiàn)出增強(qiáng)的自身酶解穩(wěn)定性。
在表Ⅱ所示氨基酸殘基上具有一個(gè)或多個(gè)改造的枯草桿菌酶變異體，通過位于殘基192-193(BASBPN編號)之間的自身酶解切割位點(diǎn)上或在其附近進(jìn)行替換加以改造后也表現(xiàn)出增強(qiáng)的自身酶解穩(wěn)定性，而且根據(jù)本發(fā)明通過聯(lián)合在132-133和192-193之間的蛋白自身酶解降解位點(diǎn)附近的改造可以獲得雙重好處。表Ⅱ當(dāng)被改造后產(chǎn)生枯草桿菌酶變異體，其帶有以增強(qiáng)的蛋白自身酶解降解模式的殘基

表Ⅱ是利用圖1中所示的序列比較構(gòu)建的。很明顯一個(gè)相似的或更大的覆蓋其它枯草桿菌酶的表可以很容易地被本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員制作出來。
表Ⅲ進(jìn)一步描述了在所提到的位于殘基132-133(BASBPN編號)之間的自身酶解切割位點(diǎn)附近的特定氨基酸殘基。很明顯一個(gè)相似的或更大的覆蓋其它枯草桿菌酶的表可以很容易地被本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員制作出來。
表Ⅲ位于殘基132-133(BASBPN編號)的蛋白自身酶解位點(diǎn)附近的殘基

表Ⅲ是利用圖1中所示的序列比較構(gòu)建的。
一個(gè)相似的描述位于殘基192-193之間的蛋白自身酶解位點(diǎn)附近的殘基的表可以容易地被本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員制作出來。
因而本發(fā)明涉及在一個(gè)或多個(gè)表Ⅱ中所示的氨基酸殘基上具有改造的枯草桿菌酶變異體，其中氨基酸序列進(jìn)一步地在位于位點(diǎn)132-133(BASBPBN編號)之間的蛋白自身酶解位點(diǎn)附近(即位點(diǎn)129、130、131、132、133、134、135、136)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基上具有改造；或者涉及在一個(gè)或多個(gè)表Ⅱ中所示的氨基酸殘基上有改造的枯草桿菌酶變異體，其還在位于位點(diǎn)192-193之間的蛋白自身酶解位點(diǎn)附近(BASBPN編號))(即位點(diǎn)190、191、192、193、194、195、196)被改造；或涉及在一個(gè)或多個(gè)表Ⅱ中所示的氨基酸殘基上有改造的枯草桿菌酶變異體，其還在位于上述兩個(gè)蛋白自身酶解位點(diǎn)附近均被改造。
根據(jù)本發(fā)明，同時(shí)在位于132-133和192-193(BASBPN編號)的蛋白自身酶解位點(diǎn)或者在各自位點(diǎn)的蛋白自身酶解位點(diǎn)附近的許多特定的改造將為枯草桿菌酶提供增強(qiáng)的蛋白自身酶解穩(wěn)定性。
原則上，改造可以是將位于切割位點(diǎn)附近的某個(gè)氨基酸殘基替換為可導(dǎo)致所得變異體蛋白自身酶解穩(wěn)定性增強(qiáng)的其它19種可能的氨基酸殘基中的任何一個(gè)。相似地，此改造可以是將20種可能的氨基酸殘基的任何一個(gè)或多個(gè)插入在切割位點(diǎn)附近，導(dǎo)致所得變異體蛋白自身酶解穩(wěn)定性增強(qiáng)。改造還可以是缺失位于切割位點(diǎn)附近的任何一個(gè)氨基酸殘基而導(dǎo)致所得變異體的蛋白自身酶解穩(wěn)定性增強(qiáng)。
鑒定導(dǎo)致蛋白自身酶解穩(wěn)定性增強(qiáng)的特定改造的策略是在一個(gè)切割位點(diǎn)和/或兩個(gè)切割位點(diǎn)附近的整個(gè)區(qū)域進(jìn)行定位隨機(jī)誘變(例如在129-136和/或189-196之間的所有殘基進(jìn)行定位隨機(jī)誘變)，然后進(jìn)行篩選分析以鑒定導(dǎo)致穩(wěn)定性增強(qiáng)的特定改造。為了說明這種策略，參見此處的有效實(shí)施例(參見下文)。
許多導(dǎo)致蛋白自身酶解穩(wěn)定性增強(qiáng)的特定改造在此處被指出(見下面的“B”和“C”部分)。
通過如看表Ⅱ或表Ⅲ以及應(yīng)用本發(fā)明的原則，許多蛋白自身酶解穩(wěn)定性增強(qiáng)的候選枯草桿菌酶變異體變得清晰起來。
對于在殘基132-133(BASBPN編號)之間具有蛋白自身酶解位點(diǎn)的BASBPN和BLSCAR的兩個(gè)前體枯草桿菌酶變異體來說，適于在此蛋白自身酶解位點(diǎn)附近的任何位點(diǎn)上加以替換，以產(chǎn)生具有增強(qiáng)的蛋白自身酶解穩(wěn)定性的變異體。
在本發(fā)明的上下文中，枯草桿菌酶根據(jù)Siezen等(出處同前)加以定義。在一個(gè)更窄的意義上，適用于本發(fā)明的許多實(shí)施方案的感興趣的枯草桿菌酶屬于亞組I-S1和I-S2。在一個(gè)更特定的意義上，本發(fā)明的許多實(shí)施方案涉及革蘭氏陰性細(xì)菌的絲氨酸蛋白酶，其可產(chǎn)生初級結(jié)構(gòu)與前面表Ⅰ列出的枯草桿菌酶基本上清楚的同源性。
本發(fā)明還包括在上述位點(diǎn)的任何一個(gè)或多個(gè)替換與對母體酶氨基酸序列的任何其它替換、缺失或添加相結(jié)合。特別是包括與已知為該酶提供改善的性質(zhì)的其它替換相結(jié)合。
這些結(jié)合包括位點(diǎn)222(提高氧化穩(wěn)定性)，218(提高熱穩(wěn)定性)，在穩(wěn)定該酶的鈣結(jié)合位點(diǎn)的替換，例如位點(diǎn)76，以及許多其它為先有技術(shù)顯而易見的位點(diǎn)。
甚至與EP405901中提到的變異體的結(jié)合也被特殊地構(gòu)思過。變異體A具有改變了132-133(BASBPN編號)之間的蛋白自身酶解切割位點(diǎn)的單變異體單變異體包括下面提到的一個(gè)或多個(gè)突變。
枯草桿菌蛋白酶BPN′,枯草桿菌蛋白酶Carlsberg,枯草桿菌蛋白酶168和枯草桿菌蛋白酶DY變異體A129V,A129I,A129L,A129M,A129FG131V,G131I,G131L,G131M,G131FK136V,K136I,K136L,K136M,K136F,S159V,S159I,S159L,S159M,S159F,T164V,T164I,T164L,T164M,T164F,Y167V,Y167I,Y167L,Y167M,Y167FK170V,K170I,K170L,K170M,K170F,Y171V,Y171I,Y171L,Y171M,Y171FThermitase變異體A129V,A129I,A129L,A129M,A129FG131V,G131I,G131L,G131M,G131FQ136V,Q136I,Q136L,Q136M,Q136F,T159V,T159I,T159L,T159M,T159F,A164V,A164I,A164L,A164M,A164F,Y167V,Y167I,Y167L,Y167M,Y167FY171V,Y171I,Y171L,Y171M,Y171FY170V,Y170I,Y170L,Y170M,Y170F枯草桿菌蛋白酶309，枯草桿菌蛋白酶147和芽孢桿菌PB92蛋白酶變異體T129V,T129I,T129L,T129M,T129FG131V,G131I,G131L,G131M,G131FE136V,E136I，E136L,E136M,E136F,G159V,G159I,G159L,G159M,G159F,G164V,G164I,G164L,G164M,G164F,(BLS147)S164V,S164I,S164L,S164M,S164F,(BLS309和BAPB92)Y167A,Y167H,Y167N,Y167P,Y167C,Y167W,Y167Q,Y167S,Y167T,Y167G,Y167V,Y167I,Yl67L,Y167M,Y167FR170W,R170A,R170H,R170N,R170P,R170Q,R170S, R170T, R170Y(放棄BLS309),R170V(放棄BAPB92),R170I(放棄BAPB92),R170L,R170M(放棄BAPB92),R170F,R170G,R170C,Y171A,Y171H,Y171N,Y171P,Y171C,Y171W,Y171Q,Y171S,Y171T，Y171G,Y171V,Y171I,Y171L,Y171M,Y171FB在位于位點(diǎn)132-133之間的蛋白自身酶解切割位點(diǎn)附近改造的變異體在上面“A”部分下提到的任何一個(gè)單變異體還包括一個(gè)或多個(gè)任何下面的突變P129D,P129E,P129A(BLS309)S130D,S130E,S130A(BLS309)P131G,P131D,P131A(BLS309)S132C,S132A,S132P(BLS309)A133P(BLS309)T134C,T134P,T134A(BLS309)L135P,L135A(BLS309)E136A,E136P,E136K(BLS309)V104C+S132C(BLS309)V104C+T134C(BLS309)A108C+T134C(BLS309)C在位于位點(diǎn)192-193之間的蛋白自身酶解切割位點(diǎn)附近改造的變異體在上面“A”部分下提到的任何一個(gè)單變異體還包括一個(gè)或多個(gè)任何下面的突變F189A,F189G,F189D,F189R,F189Y,F189E,F189N(BLS309)S190P,S190D,S190T(BLS309)Q191S,Q191T,Q191N,Q191A,Q191L,Q191D,Q191W(BLS309)Y192A,Y192P,Y192D,Y192E,Y192V(BLS309)G193A,G193N,G193P(BLS309)A194P,A194D(BLS309)G195E(BLS309)L196A(BLS309)D在位于位點(diǎn)132-133和192-193之間的蛋白自身酶解切割位點(diǎn)附近改造的變異體上面“A”部分下提到的任何一個(gè)單變異體，還包括一個(gè)或多個(gè)“B”部分下提到的突變和/或一個(gè)或多個(gè)上面“C”部分下提到的突變的組合。E進(jìn)一步組合變異體構(gòu)思了任何一個(gè)“B”部分、“C”部分和/或“D”部分下提到的上述變異體，如果同在下列任一位點(diǎn)的其它突變相結(jié)合，具有優(yōu)越性27,36,57,76,97,101,104,120,123,206,218,222,224,235和274。
特別地，在下面BLS309和BAPB92變異體中的突變被認(rèn)為適合進(jìn)行組合K27R,*36D,S57P,N76D,G97N,S101G,V104A,V104N,V104Y,H120D,N123S,A194P,Q206E,N218S,M222S,M222A,T224S,K235L和T274A。
而且這種變異體包含一個(gè)或兩個(gè)X167V,X167M,X167F,X167L，X167I,X170V,X170M,X170F,X170L和/或X170I的替換，其與上面提到的其它替換、缺失和/或插入相結(jié)合的這種變異體被認(rèn)為比與“A”、“B”和/或“C”部分下提到的任何突變的結(jié)合更為優(yōu)越。此外，變異體包含任何一個(gè)突變V104N+S101G、K27R+V104Y+N123S+T274A或N76D+V104A或這些突變的其它組合(V104N,S101G,K27R,V104Y,N123S,T274A,N76D,V104A)，其與任一個(gè)或多個(gè)上面的A、B和/C部分下的提到的替換，缺失和/或插入相結(jié)合的變異體被認(rèn)為表現(xiàn)出改善的性質(zhì)。
將要提到的特定的組合是A:Y167I+R170L+A133PB:Y167I+R170L+T134PC:Y167I+R170L+A133P+T134PD:Y167I+R170L+V104C+S132CE:Y167I+R170L+A108C+T134CF:Y167A+R170S+F189AG:Y167A+R170S+Y192AH:Y167A+R170S+Y192PI:Y167A+R170S+Y192A+A194PJ:Y167A+R170S+Y192P+A194PK:Y167A+R170S+F189GL:Y167A+R170S+F189EM:Y167A+R170S+F189RN:Y167I+R170LM:Y167I+R170L+A194PO:Y167A+R170S+A194PP:Y167A+R170L+A194PQ:Y167A+R170N+A194PR:V104C+S132C+Y167I+R170LS:A108C+T134C+Y167I+R170LT:V104C+S132C+Y167A+R170SU:V104C+S132C+Y167A+R170LV:V104C+S132C+Y167A+R170NX:A133D+Y167I+R170LY:P129K+Y167I+R170LZ:A133P+Y167A+R170S+A194PAA:T134P+Y167A+R170S+A194PBB:A133P+T134P+Y167A+R170S+A194PCC:A133P+Y167A+R170N+A194PDD:T134P+Y167A+R170N+A194PEE:A133P+T134P+Y167A+R170N+A194PFF:A133P+Y167A+R170LGG:P129K+P131H+Y167I+R170LHH:A133P+Y167A+R170SII:A133P+Y167A+R170NJJ:Y167A+R170S+F189KKK:V104C+T134C+Y167A+R170S枯草桿菌酶基因中產(chǎn)生突變的方法許多向基因中引入突變的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。在簡單討論一下克隆枯草桿菌酶基因之后，將要討論在枯草桿菌酶內(nèi)的隨機(jī)位點(diǎn)和特定位點(diǎn)產(chǎn)生突變的方法?？寺】莶輻U菌酶基因編碼枯草桿菌酶的基因可從表Ⅰ中所示的任何一種生物中，特別是從革蘭氏陽性細(xì)菌或真菌中通過本領(lǐng)域所熟知的各種方法克隆到。首先必須用來自產(chǎn)生待研究的枯草桿菌酶的菌株中的染色體DNA或信使RNA建立DNA的基因組文庫和/或cDNA文庫。然后，如果該枯草桿菌酶的氨基酸序列已知，可合成同源的標(biāo)記的寡核苷酸探針，并用于從細(xì)菌DNA基因組文庫或cDNA文庫中鑒定枯草桿菌蛋白酶編碼克隆?；蛘?，一個(gè)含有與來自另一個(gè)細(xì)菌或生物的枯草桿菌酶同源序列的標(biāo)記寡核苷酸探針可用作探針鑒定枯草桿菌酶編碼克隆，方法是用嚴(yán)格性較低的雜交和洗脫條件。
然而，另一個(gè)鑒定產(chǎn)生枯草桿菌酶克隆的方法包括將基因組DNA插入到一種表達(dá)載體如質(zhì)粒中，用形成的基因組DNA文庫轉(zhuǎn)化蛋白酶陰性細(xì)菌，然后將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌涂布在含有枯草桿菌酶底物如脫脂乳的瓊脂上。那些含有耐受枯草桿菌酶的質(zhì)粒的細(xì)菌因?yàn)橛赏饷诘目莶輻U菌酶消化脫脂乳將產(chǎn)生透明瓊脂圈包圍的菌落。在枯草桿菌蛋白酶基因中產(chǎn)生隨機(jī)突變一旦枯草桿菌酶基因被克隆入合適的載體，如質(zhì)粒，可用幾種方法在該基因中引入隨機(jī)突變。
例如，隨機(jī)突變的進(jìn)行可以通過使用合適的物理或化學(xué)誘變劑，使用適合的寡核苷酸，或者使DNA序列進(jìn)行PCR誘變。此外，隨機(jī)突變可以通過使用這些誘變劑的任意組合來進(jìn)行。
誘變劑可以是，例如一種引起轉(zhuǎn)換、顛換、倒位、重排(Scrambling)、缺失和/或插入的試劑。
適合本目的的物理或化學(xué)誘變劑的實(shí)例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)，對-甲基羥胺、亞硝酸、甲基磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。
當(dāng)使用這些試劑時(shí)，誘變通常是通過將待誘變的編碼母體酶的DNA序列與所選誘變劑一起在適合誘變發(fā)生的條件下進(jìn)行溫育，以及選擇具有所需性質(zhì)的突變的DNA。
當(dāng)誘變是通過使用寡核苷酸進(jìn)行時(shí)，可以在合成寡核苷酸過程中在有待改變位點(diǎn)上用三個(gè)非親本核苷酸進(jìn)行修飾(Doped或Spiked)。進(jìn)行修飾可以避免不需要的氨基酸密碼子。被修飾寡核苷酸可以通過任何已公開的技術(shù)如PCR、LCR或任何DNA聚合酶和連接酶摻入到編碼蛋白酶的DNA中。
當(dāng)使用PCR產(chǎn)生的誘變時(shí)，一個(gè)經(jīng)化學(xué)處理的或未經(jīng)處理的編碼母體蛋白酶的基因在增加核苷酸錯(cuò)誤摻入的條件下進(jìn)行PCR。(Dexhler1992.Lenng等1989)
一個(gè)增變(mutator)大腸桿菌菌株(Fowler等1974)，釀酒酵母菌株或任何其它微生物菌株可用于編碼蛋白酶的DNA的隨機(jī)誘變，通過如轉(zhuǎn)化一個(gè)含母體酶的質(zhì)粒入增變菌株，培養(yǎng)含質(zhì)粒的增變菌株以及從增變菌株中分離突變質(zhì)粒。突變質(zhì)?？呻S后被轉(zhuǎn)化到表達(dá)生物中。
待誘變的DNA序列可方便地存在于從表達(dá)母體蛋白酶的生物中制備的基因組文庫中或cDNA文庫中?；蛘?，DNA序列可位于合適的載體如質(zhì)?；蚴删w上，它們可以與誘變劑一起溫育或接觸誘變劑。待誘變的DNA還可以通過整合到該細(xì)胞的基因組中或者通過存在于停泊(harboured)于該細(xì)胞的載體上存在于宿主細(xì)胞中。最后，待誘變的DNA可以以分離的形式存在。將要進(jìn)行隨機(jī)誘變的DNA序列優(yōu)選地是cDNA或基因組DNA序列。
隨機(jī)誘變可以優(yōu)先地定位于目標(biāo)母體蛋白酶的一部分。當(dāng)該酶的某一區(qū)域被鑒定對該酶的某種性質(zhì)特別重要時(shí)，以及當(dāng)被改造后預(yù)期能夠?qū)е戮哂懈纳菩再|(zhì)的變異體時(shí)，這樣做有優(yōu)越性。當(dāng)母體酶的三級結(jié)構(gòu)被闡明時(shí)，這種區(qū)域可被通常地鑒定且與該酶的功能相關(guān)。
定位隨機(jī)誘變可以方便地通過利用上述PCR產(chǎn)生的誘變技術(shù)或任何其它合適的本領(lǐng)域已知的技術(shù)來進(jìn)行。
或者，編碼DNA序列待改造的部分的DNA序列可以被分離，例如，通過插入到合適的載體中，然后該部分可以再利用上述誘變方法的任何一種進(jìn)行誘變。
定位隨機(jī)誘變可以在一個(gè)或多個(gè)這些區(qū)域中進(jìn)行，優(yōu)選地在至少兩個(gè)區(qū)域中進(jìn)行。在枯草桿菌酶中產(chǎn)生定點(diǎn)突變一旦枯草桿菌酶被克隆，想要的突變位點(diǎn)被鑒定，而且用于替換原始?xì)埢臍埢淮_定，就可以利用合成的寡核苷酸引入這些突變。這些寡核苷酸含有想要的突變位點(diǎn)側(cè)翼的核苷酸序列，在寡核苷酸合成時(shí)插入突變體核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選方法中，定點(diǎn)誘變是通過分別由Deng等《分析生物化學(xué)》(Anal.Biochem)200:81-88(1992)和Markvardsen等《生物技術(shù)》(Bio Techniques)18(3):371-372(1995)描述的“單一位點(diǎn)消除技術(shù)”(USE)或“尿嘧啶單一位點(diǎn)消除技術(shù)”來進(jìn)行。重組表達(dá)載體含有編碼本發(fā)明的酶的DNA構(gòu)建體的重組載體可以是可以任何方便地進(jìn)行重組DNA步驟的載體，載體的選擇經(jīng)常依賴于它將被引入的宿主細(xì)胞。因此，載體可以是自主復(fù)制載體，即以染色體外實(shí)體形式存在的載體，它的復(fù)制是獨(dú)立于染色體復(fù)制的，例如質(zhì)粒?；蛘?，當(dāng)它被引入宿主細(xì)胞時(shí)載體可以以其部分或整體整合到宿主細(xì)胞的基因組中，并與它所整合的染色體一起復(fù)制。
載體優(yōu)選地是表達(dá)載體，其中編碼本發(fā)明的DNA序列有效地與DNA轉(zhuǎn)錄所需的額外片段連接在一起。通常表達(dá)載體衍生自質(zhì)?；虿《綝NA，或者含有它們兩者的元件。術(shù)語“有效地連接”是指該片段經(jīng)過排列以使其為了預(yù)定目的而共同行使功能，例如，在啟動(dòng)子中起始轉(zhuǎn)錄，并在編碼該酶的DNA序列上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。
啟動(dòng)子可以是任何在選定的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列，可以衍生自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。
在細(xì)菌宿主細(xì)胞中使用的合適的啟動(dòng)子的實(shí)例包括嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilis)生麥芽糖淀粉酶基因，地衣芽孢桿菌α淀粉酶基因，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因，枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因，或者是短小芽孢桿菌的木糖酶基因，或者是λ噬菌體PR或PL啟動(dòng)子或大腸桿菌lac、trp或tac啟動(dòng)子。
如果需要的話，編碼本發(fā)明的酶的DNA序列還可以有效地與合適的終止子相連。
本發(fā)明的重組載體可進(jìn)一步含有使載體在該宿主中復(fù)制的DNA序列。
載體還可以含有一種選擇性標(biāo)記，例如一個(gè)基因，其產(chǎn)物互補(bǔ)了宿主細(xì)胞中的缺陷；或者一個(gè)基因，它編碼如對抗生素，象卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、壯觀霉素等等的抗性，或者對重金屬或除草劑的抗性。
為了指導(dǎo)本發(fā)明的酶進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑，在重組載體中可提供一種分泌信號序列(又叫引導(dǎo)序列，前蛋白序列(prepro)或前序列(pre Sequence))。分泌信號序列以正確的閱讀框連接到編碼該酶的DNA序列上。分泌信號序列通常定位在編碼該酶的DNA序列的5’端。分泌信號序列通常與該酶有關(guān)，或是來自編碼其它分泌蛋白的基因。
分別用連接編碼該酶的DNA序列、啟動(dòng)子和任選的終止子以及/或分泌信號序列的步驟，或通過合適的PCR擴(kuò)增系統(tǒng)組裝這些序列，并將它們插入含有復(fù)制或整合所必要的信息之合適載體中去的步驟為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員周知(例如參考Sambrook等，Op.cit)。宿主細(xì)胞引入宿主細(xì)胞的編碼本發(fā)明的酶的DNA序列可與宿主同源或異源。如果與宿主細(xì)胞同源，即天然產(chǎn)自宿主細(xì)胞，它可以一般有效地與其自然環(huán)境中所沒有的另一個(gè)啟動(dòng)子序列或，如果可行的話，與另一個(gè)分泌信號序列和/或終止子序列相連。術(shù)語“同源”意在包括編碼宿主生物天然的酶的DNA序列。術(shù)語“異源”意在包括為宿主細(xì)胞天然所不表達(dá)的DNA序列。因此，DNA序列可以是來自另一種生物，或者是一個(gè)合成的序列。
引入本發(fā)明的DNA構(gòu)建體或重組載體的宿主細(xì)胞可以是任何能夠產(chǎn)生該酶的細(xì)胞，包括細(xì)菌、酵母、真菌和高等真核細(xì)胞。
經(jīng)培養(yǎng)能夠產(chǎn)生本發(fā)明的酶的細(xì)菌宿主細(xì)胞的實(shí)例是革蘭氏陽性細(xì)菌，例如芽孢桿菌菌株，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、或蘇云金芽孢桿菌，或鏈霉菌菌株，如淺青紫霉菌或鼠灰鏈霉菌(S.murinus)，或革蘭氏陰性細(xì)菌例如大腸桿菌。細(xì)菌的轉(zhuǎn)化可以通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔、接合或用感受態(tài)細(xì)胞以自知的方式來實(shí)現(xiàn)(參考Sambrook等，出處同前)。
當(dāng)在細(xì)菌如大腸桿菌中表達(dá)酶時(shí)，該酶可以留在胞質(zhì)中，通常為不溶性粒子(已知為包涵體)，或者被細(xì)菌分泌序列指導(dǎo)進(jìn)入周質(zhì)區(qū)。在前一種情況中，將細(xì)胞裂解，回收粒子并變性，然后通過將變性劑稀釋使酶重新折疊。在后一種情況中，可以通過破壞細(xì)胞從周質(zhì)區(qū)回收該酶，例如通過超聲波或滲透沖擊以釋放周質(zhì)區(qū)的內(nèi)含物并回收酶。
當(dāng)在革蘭氏陽性細(xì)菌如芽孢桿菌或鏈霉菌菌株中表達(dá)酶時(shí)，該酶留在胞質(zhì)中，或被細(xì)菌分泌序列指導(dǎo)進(jìn)入胞外培養(yǎng)基中。在后一種情況中，可以根據(jù)下面的描述從培養(yǎng)基中回收。產(chǎn)生枯草桿菌酶的方法本發(fā)明提供一種方法以產(chǎn)生分離的根據(jù)本發(fā)明的酶，其中用編碼該酶的DNA序列轉(zhuǎn)化的合適宿主細(xì)胞被培養(yǎng)在允許產(chǎn)生該酶的條件下，并從培養(yǎng)液中回收所產(chǎn)生的酶。
根據(jù)此處的定義，分離的多肽是基本上沒有其它非枯草桿菌酶多肽的多肽，例如通過SDS-PAGE測定至少20％純度，優(yōu)選地至少40％純度，更優(yōu)選地至少60％純度，更更優(yōu)選地約80％純度，最優(yōu)選地約90％純度，更最優(yōu)選地約95％純度。術(shù)語“分離的多肽”可以替代地命名為“純化的多肽”。
當(dāng)含有編碼該酶的DNA序列的表達(dá)載體被轉(zhuǎn)化到一個(gè)異源宿主細(xì)胞中時(shí)，有可能使異源重組體產(chǎn)生本發(fā)明的酶。
因此有可能制備高度純化的枯草桿菌酶組合物，其特征在于不合有同源的不純物。
在本文中同源的不純物是指來自同源細(xì)胞的任何不純物(例如除了本發(fā)明的酶的其它多肽)，其來源于的細(xì)胞是本發(fā)明的酶最初來源于的細(xì)胞的同源細(xì)胞。
用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何適合于宿主細(xì)胞生長的傳統(tǒng)培養(yǎng)基。表達(dá)的枯草桿菌酶可以方便地分泌到培養(yǎng)基中，且可通過已知的步驟加以回收，如離心和過濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，通過鹽法如硫酸銨沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)組分，然后再通過層析步驟例如離子交換層析、親和層析等等。含有該突變酶的去污劑組合物本發(fā)明也可包括本發(fā)明的酶在清潔用組合物和去污劑組合物中的用途，這種組合物包含突變的枯草桿菌蛋白酶。這種清潔用組合物和去污劑組合物如下詳細(xì)描述。去污劑的公開內(nèi)容和實(shí)施例表面活性劑體系根據(jù)本發(fā)明的去污劑組合物包括一個(gè)表面活性劑體系，該表面活性劑可選自于非離子和/或陰離子和/或陽離子和/或兩性的和/或兩性離子的和/或半極性表面活性劑。
表面活性劑的量一般占總重量的0.1％到60％。
表面活性劑優(yōu)選的與該組合物中存在的酶相容地配制。在液態(tài)或膠態(tài)組合物中表面活性劑最優(yōu)選的以促進(jìn)、或至少不降低這些組合物中任何酶的穩(wěn)定性的方式配制。
本發(fā)明所用的表面活性劑的優(yōu)選體系包括如本文所述的一種或多種非離子和/或陰離子表面活性劑。
烷基酚聚氧乙烯醚、聚氧丙烯醚、聚氧丁烯醚適用于作本發(fā)明表面活性劑體系的非離子表面活性劑，優(yōu)選的是聚氧乙烯醚，這些化合物包括烷基酚與環(huán)氧化物的縮合產(chǎn)物，其具有一個(gè)包含具有直鏈或支鏈構(gòu)型的從約6至約14個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)，約8至約14個(gè)碳原子是優(yōu)選的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，環(huán)氧化物的量等于每摩爾烷基酚約2到約25摩爾環(huán)氧化物，更優(yōu)選的為約3到約15摩爾。這種類型的商品化的非離子表面活性劑包括GAF公司銷售的IgepalTMCO-630；Rohm & Haas公司銷售的TritonTMX-45、X-114、X-100和X-102。這些表面活性劑一般歸于烷基酚烷氧基化物(如烷基酚乙氧基化物)。
由伯和仲脂族醇與約1到約25摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物適合用作本發(fā)明的非離子表面活性劑體系的非離子表面活性劑。脂族醇的烷基鏈可以是直鏈也可是支鏈，可為伯醇也可為仲醇，一般包括從約8至約22個(gè)碳原子。優(yōu)選的醇與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物中，醇的烷基基團(tuán)含有從約8到約20個(gè)碳原子，更優(yōu)選的烷基基團(tuán)含約10到18個(gè)碳原子，每摩爾醇與從約2到約10摩爾環(huán)氧乙烷縮合。所述的縮合產(chǎn)物中每摩爾醇與約2到約7摩爾環(huán)氧乙烷縮合，最優(yōu)選的與約2到約5摩爾環(huán)氧乙烷。這種類型的商品化的非離子表面活性劑包括Union Carbide公司銷售的TergitolTM15-S-9(C11-C15直鏈醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、TergitolTM24-L-6NMW(窄分子量分布的C12-C14初級醇與6摩爾環(huán)氧乙烷的縮合物)；Shell Chemical公司銷售的NeodolTM45-9(C14-C15直鏈醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、NeodolTM23-3(C12-C13直鏈醇與3.0摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、NeodolTM45-7(C14-C15直鏈醇與7摩爾環(huán)氧乙烷的縮合物)、NeodolTM(C14-C15直鏈醇與5摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)；Procter&Gamble公司銷售的KyroTMEOB(C13-C15醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)；Hoechst銷售的Genapol LA 050(C12-C14醇與5摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)。這些產(chǎn)物中優(yōu)選的HLB范圍是從8到11，最優(yōu)選的范圍從8到10。
公開于US4,565,647的烷基多糖也用作本發(fā)明的表面活性劑體系的非離子表面活性劑，其具有一個(gè)含從約6到約30個(gè)碳原子的疏水性基團(tuán)，優(yōu)選的從約10到16個(gè)碳原子以及一個(gè)多糖如聚糖苷，親水基團(tuán)含有從約1.3到約10、優(yōu)選的從約1.3到約3、最優(yōu)選的從約1.3到約2.7個(gè)糖單位?？捎萌魏魏?或6個(gè)碳原子的還原糖，如葡萄糖、半乳糖和半乳糖基部分取代葡萄糖基部分(疏水基團(tuán)任選地連接于2-、3-、4-等位置，產(chǎn)生不同于葡萄糖苷或半乳糖苷的葡萄糖或半乳糖)。糖內(nèi)部鍵可位于如添加的糖單位的某一位置和位于其前面的糖單位的2-、3-、4-和/或6位之間。
優(yōu)選的烷基聚糖苷的化學(xué)式如下R2O(CnH2nO)t(糖基)x
其中，R2選自烷基、烷基苯基、羥烷基、羥烷基苯基和其混合的基團(tuán)，其中烷基基團(tuán)含有從約10到約18個(gè)碳原子，優(yōu)選的含從約12到約14個(gè)碳原子；n為2或3，優(yōu)選為2；t可從0到約10，優(yōu)選為0；X可從約1.3到約10，優(yōu)選從約1.3到約3，最優(yōu)選從約1.3到約2.7。糖基優(yōu)選獲自葡萄糖。要制備這些化合物，需先形成醇或烷基聚乙氧基醇，然后再與葡萄糖或葡萄糖源反應(yīng)，形成葡萄糖苷(連接于1位)。添加的糖基單位的1位再與前面糖基單位的2-、3-、4-和/或6位相連，優(yōu)選的主要在2位。
由環(huán)氧丙烷同丙二醇縮合而成的疏水骨架與環(huán)氧乙烷形成的縮合產(chǎn)物也適合用作本發(fā)明的另外的非離子表面活性劑體系。這些化合物的疏水部分優(yōu)選的具有從約1500到約1800的分子量，且表現(xiàn)出水不溶性。在疏水部分上添加的聚氧乙烯部分有助于增加整個(gè)分子的水溶性，產(chǎn)物的液態(tài)性質(zhì)一直保留，直到聚氧乙烯含量占縮合產(chǎn)物總重量的約50％，相當(dāng)于同直到約40摩爾的環(huán)氧乙烷縮合。這種類型化合物的實(shí)例包括BASF銷售的某些商品化的PluronicTM表面活性劑。
由環(huán)氧乙烷與由環(huán)氧丙烷和乙二胺反應(yīng)產(chǎn)物縮合的產(chǎn)物也適合用作本發(fā)明的非離子表面活性劑體系的非離子表面活性劑。這些產(chǎn)物的疏水部分含有由乙二胺與過量環(huán)氧丙烷的反應(yīng)產(chǎn)物，一般分子量從約2500到約3000。該疏水部分再與環(huán)氧乙烷縮合直到縮合產(chǎn)物中所含聚氧乙烯占重量的從約40％到約80％，分子量從約5000到約11000。這種類型非離子表面活性劑的實(shí)例包括BASF銷售的某些商品化的TetronicTM化合物。
優(yōu)選的用作本發(fā)明的表面活性劑體系的非離子表面活性劑有烷基酚-聚氧乙烯醚、伯和仲脂族醇與從約1到約25摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物、烷基多糖和它們的混合物。最優(yōu)選的為具有3到15個(gè)乙氧基的C8-C14烷基酚的乙氧基化物和具有從2到10個(gè)乙氧基(優(yōu)選約10個(gè))的C8-C18醇的乙氧基化物以及它們的混合物。
高度優(yōu)選的非離子表面活性劑是多羥基脂肪酸酰胺表面活性劑，化學(xué)式如下

其中R1為H，或R1為C1-4烴基、2-羥乙基、2-羥丙基或它們的混合物，R2為C5-31烴基、Z為具有至少直接連在鏈上的3個(gè)羥基的直鏈烴基鏈的多羥基烴，或它的烷氧化衍生物。優(yōu)選的R1為甲基，R2為直鏈C11-15烷基或C16-18烷基或諸如椰子烷基的鏈烯基鏈或它們的混合物，且Z為獲自還原胺化反應(yīng)中的諸如葡萄糖、果糖、麥芽糖或乳糖的還原糖。
高度優(yōu)選的陰離子表面活性劑包括烷氧基化的硫酸烷基酯表面活性劑。其實(shí)例為化學(xué)式為RO(A)mSO3M的水溶性鹽或酸，其中R為未取代的C10-C24烷基或具有C10-C24烷基組分的羥烷基基團(tuán)，優(yōu)選C12-C20烷基或羥烷基，更優(yōu)選C12-C18烷基或羥烷基，A為乙氧基或丙氧基單位，m大于零，一般約在0.5與約6之間，更優(yōu)選地在約0.5與約3之間，M為H或一種陽離子，如金屬陽離子(如，鈉、鉀、鋰、鈣、鎂等)、銨或取代的銨陽離子。此處構(gòu)思了乙氧基化硫酸烷基酯以及丙氧基化硫酸烷基酯。取代的銨離子的具體實(shí)例包括甲基、二甲基、三甲基銨離子和諸如四甲基銨的季銨離子和二甲基哌啶鎓陽離子以及諸如乙基胺、二乙胺、三乙胺及其混合物的烷基胺的衍生物等等。典型的表面活性劑有C12-C18烷基聚乙氧基(1.0)硫酸酯(C12-C18E(1.0)M)、C12-C18烷基聚乙氧基(2.25)硫酸酯(C12-C18E(2.25)M)、C12-C18烷基聚乙氧基(3.0)硫酸酯(C12-C18E(3.0)M)、C12-C18烷基聚乙氧基(4.0)硫酸酯(C12-C18E(4.0)M)，其中M一般選自于鈉和鉀。
應(yīng)用的合適的陰離子表面活性劑是烷基酯磺酸鹽表面活性劑，包括根據(jù)“美國油化學(xué)家協(xié)會雜志”(The Journal of the American oilChemists Society),52(1975),pp.323-329，用氣態(tài)SO3磺化C8-C20羧酸(如，脂肪酸)產(chǎn)生的線性酯。合適的起始原料包括獲自動(dòng)物脂肪、棕櫚油等的天然脂肪物質(zhì)。
優(yōu)選的烷基酯磺酸鹽表面活性劑，特別是用于洗衣的，包括如下結(jié)構(gòu)式的烷基酯磺酸鹽表面活性劑

其中R3為C8-C20烴基，優(yōu)選為烷基或它們的組合，R4為C1-C6烴基，優(yōu)選烷基或它們的組合，M為與烷基酯磺酸鹽形成水溶性鹽的陽離子。合適的成鹽陽離子包括諸如鈉、鉀和鋰的金屬離子，以及諸如單乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺的取代或未取代的銨陽離子。優(yōu)選的，R3為C10-C10烷基，R4為甲基、乙基或異丙基。特別優(yōu)選的為R3是C10-C16烷基的甲基酯磺酸鹽。
其它的合適的陰離子表面活性劑包括化學(xué)式為ROSO3M的水溶性鹽或酸的烷基硫酸鹽表面活性劑，其中R優(yōu)選為C10-C24烴基，優(yōu)選具有C10-C20烷基組分的烷基或羥烷基，更優(yōu)選C12-C18烷基或羥烷基，M為H或陽離子，如堿金屬陽離子(如鈉、鉀、鋰)，或銨或取代銨(如甲基、二甲基和三甲基銨陽離子和諸如四甲基銨的季銨陽離子和二甲基哌啶鎓陽離子和獲自諸如單乙胺、二乙胺、三乙胺以及它們混合物的烷基胺的季胺陽離子，等等)。通常，C12-C16烷基鏈優(yōu)選適用于較低的洗滌溫度(如低于約50℃),C16-C18烷基鏈優(yōu)選適用于較高的洗滌溫度(如高于約50℃)。
其它用于洗滌目的的陰離子表面活性劑也可包括于本發(fā)明的洗衣用去污劑組合物中。它們包括皂鹽(包括如鈉、鉀、銨和諸如單乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺鹽的取代銨鹽)、C8-C22初級或次級烷基磺酸鹽、C8-C24烯屬磺酸鹽、通過堿土金屬檸檬酸鹽熱解產(chǎn)物磺化制備的磺化的多羧酸鹽(如英國專利說明書NO.1,082,179中所述)，C8-C24烷基聚乙二醇醚硫酸鹽(包含多達(dá)10摩爾的環(huán)氧乙烷)；烷基甘油磺酸鹽、脂?；视突撬猁}、脂肪油酰甘油硫酸鹽、烷基酚環(huán)氧乙烷醚硫酸鹽，鏈烷烴磺酸鹽、烷基磷酸鹽、諸如?；u乙磺酸鹽的羥乙磺酸鹽、N-?；；撬猁}、烷基琥珀酰胺酸鹽和磺基琥珀酸鹽、磺基琥珀酸鹽單酯(主要是飽和及不飽和C12-C18單酯)和磺基琥珀酸雙酯(主要是飽和及不飽和C6-C12雙酯)，酰基肌氨酸鹽、諸如烷基多糖苷的硫酸鹽的烷基多糖硫酸鹽(非離子非硫酸鹽化合物，見下文)、支鏈的初級烷基硫酸鹽和諸如具有結(jié)構(gòu)式RO(CH2CH2O)k-CH2COO-M+的烷基聚乙氧基羧酸鹽，其中R為C8-C22烷基，K為一個(gè)從1到10的整數(shù)，M為形成可溶性鹽的陽離子。樹脂酸和氫化的樹脂酸也適合，如松香、氫化松香和存在于或獲自木漿浮油的樹脂酸和氫化樹脂酸。
烷基苯磺酸鹽是高度優(yōu)選的。特別優(yōu)選線性(直鏈)烷基苯磺酸鹽(LAS)，其中烷基基團(tuán)優(yōu)選的包含從10到18個(gè)碳原子。
另外的實(shí)施例可見“表面活性劑和去污劑”(卷Ⅰ和Ⅱ，作者Schwartz,Perry和Berch)。種種這樣的表面活性劑也公開于US3,929,678(23欄58行直到29欄23行，此處引入作為參考)。
如果包括在本文，本發(fā)明的洗衣用去污劑組合物一般包含總重量的從約1％到約40％，優(yōu)選重量從約3％到約20％的這種陰離子表面活性劑。
本發(fā)明的洗衣用去污劑組合物也可包含陽離子、兩性的、兩性離子和半極性表面活性劑，以及除了文中已描述之外的非離子和/或陰離子表面活性劑。
適用于本發(fā)明的洗衣用去污劑中的陽離子洗滌用表面活性劑，其具有一個(gè)長鏈烴基基團(tuán)。這些陽離子表面活性劑的實(shí)例包括諸如烷基三甲基銨鹵化物的銨表面活性劑，和那些化學(xué)式如下的表面活性劑[R2(OR3)y[R4(OR3)y]2R5N+X-其中R2為烷基鏈中有約8到約18個(gè)碳原子的烷基或烷基芐基基團(tuán)，每一個(gè)R3都選自于由-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2CH(CH2OH)-、-CH2CH2CH2-以及它們混合物組成的一組基團(tuán)；每個(gè)R4選自于由C1-C4烷基、C1-C4羥烷基、由兩個(gè)以R4基團(tuán)連接形成的芐基環(huán)結(jié)構(gòu)、-CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH(其中R6為任何己糖或分子量低于約1000的己糖聚合物)、和氫(當(dāng)y不為零時(shí))組成的一組基團(tuán)；R5與R4相同或?yàn)橥榛?，其中總碳原子?shù)或R2加R5碳原子數(shù)不超過約18；每個(gè)y從0到大約10,y值的和從0到大約15；X為任何可相容的陰離子。
高度優(yōu)選的陽離子表面活性劑為可用于本組合物的水溶性季銨化合物，具有以下化學(xué)式R1R2R3R4N+X-(ⅰ)其中R1為C8-C16烷基，R2、R3和R4為獨(dú)立的C1-C4烷基、C1-C4羥烷基、芐基和-(C2H40)xH，其中X的值從2到5,X為一種陰離子。R2、R3和R4中至多一個(gè)為芐基。
R1優(yōu)選的烷基鏈長度為C12-C15，尤其是烷基基團(tuán)為獲自椰子或棕櫚仁脂肪的多種鏈長的混合物，或是通過烯烴合成或OXO醇合成衍生而來。
R2、R3和R4優(yōu)選的基團(tuán)為甲基和羥乙基基團(tuán)。陰離子X可選自鹵離子、甲硫酸根、乙酸根和磷酸根離子。用于此處具有化學(xué)式(ⅰ)的合適的季銨化合物有椰子三甲基氯(或溴)化銨；椰子甲基二羥乙基氯(或溴)化銨；癸基三乙基氯化銨；癸基二甲基羥乙基氯(或溴)化銨；C12-C15二甲基羥乙基氯(或溴)化銨；椰子二甲基羥乙基氯(或溴)化銨；十四烷基三甲基甲基硫酸銨；十二烷基二甲基芐基氯(或溴)化銨；十二烷基二甲基(乙氧基)4氯(或溴)化銨；膽堿酯(R1為

烷基，R2、R3、R4為甲基的化學(xué)式(ⅰ)的化合物)二烷基咪唑啉[化學(xué)式(ⅰ)的化合物]用于此處的其它陽離子表面活性也可見于US4,228,044和EP000224。
如果包括在本文，本發(fā)明的洗衣用去污劑組合物一般包含總重量的從約0.2％到約25％，優(yōu)選重量從約1％到約8％的這種陽離子表面活性劑。
兩性的表面活性劑也適合用于本發(fā)明的洗衣用去污劑組合物中。這些表面活性劑廣義地說有仲胺或叔胺的脂族衍生物，或雜環(huán)仲胺和叔胺的脂族衍生物，其中脂基可為直鏈或支鏈。脂族取代基中有一個(gè)包含至少約8個(gè)碳原子，一般為從約8到約18個(gè)碳原子，并且至少有一個(gè)包含一種陰離子水溶性基團(tuán)，如羧基、磺酸根、硫酸根。兩性表面活性劑的實(shí)例見US3,929,678(19欄，18-35行)。
如果此處包含的話，本發(fā)明的洗衣用去污劑組合物一般包含總重量的從約0.2％到約15％，優(yōu)選重量從約1％到約10％的這種兩性表面活性劑。
兩性離子表面活性劑也適合用于本發(fā)明的洗衣用去污劑組合物中。這些表面活性劑廣義地說有仲胺和叔胺的衍生物，雜環(huán)仲胺和叔胺的衍生物，或季銨的衍生物，季鏻或叔锍化合物。兩性離子表面活性劑的實(shí)例見US3,929,678(19欄38行到22欄48行)。
如果此處包含的話，本發(fā)明的洗衣用去污劑組合物一般包含總重量的從約0.2％到約15％，優(yōu)選重量從約1％到約10％的這種兩性離子表面活性劑。
半極性非離子表面活性劑是非離子表面活性劑的一個(gè)特殊類型，其包括水溶性氧化胺，其含有一個(gè)從約10到約18個(gè)碳原子的烷基部分和兩個(gè)選自于含有從約1到約3個(gè)碳原子的烷基和羥烷基的部分；水溶性氧化磷，含有一個(gè)從約10到約18個(gè)碳原子的烷基部分和兩個(gè)選自于含有從約1到約3個(gè)碳原子的烷基和羥烷基的部分；以及水溶性亞砜，含有一個(gè)從約10到約18個(gè)碳原子的烷基部分和選自于含有約1到3個(gè)碳原子的烷基和羥烷基的部分。
半極性非離子去污劑用表面活性劑包括氧化胺表面活性劑，其化學(xué)式如下

其中R3為包含有從約8到約22個(gè)碳原子的烷基、羥烷基、或烷基苯基基團(tuán)、或它們的混合物；R4為含從約2到約3個(gè)碳原子的亞烷基或羥亞烷基基團(tuán)或它們的混合物；X從0到約3；每個(gè)R5為含約1到約3個(gè)碳原子的烷基或羥烷基，或含從約1到約3個(gè)環(huán)氧乙烷基團(tuán)的聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)。R5的基團(tuán)可互相連接，如，通過一個(gè)氧或氮原子形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
這些氧化胺表面活性劑尤其包括C10-C18烷基二甲基氧化胺和C8-C12烷氧乙基二羥乙基氧化胺。
如果此處包含的話，本發(fā)明的洗衣用去污劑組合物一般包含總重量的從約0.2％到約15％，優(yōu)選從約1％到約10％的這種半極性非離子表面活性劑。助洗劑體系本發(fā)明的組合物另外也可包含助洗劑體系。適用于此的常規(guī)助洗劑體系包括硅鋁酸鹽物質(zhì)，硅酸鹽，多羧化物和脂肪酸，諸如乙二胺四乙酸鹽的物質(zhì)，諸如氨基聚膦酸鹽的金屬離子螯合劑，尤其是乙二胺四亞甲基膦酸和二乙三胺五亞甲基膦酸。雖然因?yàn)榄h(huán)境原因而較少優(yōu)選，但磷酸鹽助洗劑也可用于此。
合適的助洗劑可以是無機(jī)離子交換物質(zhì)，一般為無機(jī)水合的硅鋁酸鹽物質(zhì)、尤其是諸如水合的沸石A、X、B、HS或MAP的水合的合成沸石。
另一種合適的無機(jī)助洗劑材料是層狀硅酸鹽，如SKS-6(Hoechst)。SKS-6是包含硅酸鈉(Na2Si2O5)的結(jié)晶層狀硅酸鹽。
包含有一個(gè)羧基基團(tuán)的合適的多羧化物包括乳酸、乙醇酸以及它們的醚衍生物，見比利時(shí)專利NO.831,368；821,369和821,370。含二個(gè)羧基基團(tuán)的多羧化物包括水溶性琥珀酸鹽、丙二酸鹽、(亞乙二氧基)雙乙酸鹽、馬來酸鹽、二乙二醇酸鹽、酒石酸鹽、丙醇二酸鹽和富馬酸鹽、以及德國專利說明書2,446,686和2,446,487,US3,935,257中所述的醚羧化物和描述于比利時(shí)專利NO.840,623中的亞硫酰基羧化物。含三個(gè)羧基基團(tuán)的多羧化物包括，特別是水溶性檸檬酸鹽，烏頭酸鹽和檸康酸鹽以及諸如英國專利NO.1,379,241中所述的羧甲氧基琥珀酸鹽的琥珀酸鹽衍生物，荷蘭申請7205873中所述的乳氧基琥珀酸鹽，和英國專利NO.1,387,447中所述的諸如2-氧雜-1,1,3-丙烷三羧酸鹽的羥基多羧化物。
含四個(gè)羧基基團(tuán)的多羧化物包括英國專利NO.1,261,829中所公開的氧二琥珀酸鹽，1,1,2,2-乙烷四羧酸鹽，包含磺基取代基的1,1,3,3-丙烷四羧酸鹽，包括英國專利NOs,1,398,421和1,398,422以及US3,936,448中公開的磺化琥珀酸鹽衍生物，和英國專利NO.1,082,179中所述的磺化的熱解的檸檬酸鹽，而包含膦取代基的多羧化物則公開于英國專利NO.1,439,000。
脂環(huán)族和雜環(huán)族多羧化物包括環(huán)戊烷-順，順-順-四羧酸鹽；環(huán)戊二烯五羧酸鹽；2,3,4,5-四氫呋喃-順，順，順-四羧酸鹽；2,5-四氫呋喃-順-二羧酸鹽、2,2,5,5-四氫呋喃-四羧酸鹽；1,2,3,4,5,6-己烷-六羧酸鹽和諸如山梨醇、甘露醇和木糖醇的多元醇的羧甲基衍生物。芳香族多羧化物包括公開于英國專利NO.1,425,343中的苯六甲酸、1,2,4,5-苯四酸和苯二甲酸衍生物。
綜上所述，優(yōu)選的多羧化物為每分子包含多達(dá)3個(gè)羧基基團(tuán)的羥基-羧酸鹽，特別是檸檬酸鹽。
用于本組合物的優(yōu)選的助洗劑體系包括諸如沸石A的水不溶性硅鋁酸鹽助洗劑混合物或?qū)訝罟杷猁}(SKS-6)及諸如檸檬酸的水溶性羧酸鹽螯合劑的混合物。
根據(jù)本發(fā)明的去污劑組合物中的合適的螯合劑有乙二胺-N,N′-二琥珀酸(EDDS)或它的堿金屬、堿土金屬、銨或取代的銨鹽，或它們的混合物。優(yōu)選的EDDS化合物為其游離酸形式和它的鈉或鎂鹽。優(yōu)選的EDDS鈉鹽的實(shí)例包括Na2EDDS和Na4EDDS。優(yōu)選的EDDS鎂鹽的實(shí)例包括MgEDDS和Mg2EDDS。鎂鹽存在于本發(fā)明之組合物中是最優(yōu)選的。
優(yōu)選的助洗劑體系包括諸如沸石A的水不溶性硅鋁酸鹽助洗劑的混合物，和諸如檸檬酸的水溶性羧酸鹽螯合劑的混合物。
其它構(gòu)成助洗劑體系組成部分用于顆粒狀組合物中的助洗劑材料包括諸如堿金屬碳酸鹽、碳酸氫鹽、硅酸鹽的無機(jī)材料，和諸如有機(jī)膦酸鹽，氨基聚亞烷基膦酸鹽和氨基多羧酸鹽的有機(jī)材料。
其它的合適的水溶性有機(jī)鹽有均聚或共聚酸或它們的鹽，其中多羧酸包括至少兩個(gè)相互之間隔開最多兩個(gè)碳原子的羧基基團(tuán)。
這種類型的聚合物公開于GB-A-1,596,756。這種鹽的實(shí)例有分子量為2000-5000的聚丙烯酸酯，和它們與馬來酐的共聚物，這些共聚物的分子量從20,000到70,000，尤其是約40,000。
洗滌用助洗劑鹽含量一般占組合物重量的5％到80％。液態(tài)去污劑優(yōu)選的助洗劑量從5％到30％。酶優(yōu)選的去污劑組合物，除本發(fā)明制備的酶之外，還包括其它用于提供清潔效果和/或保護(hù)織物的酶。
這些酶包括蛋白酶、角質(zhì)酶、其它的脂酶、淀粉酶、纖維素酶、過氧化物酶、氧化酶(如漆酶)。蛋白酶任何適合用于堿性溶液中的蛋白酶均可使用。合適的蛋白酶包括動(dòng)物、植物或微生物來源的酶。微生物來源是優(yōu)選的?；瘜W(xué)地或遺傳修飾的變異體也包括在內(nèi)。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實(shí)例有枯草桿菌蛋白酶，尤其是獲自芽孢桿菌屬如枯草桿菌蛋白酶NOVO，枯草桿菌蛋白酶Carlsberg，枯草桿菌蛋白酶309，枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(見WO89/06279)。胰蛋白酶樣蛋白酶有胰蛋白酶(如獲自豬或牛的)和WO89/06270中描述的鐮孢菌屬蛋白酶。
優(yōu)選的商品化蛋白酶包括NOVO Nordisk A/S(丹麥)銷售的商品名為Alcalase、Savinase,Primase,Durazym和Esperase的蛋白酶，Gist-Brocades銷售的商品名為Maxatase,Maxacal,Maxapem和Properase的蛋白酶，Genencor International銷售的商品名為Purafect和Purafect OXP的蛋白酶，和Solvay Enzymes銷售的商品名為Opticlean和Optimase的蛋白酶。加入本發(fā)明組合物中蛋白酶蛋白質(zhì)的量可占組合物重量的0.0001％到2％，優(yōu)選占組合物重量的0.0001％到1％，更優(yōu)選占組合物重量的0.001％到0.5％，甚至更優(yōu)選占組合物重量的0.01％到0.2％。脂酶任何適用于堿性溶液中的脂酶均可使用。合適的脂酶包括細(xì)菌來源或真菌來源的?；瘜W(xué)或遺傳修飾的變異體也包括在內(nèi)。
適用的脂酶實(shí)例包括Humicola lanuqinosa脂酶，如EP258068和EP305216中所述；Rhizomucor miehei脂酶，如EP238023中所述；假絲酵母(Candida)脂酶，諸如C.antarctica脂酶，如EP214 761中所述的C.antantica脂酶A或B；如EP218272中所述的假單胞菌脂酶，諸如產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcacaligenes)和類產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂酶；如EP331376中所述的洋蔥假單胞菌(P.cepacia)脂酶；如GB1,372,034中公開的施氏假單胞菌(P.stutzeri)的脂酶；熒光假單胞菌(P.fluorescens)脂酶；芽孢桿菌脂酶，如枯草芽孢桿菌(B.Subtilis)脂酶(Dartois等，(1993),Biochemica et Biophysica acta 1131 253-260)；嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)脂酶(JP64/744992)和短小芽孢桿菌(B.pumilus)脂酶(WO91/16422)。
另外，很多克隆的脂酶也可使用，包括Yamaguchi等人(1991)，基團(tuán)103,61-67)中所述的沙門柏干酪青霉(Penicillim camembertii)脂酶；Geotricum candidum脂酶(Schimada,Y.等人，(1989)，生物化學(xué)雜志(J.Biochem.),106,383～388)，和諸如R.delemar脂酶(Hass.M.J等人，(1991)，基因109,117-113)，雪白根霉(R.niveus)脂酶(Kugimiya等人，(1992),Biosci.Biotech.Biachem.56,716-719)和米根霉(R.oryzae)脂酶的根霉菌脂酶。
諸如角質(zhì)酶的其它的類型的脂解酶也可使用，如WO88/09367中所述的獲自門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)的角質(zhì)酶，或獲自Fusarium solani pisi的角質(zhì)酶(如，WO90/09446中所述)。特別適用的脂酶諸如M1 LipaseTM,Luma fastTM和LipomaxTM(Genencor),LipolaseTM和Lipolase UltraTM(NOVO Nordisk A/S)，和脂酶P″Amano″(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.)。
一般加入去污劑組合物中的脂酶蛋白質(zhì)的量占組合物重量的0.00001％到2％，優(yōu)選占組合物重量的0.0001％到1％，更優(yōu)選占組合物重量的0.001％到0.5％，甚至更優(yōu)選占組合物重量的0.01％到0.2％。淀粉酶任何適合用于堿性溶液中的淀粉酶(α和/或β)均可使用。合適的淀粉酶包括細(xì)菌或真菌來源的淀粉酶?；瘜W(xué)或遺傳修飾的變異體也包括在內(nèi)。淀粉酶包括如GB1,296,839中詳細(xì)描述的獲自地衣芽孢桿菌的特定菌株的α-淀粉酶。商品化的淀粉酶有DuramyTM,TermamylTM,FungamylTM和BANTM(Novo Nordisk A/S有售)和RapidaseTM和Maxamyl PTM(Genencor有售)。
一般加入去污劑組合物中的淀粉酶蛋白質(zhì)的量占組合物重量的0.0001％到2％，優(yōu)選占組合物重量的0.0001％到1％，更優(yōu)選占組合物重量的0.001％到0.5％，甚至更優(yōu)選占組合物重量的0.01％到0.2％。纖維素酶任何合適用于堿性溶液中的纖維素酶均可使用。合適的纖維素酶包括細(xì)菌或真菌來源的纖維素酶?；瘜W(xué)或遺傳修飾的變異體也包括在內(nèi)。合適的纖維素酶公開于US4,435,307，其中公開了產(chǎn)生于Humicola insolens的真菌纖維素酶。特別合適的纖維素酶是具有保護(hù)顏色的益處的纖維素酶。這些纖維素酶的實(shí)例有歐洲專利申請NO.0495257中所述的纖維素酶。
商品化的纖維素酶包括產(chǎn)生于Humicola insolens菌株的CelluzymeTM(Novo Nordisk A/S)，和KAC500(B)TM(Kao公司)。
一般加入去污劑組合物中的酶蛋白質(zhì)的量占組合物重量的0.00001％到2％，優(yōu)選占組合物重量的0.0001％到1％，更優(yōu)選的占組合物重量的0.001％到0.5％，十分優(yōu)選占組合物重量的0.01％到0.2％。過氧化物酶/氧化酶過氧化物酶與過氧化氫或其來源(如，過碳酸鹽、過硼酸鹽或過硫酸鹽)結(jié)合使用。氧化酶與氧結(jié)合使用。兩種類型的酶均用于“溶液漂白”，如當(dāng)織物一起在洗滌液中洗滌時(shí)阻止染色的織物上的染料轉(zhuǎn)移到另一件織物上，優(yōu)選與如WO94/12621和WO95/01426中所述的增強(qiáng)劑一起使用。合適的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細(xì)菌或真菌來源的酶?；瘜W(xué)或遺傳修飾的變異體也包括在內(nèi)。
一般加入去污劑組合物中的過氧化物酶和/或氧化酶的蛋白質(zhì)的量占組合物重量的0.00001％到2％，優(yōu)選占組合物重量的0.0001％到1％，更優(yōu)選的占組合物重量的0.001％到0.5％，甚至更優(yōu)選占組合物重量的0.01％到0.2％。
上述酶的混合物都包含在本文中，特別是蛋白酶、淀粉酶、脂酶和/或纖維素酶混合物。
本發(fā)明的酶或任何其它加入去污劑組合物中的酶，通常加入去污劑組合物中的量一般占組合物重量的0.00001％到2％，優(yōu)選占組合物重量的的0.0001％到1％，更優(yōu)選的占組合物重量的0.001％到0.5％，甚至更優(yōu)選占組合物重量的0.01％到0.2％。漂白劑包含于本發(fā)明的去污劑組合物中的附加的去污劑組分可包括諸如PB1,PB4和大小為400-800微米的過碳酸鹽漂白劑。這些漂白劑組分可包括一種或多種氧漂白劑和根據(jù)漂白劑選擇的一種或多種白活化劑。氧漂白劑的量一般在從約1％到約25％。一般漂白化合物在非液態(tài)制劑中是任選添加的組分，如在顆粒狀去污劑中。
用于此處的漂白劑組分可以是任何可用于去污劑組合物中的漂白劑，包括氧漂白劑以及本領(lǐng)域中熟知的其它漂白劑。
適用于本發(fā)明中漂白劑可以是活化的或非活化的漂白劑。
可應(yīng)用的一類氧漂白劑包括過羧酸漂白劑以及它們的鹽。這類漂白劑合適的實(shí)例包括六水合單過氧鄰苯二甲酸鎂，間氯過苯甲酸鎂，4-壬氨基-4-氧代過氧丁酸鎂鹽和雙過氧十二雙酸鎂鹽。這些漂白劑公開于US4,483,781,US740,446,EP0133354和US4,412,934。十分優(yōu)選的漂白劑也包括如US4,634,551中所述的6-壬氨基-6-氧代過氧己酸。
可應(yīng)用的另一類漂白劑包括鹵漂白劑。次鹵化物漂白劑的實(shí)例包括如三氯異氰尿酸和二氯異氰尿酸鈉和鉀，以及N-氯和N-溴烷基氨磺酰鈉和鉀。這些材料一般加入量為終產(chǎn)物重量的0.5％-10％，優(yōu)選占重量的1％-5％。
過氧化氫釋放劑與漂白活化劑聯(lián)合使用，如四乙酰乙二胺(TAED),壬酰羥苯磺酸鹽(NOBS，見US4,412,934),3,5-三甲基-己酰氧苯磺酸鹽(ISONOBS，見EP120591)或五乙酰葡萄糖(PAG)，它們經(jīng)全水解后形成過酸作為活性漂白劑，以改善漂白效果。另外，十分合適的漂白劑活化劑有C8(6-辛酰胺基-己?；?氧苯磺酸鹽，C9(6-壬酰胺基-己酰基)氧苯磺酸鹽和C10(6-癸酰胺基-己?；?氧苯磺酸鹽或它們的混合物。其它合適的活化劑有，如公開于歐洲專利申請No.91870207.7.中?；臋幟仕狨ァ?br> 實(shí)用的漂白劑，包括過氧酸和專利申請USSN 08/136,626中所述的漂白體系，包含用于本發(fā)明清潔去污劑組合物中的漂白活化劑和過氧漂白化合物。
過氧化氫也可通過加入酶體系(如酶與其底物)而產(chǎn)生，其能在洗衣和/或漂洗過程開始或過程中產(chǎn)生過氧化氫。該酶體系公開于歐洲專利申請EP0537381中。
除了氧漂白劑外的漂白劑也在本領(lǐng)域熟知，也可用于此。一種特別重要的非氧漂白劑包括諸如磺化的鋅和/或鋁酞菁的光活化的漂白劑。這些物質(zhì)在洗滌過程中沉積于作用物上，經(jīng)光照和氧存在條件下，如衣服白天懸掛于室外晾干時(shí)，磺化的鋅酞菁被激活，隨之作用物就被漂白了。優(yōu)選的鋅酞菁及其光活化漂白過程公開于US4,033,718。一般去污劑組合物中包含占重量的約0.025％到1.25％的磺化的鋅酞菁。
漂白劑中也可包含錳催化劑。錳催化劑可以是例如一種描述于“低溫漂白的有效錳催化劑”，自然(Nature)369,1994,pp.637-639中的化合物。抑泡劑另一個(gè)任選的組分為抑泡劑，如聚硅氧烷和硅石-聚硅氧烷混合物。聚硅氧烷一般為烷基化的聚硅氧烷材料，而常用的硅石一般為如硅石空氣凝膠和干凝膠以及各種類型的疏水性硅石的細(xì)小顆粒。這些物質(zhì)可以顆粒形式加入，在其中，抑泡劑便利地可釋放地加入水溶性或水分散的、基本上非表面活性劑不可滲透的載體中。抑泡劑也可溶解或分散在液態(tài)載體中，然后通過噴灑于一種或多種其它組分上而使用。
優(yōu)選的聚硅氧烷抑泡劑公開于US3,933,672中。其它的特別有用的抑泡劑有自乳化聚硅氧烷抑泡劑，公開于德國專利申請DTOS2,646,126中。這種化合物的一個(gè)實(shí)例為DC-544，可從Dow Corning購得，它是硅氧烷-乙二醇共聚物。特別優(yōu)選的抑泡劑是包含硅油和2-烷基-鏈烷醇的混合物的抑泡劑體系。合適的2-烷基-鏈烷醇為2-丁基-辛醇，其商品名為Isofol 12R。
該抑泡劑體系描述于歐洲專利申請EP0593841中。
特別優(yōu)選的硅氧烷抑泡劑描述于歐洲專利申請No.92201649.8.中。該組合物可包括與諸如Aerosil的熏制無孔硅石結(jié)合的聚硅氧烷/硅石混合物。
上述抑泡劑一般用量為組合物重量的0.001％到2％，優(yōu)選為0.01％到1％。其它組分用于去污劑組合物中的其它組分可采用諸如污垢懸浮劑、污垢釋放劑、光亮劑、研磨劑、殺菌劑、晦暗抑制劑、著色劑、和/或包封的或不包封的香料。
特別適用的包封材料為水溶性膠囊，其由多糖及多羥基化合物基質(zhì)組成，如GB1,464,616中所述。
其它適用的水溶性包封材料，包括獲自非凝膠化淀粉的取代二羧酸酸性酯的糊精，如US3,455,838中所述。這些酸性酯糊精優(yōu)選由蠟狀玉米、蠟樣高粱、西米、木薯淀粉和馬鈴薯淀粉制備。合適的上述包封材料的實(shí)例包括National Starch生產(chǎn)的N-Lok。N-Lok包封材料由改性的玉米淀粉和葡萄糖組成。這種淀粉通過添加諸如辛烯基琥珀酸酐的單功能取代基改性。
適用于此的抗再沉積劑和污垢懸浮劑包括諸如甲基纖維素、羧甲基纖維素和羥乙基纖維素的纖維素衍生物，和均聚或共聚的多羧酸或它們的鹽。這種類型的聚和物包括前述用作助洗劑的聚丙烯酸酯類和馬來酐丙烯酸共聚物，以及馬來酐與乙烯、甲基乙烯基醚或異丁烯酸的共聚物。馬來酸酐組成至少20％摩爾百分含量的共聚物。這些材料用量占組合物重量的0.5％到10％，更優(yōu)選為0.75％到8％，最優(yōu)選占1％到6％。
優(yōu)選的光亮劑為陰離子，其實(shí)例有4,4＇-雙-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-均三嗪基-6-基氨基)茋-2:2＇-二磺酸二鈉，4,4＇-雙(2-嗎啉代-4-苯胺基-均三嗪基-6-基氨基)茋-2:2′二磺酸二鈉，4,4＇-雙-(2,4-二苯胺基-均三嗪基-6-基氨基)茋-2:2＇-二磺酸二鈉，4′4″-雙-(2,4-二苯胺基-均三嗪-6-基氨基)茋-2-磺酸鈉，4,4＇-雙-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羥乙胺基)-均三嗪-6-基氨基)茋-2,2＇-二磺酸二鈉，4,4＇-雙-(4-苯基-2,1,3-三唑基-2-基)茋-2,2＇-二磺酸二鈉，4,4＇-雙-(2-苯胺基-4-(1-甲基-2-羥乙胺基)-均三嗪基-6-基氨基)茋-2,2＇-二磺酸二鈉，2(茋基-4″-(萘并-1′,2′:4,5)-1,2,3，-三唑-2″-磺酸鈉和4,4＇-雙-(2-磺基苯乙烯基)聯(lián)苯。
其它有用的聚合物材料為聚乙二醇，尤其是分子量范圍1000-10000的聚乙二醇，更優(yōu)選分子量范圍2000到8000，最優(yōu)選分子量為約4000的聚乙二醇。其用量為重量的0.20％到5％，更優(yōu)選為0.25％到2.5％。這些聚合物和前述的均聚或共聚多羧酸鹽，并且需在過渡金屬雜質(zhì)存在下可用于增白、織物灰塵沉積，以及增加對塵土、蛋白質(zhì)和可氧化污垢的清潔效果。
本發(fā)明組合物中有用的污垢釋放劑一般為對苯二酸與乙二醇和/或丙二醇單位按各種方式組合的共聚體或三元聚合物。這些聚合物的實(shí)例公開于US,4,116,885和4,711,730和EP0272033中。根據(jù)EP0272033，特別優(yōu)選的聚合物化學(xué)式如下(CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[(T-PO)2.8(T-PEG)0.4]T(POH)0.25-((PEG)43CH3)0.75其中PEG為-(OC2H4)O-,PO為(OC3H6O),T為(POOC6H4CO)。
改性的聚酯也非常實(shí)用，其為對苯二酸二甲基酯，磺基間苯二酸二甲基酯、乙二醇和1,2-丙二醇的無規(guī)則共聚物，其端基主要由苯甲酸磺基酯組成，其次為乙二醇和/或1,2-丙二醇單酯組成。目的是要獲得兩端均由苯甲酸磺基酯基團(tuán)封端的聚合物，“主要”根據(jù)上下文是指所述共聚合物大多由苯甲酸磺基酯封端。然而有些共聚合物沒有完全封端，因此它們的端基可由乙二醇和/或1,2-丙二醇單酯組成，因此組成“次要的”種類。
此處所選用的聚酯包含占重量約46％的對苯二羧酸二甲基酯，約16％的1,2-丙二醇，約10％的乙二醇，約13％的磺基苯甲酸二甲基酯和約15％磺基間苯二甲酸，分子量約為3000。這些聚酯及其制備方法詳細(xì)公開于EP311342。柔順劑織物柔順劑也可加入本發(fā)明的洗衣用去污劑組合物中。這些柔順劑可為無機(jī)型或有機(jī)型。無機(jī)柔順劑有公開于GB-A-1400898和US5,019,292中的綠土。有機(jī)織物柔順劑包括公開于GB-A1514276和EP0011340中的水不溶性叔胺和公開于EP-B-O026528中的它們與單C12-C14季銨鹽的混合物以及公開于EP0242919中的雙長鏈酰胺?？椢锶犴槃w系中的其它有用的有機(jī)組分包括公開于EP0299575和0313146中的高分子量的聚環(huán)氧乙烷材料。
綠土的用量一般為5％到15％，更優(yōu)選占重量的8％到12％，其以干燥的混合組分加入制劑剩余物中。諸如水不溶的叔胺或雙長錠酰胺物質(zhì)的有機(jī)織物柔順劑的用量為重量的0.5％到5％，一般為1％到3％，而高分子量的聚環(huán)氧乙烷物質(zhì)和水溶性陽離子物質(zhì)的用量為重量的0.1％到2％，一般為重量的0.15％到1.5％。這些物質(zhì)一般加入組合物的噴霧干燥部分中，在有些實(shí)施例中也可更方便地以干混顆粒加入，或以熔化的液體形式噴入組合物中其它固體組分上。聚合的染料轉(zhuǎn)移抑制劑本發(fā)明的去污劑組合物也可包括占重量0.001％到10％，優(yōu)選0.01％到2％，更優(yōu)選0.05％到1％的聚合的染料轉(zhuǎn)移抑制劑。一般去污劑組合物中加入所述聚合的染料轉(zhuǎn)移抑制劑用于抑制染料由染色的織物轉(zhuǎn)移到與之一起洗滌的織物上。在洗滌過程中，在從染色的織物上洗出的染色劑有機(jī)會吸附于其它物品之前這些聚合物能絡(luò)合或吸附它們。
特別適用的聚合的染料轉(zhuǎn)移抑制劑有聚胺N-氧化聚合物，N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑共聚物，聚乙烯基吡咯烷酮聚合物，聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或它們的混合物。
這些聚合物的加入也能增強(qiáng)本發(fā)明的酶的功效。
本發(fā)明的去污劑組合物可以是液體、糊狀、凝膠、棒狀或顆粒等形式。無粉塵顆?？筛鶕?jù)如公開于US4,106,991和4,661,452(都是NovoInclustri A/S的)生產(chǎn)，可任選地用本領(lǐng)域熟知的方法包衣。蠟狀包衣材料的實(shí)例有聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)品(聚乙二醇，PEG)，其平均分子量1000至2000；具有16到50個(gè)環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化壬基酚；醇部分包含12到20個(gè)碳原子且具有15到80個(gè)環(huán)氧乙烷的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；脂肪酸甘油單、雙和三酯。適合于通過流化床技術(shù)應(yīng)用的成膜包衣材料的實(shí)例可見于GB1483591中。
本發(fā)明的顆粒狀組合物也可是“致密形式”，如可比常規(guī)顆粒狀去污劑具有相對較高的密度，如從550g/l到950g/l；這樣，本發(fā)明的顆粒去污劑組合物與常規(guī)顆粒去污劑相比，將含有較低量的“無機(jī)填料鹽”；典型的填料鹽為堿土金屬硫酸鹽和鹽酸鹽，一般為硫酸鈉；“致密”去污劑一般包含不超過10％的填料鹽。本發(fā)明的液體去污劑組合物也可是“濃縮形式”，這樣，本發(fā)明的液體組合物與常規(guī)液體去污劑相比，將包含較少量的水。一般濃縮的液體去污劑水含量少于重量的30％，更優(yōu)選少于20％，最優(yōu)選少于去污劑組合物重量的10％。
本發(fā)明的組合物可例如制成機(jī)洗和手洗的洗衣用去污劑組合物，包括洗衣添加組合物和適用于污染織物的預(yù)處理的組合物，漂洗添加的織物柔順劑組合物，以及用于一般家庭堅(jiān)硬表面的清洗和洗碟的組合物。
下面的實(shí)施例是解釋本發(fā)明組合物的舉例，但并不意味限制或另外地限定本發(fā)明的范圍。
在去污劑組合物中，縮寫的部分名意思如下LAS線性C12烷基苯磺酸鈉TAS動(dòng)物脂烷基硫酸鈉XYAS:C1x-C1y烷基硫酸鈉SS化學(xué)式2-丁基辛酸次級皂表面活性劑25EY與平均Y摩爾環(huán)氧乙烷縮合的C12-C15主要為線性的伯醇45EY與平均Y摩爾環(huán)氧乙烷縮合的C14-C15主要為線性的伯醇XYEZS每摩爾與平均Z摩爾環(huán)氧乙烷縮合的C1x-C1y烷基硫酸鈉Nonionic由BASF Gmbh銷售的商品名為Plurafax LF404的乙氧基化平均程度為3.8，丙氧基化平均程度為4.5的C13-C15混合乙氧基化/丙氧基化脂肪醇。CFAA:C12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺TFAA:C16-C18烷基N-甲基葡糖酰胺硅酸鹽無定形硅酸鈉(SiO2∶Na2O=2.0)NaSKS-6分子式為δ-Na2Si2O5的結(jié)晶層狀硅酸鹽碳酸鹽無水碳酸鈉磷酸鹽三聚磷酸鈉MA/AA:1∶4馬來酸/丙烯酸共聚物，平均分子量約80,000聚丙烯酸酯由BASF Gmbh銷售的商品名為PA30的平均分子量為8000的聚丙烯酸酯均聚物沸石A初級粒子大小范圍為1到10微米的分子式為Na12(AlO2SiO2)12·27H2O的水合硅鋁酸鈉檸檬酸鹽二水合檸檬酸三鈉檸檬酸檸檬酸過硼酸鹽無水的過硼酸鈉一水化漂白劑，實(shí)驗(yàn)式NaBO2·H2O2PB4無水的四水合過硼酸鈉過碳酸鹽實(shí)驗(yàn)式為2Na2CO3·3H2O2的無水的過碳酸鈉漂白劑TAED四乙?；叶稢MC羧甲基纖維素鈉DETPMP:Monsanto銷售的商品名為Dequest 2060的二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)PVP聚乙烯吡咯烷酮聚合物EDDS亞乙基二胺-N,N＇-二琥珀酸，鈉鹽形式的[S,S]異構(gòu)體抑泡劑熔點(diǎn)為50℃的鏈烷烴蠟25％，疏水硅石17％，石蠟油58％。顆粒抑泡劑硅氧烷/硅石12％，十八烷醇18％，顆粒狀淀粉70％硫酸鹽無水硫酸鈉HMWPEO高分子量聚環(huán)氧乙烷TAE25乙氧基化動(dòng)物脂肪醇(25)去污劑實(shí)施例Ⅰ本發(fā)明的一種顆粒狀織物清洗劑組合物可按如下制備線性C12烷基苯磺酸鈉 6.5硫酸鈉 1.05沸石A 26.0次氮基三乙酸鈉 5.0本發(fā)明的酶 0.1PVP0.5TAED 3.0硼酸 4.0過硼酸鹽 18.0苯酚磺酸鹽 0.1其它 加到100去污劑實(shí)施例Ⅱ本發(fā)明的一種致密顆粒狀織物清洗劑組合物可按如下制備45AS 8.025E3S 2.025E5 3.025E3 3.0TFAA 2.5沸石A 17.0NaSKS-6 12.0檸檬酸3.0碳酸鹽7.0MA/AA 5.0CMC 0.4本發(fā)明的酶0.1TAED 6.0過碳酸鹽 22.0EDDS 0.3顆粒抑泡劑3.5水/其它 加到100％去污劑實(shí)施例Ⅲ本發(fā)明的特別適用于有色織物洗滌的顆粒狀清洗劑組合物可按如下制備LAS 10.7-TAS 2.4 -TFAA - 4.045AS 3.1 10.045E7 4.0 -25E3S - 3.068E11 1.8 -25E5 - 8.0檸檬酸 15.07.0碳酸鹽 - 10檸檬酸 2.5 3.0沸石A 32.125.0Na-SKS-6 - 9.0MA/AA 5.0 5.0DETPMP 0.2 0.8本發(fā)明的酶 0.100.05硅酸鹽 2.5 -硫酸鹽 5.2 3.0PVP0.5 -聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物/ - 0.2乙烯基咪唑與乙烯基吡咯烷酮共聚物過硼酸鹽 1.0 -苯酚磺酸鹽 0.2 -水/其它加到100％去污劑實(shí)施例Ⅳ本發(fā)明的具有“在洗滌過程中軟化”能力的顆粒狀織物清潔劑組合物按如下制備45AS- 10.0LAS 7.6-68AS1.3-45E74.0-25E3- 5.0椰子烷基-二甲基羥乙基氯化銨1.41.0檸檬酸鹽 5.03.0Na-SKS-6 - 11.0沸石A 15.0 15.0MA/AA 4.00.4DETPMP 0.40.4過硼酸鹽 15.0 -過碳酸鹽 - 15.0TAED 5.05.0綠土 10.0 10.0HMWPEO - 0.1本發(fā)明的酶 0.10 0.05硅酸鹽 3.05.0碳酸鹽 10.0 10.0顆粒狀抑泡劑 1.04.0CMC0.10.1水/其它 加到100％去污劑實(shí)施例Ⅴ本發(fā)明的高效液態(tài)織物清洗組合物按如下制備ⅠⅡ酸型LAS -25.0檸檬酸 5.0 2.0酸型25AS 8.0 -酸型25AE2S 3.0 -25AE78.0 -CFAA 5-DETPMP 1.0 1.0脂肪酸 8-油酸 - 1.0乙醇 4.0 6.0丙二醇 2.0 6.0本發(fā)明的酶 0.10 0.05椰子烷基二甲基羥乙基氯化銨 - 3.0綠土 - 5.0PVP 2.0 -水/其它 加到100％材料和方法菌株遲緩芽孢桿菌309和147是遲緩芽孢桿菌的特定菌株，保藏于NCIB，編號為NCIB 10309和10147，在美國專利3,723,250中有描述，在此引入作為參考。
大腸桿菌MC1000(M.J.Casadaban和S.N.Cohen(1980)；分子生物學(xué)雜志138.179-207)通過傳統(tǒng)方法制成r-,m+型，也在美國專利申請系列號039,298中有描述。質(zhì)粒pJS3含有編碼枯草桿菌酶309的合成基因的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體(由Jacob Schiodt等在《蛋白質(zhì)和肽通訊》(Protein andPeptide Letters)3:39-44(1996)中描述)。
PSX222枯草芽孢桿菌表達(dá)載體(在PCT/DK96/00207中有描述)。常用的分子生物學(xué)方法除非另外提到，DNA的操作和轉(zhuǎn)化是利用分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行的(Sambrook等(1989)《(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊》(Molecularcloning:Alaboratory manual)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約；Ausubel,F.M.等編著、《分子生物學(xué)中的現(xiàn)代方法》(Current protocolsin Molecular Biology)(John Wiley和Sons,1995)；Harwood,C.R.和Cutting,S.M.編著、《芽孢桿菌的分子生物學(xué)方法》(MolecularBiological Methods for Bacillus)(John wiley和Sons,1990)。
用于DNA操作的酶根據(jù)供應(yīng)商的說明使用。用于DNA操作的酶除非另外提到，用于DNA操作的所有的酶，如限制性內(nèi)切酶、連接酶等，均購自新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司(New England Biolabs,Inc)。隨機(jī)誘變文庫的構(gòu)建進(jìn)行定位隨機(jī)誘變合成誘變引物(寡核苷酸)，除了相應(yīng)于待誘變的氨基酸密碼子的核苷酸以外它還相應(yīng)于待誘變的DNA序列部分。
然后，產(chǎn)生的誘變引物與合適的反向引物(opposite primer)被用于PCR反應(yīng)。產(chǎn)生的PCR片段經(jīng)純化并消化后克隆到穿梭載體中。
如果需要的話，產(chǎn)生的PCR片段還作為引物與另一個(gè)合適的反向引物被用于另一個(gè)PCR反應(yīng)，將被誘變的區(qū)域消化并克隆到穿梭載體中。PCR反應(yīng)在正常的條件下進(jìn)行。蛋白酶解活性在本發(fā)明的上下文中，蛋白酶解活性以Kilo Novo蛋白酶單位(KNPU)表示。該活性是相對于標(biāo)準(zhǔn)酶(SAVINASEO)測定的，測定是根據(jù)在標(biāo)準(zhǔn)條件下，即50℃,pH8.3,9分鐘反應(yīng)時(shí)間，3分鐘檢測時(shí)間，由蛋白酶消化二甲基酪蛋白(DMC)溶液進(jìn)行的。手冊(folder)AF220/1可以向Novo Nordisk A/S，丹麥索取，該手冊在此引入作為參考。
一個(gè)GU是一個(gè)甘氨酸單位，被定義為蛋白酶活性，即在標(biāo)準(zhǔn)條件下，經(jīng)過15分鐘40℃溫育，以N-乙酰酪蛋白為底物，產(chǎn)生相當(dāng)于1mmole甘氨酸的NH2-基的量。
酶活性還可以根據(jù)在“美國石油化學(xué)家學(xué)會雜志”(the Journal ofAmerican Oil Chemists Society)Rothgeb,T.M.,Goodlander,B.D.,Garrison,P.H.，和Smith,L.A.,(1988)中描述的一個(gè)用琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯基-丙氨酸-對-硝基苯酚的反應(yīng)，用PNA法進(jìn)行測定。發(fā)酵枯草桿菌酶的發(fā)酵是將含有100毫升BPX培養(yǎng)基的500毫升帶擋板的Erlenmeyer搖瓶在30℃下，在旋轉(zhuǎn)搖床上(300轉(zhuǎn)/分)上培養(yǎng)5天。
為了得到如2升發(fā)酵液，20個(gè)Erlenmeyer搖瓶同時(shí)發(fā)酵。具有增強(qiáng)的蛋白自身酶解穩(wěn)定性的蛋白酶的測試分析含有蛋白酶的樣品是通過將菌株(包括參考菌株)在微滴板上或在搖瓶中生長在合適的允許表達(dá)蛋白酶的培養(yǎng)基上得到的。
將每一個(gè)含蛋白酶的樣品進(jìn)行等分，向每一等份中加入1/10體積的2M的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液；pH10，將各等份分別在4℃和55℃溫育3個(gè)小時(shí)。
溫育后，蛋白酶活性用0.6克/升底物琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯基-丙氨酸-對-硝基苯酚在下述緩沖液中進(jìn)行測定150mM氯化鉀，50mM硼酸鈉；pH調(diào)至9.0。
將20微升樣品和180微升底物在96孔微滴板上混合。
在405nm形成顏色在一個(gè)微量培養(yǎng)板讀數(shù)儀中測定。
以Savinase為標(biāo)準(zhǔn)測定活性。
樣品的殘余活性計(jì)算為55℃溫育時(shí)等份的蛋白酶活性占4℃溫育時(shí)等份的蛋白酶活性的百分比。
鑒定了表現(xiàn)出增強(qiáng)的殘余活性的蛋白酶。培養(yǎng)基BPX組成(每升)土豆淀粉100克大麥粉 50克黃豆粉 20克十二水合磷酸氫二鈉 9克Pluronic 0.1克酪蛋白酸鈉 10克培養(yǎng)基中的淀粉用α淀粉酶加以液化并在120℃加熱滅菌45分鐘。滅菌后培養(yǎng)基的pH通過加入0.1M的碳酸氫鈉調(diào)至9。實(shí)施例為了產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的酶變異體，采用與下面資料相同的材料和方法，如WO89/06279(Novo Nordisk A/S),EP130,756(Genentech),EP479,870(Novo Nordisk A/S),EP214,435(Henkel),WO87/04461(Amgen),WO87/05050(Genex),EP申請87303761(Genentech),EP260,105(Genencor),WO88/06624(Gist-Brocades NV),WO88/07578(Genentech),WO88/08028(Genex),WO88/08033(Amgen),WO88/08164(Genex),Thomas等，(1985)自然，318,375-376；Thomas等，(1987)分子生物學(xué)雜志，193,803-813；Russel和Fersht(1987)自然，328,496-500。本領(lǐng)域中建立的其它方法也可以采用。實(shí)施例1酶變異體的構(gòu)建和表達(dá)枯草桿菌酶309定點(diǎn)變異體是分別由Deng等，生物化學(xué)年報(bào)，200:81-88(1992)和Markvardsen等，生物技術(shù)，18(3):371-372(1995)描述的“單一位點(diǎn)消除USE”或“尿嘧啶-單一位點(diǎn)消除”技術(shù)得到的。
模板質(zhì)粒為pJS3，或其含有枯草桿菌酶309的變異體的類似物，例如“單一位點(diǎn)消除”誘變是在pJS3的類似物上進(jìn)行的，該類似物含有編碼Y167I+R170L變異體的基因，且用寡核苷酸指導(dǎo)構(gòu)建A194P變異體，產(chǎn)生最終的Y167I+R170L+A194P枯草桿菌309變異體。
在pJS3中構(gòu)建的枯草桿菌309變異體再利用限制性酶KpnⅠ和MluⅠ亞克隆至枯草芽孢桿菌pSX222表達(dá)載體中。
將此構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)枯草芽孢桿菌菌株以純化在含10微克/毫升氯霉素(CAM)的培養(yǎng)基中按上述發(fā)酵的蛋白酶。實(shí)施例二酶變異體的純化此步驟涉及2升發(fā)酵規(guī)模的枯草桿菌蛋白酶147酶、枯草桿菌蛋白酶309酶或其突變體的純化。
大約1.6升發(fā)酵液在1升杯中經(jīng)5000轉(zhuǎn)/分鐘離心35分鐘。上清液用10％乙酸調(diào)pH至6.5并用Seitz(出處同前)S100過濾板過濾。
濾液用裝有Amicon S1Y10 UF筒的Amicon CH2A UF設(shè)備濃縮至大約400毫升。UF濃縮液經(jīng)離心和過濾后在pH7，室溫下被吸附到桿菌肽親和柱上。蛋白酶從桿菌肽柱上在室溫下用25％2-丙醇和1M氯化鈉在有0.01M二甲基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化鈣(pH調(diào)至7)的緩沖液中被洗脫下來。
將從桿菌肽純化步驟得到的具有蛋白酶活性的級分合并后上750毫升Sephadex G25柱(直徑5厘米)，此柱已用pH調(diào)至6.5的含有0.01M二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化鈣的緩沖液平衡。
將從Sephadex G25柱得到的具有蛋白活性的級分合并后上150毫升CM Sepharose CL 6B陽離子交換柱(直徑5厘米)，此柱用pH調(diào)至6.5的含有0.01M二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化鈣的緩沖液平衡。
蛋白酶用0-0.1M線性梯度的氯化鈉在2升相同的緩沖液(對枯草桿菌蛋白酶147采用0-0.2M氯化鈉)中洗脫。
在最后純化步驟中，將從CM Sepharose柱得到的含有蛋白酶的級分合并再用裝有GR81PP膜的Amicon超濾杯(購自丹麥糖廠公司)進(jìn)行濃縮。
通過使用實(shí)施例1的構(gòu)建技術(shù)和上面的分離步驟，產(chǎn)生并分離了下面的枯草桿菌蛋白酶309變異體A:Y167I+R170L+A133PB:Y167I+R170L+T134PC:Y167I+R170L+A133P+T134PD:Y167I+R170L+V104C+S132CE:Y167I+R170L+A108C+T134CF:Y167A+R170S+F189AG:Y167A+R170S+Y192AH:Y167A+R170S+Y192PI:Y167A+R170S+Y192A+A194PJ:Y167A+R170S+Y192P+A194PK:Y167A+R170S+F189GL:Y167A+R170S+F189EM:Y167A+R170S+F189RN:Y167I+R170LM:Y167I+R170L+A194PO:Y167A+R170S+A194PP:Y167A+R170L+A194PQ:Y167A+R170N+A194PR:V104C+S132C+Y167I+R170LS:A108C+T134C+Y167I+R170L實(shí)施例3自身酶解切割位點(diǎn)的鑒定Savinase變異體N:167I+R170L(按上述純化后)的級分通過SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)含有兩個(gè)帶，推測由自身酶解降解產(chǎn)生。兩個(gè)帶分別以12kDa和10kDa的遷移率(Mr′s)遷移。構(gòu)成這兩個(gè)帶的肽的N-端氨基酸序列通過SDS-PAGE和電印跡轉(zhuǎn)移到PVDF膜上測定。
發(fā)現(xiàn)以12kDa的遷移率遷移的帶的N-端氨基酸序列為丙氨酸-谷氨酰氨-絲氨酸-纈氨酸-脯氨酸-色氨酸-甘氨酸-異亮氨酸-絲氨酸-，與N:Y167I+R170L的N-端氨基酸序列相同。
發(fā)現(xiàn)以10kDa的遷移率遷移的帶的N-端氨基酸序列為甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-異亮氨酸-纈氨酸-丙氨酸-脯氨酸-，與N:Y167I+R170L的氨基酸殘基187-195(在以BPN編號中為殘基193和201)的氨基酸序列相同。這樣鑒定了在N:Y167I+R170L中氨基酸殘基186和187(以BPN編號為殘基192和193)之間的肽鍵為自身酶解切割位點(diǎn)。
矩陣輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜法顯示兩個(gè)組分的質(zhì)量分別為12,997.5kDa±13kDa和8,397.8kDa±8kDa。
含有N:Y167I+R170L中氨基酸殘基187至269(在BPN編號中為殘基193至275)的自身酶解片段的理論質(zhì)量為8,397.3kDa，因此證實(shí)了沒有其它的自身酶解切割發(fā)生在C末端至殘基186。
利用較大片段的質(zhì)量值(12,997.5kDa)，有可能推測出其它自身酶解切割發(fā)生在N:Y167I+R170L中的氨基酸殘基130和131(以BPN編號為殘基132和133)之間。含有N:Y167I+R170L中氨基酸殘基1至130(以BPN編號為殘基1至132)的自身酶解片段的理論質(zhì)量為12,699.1kDa。
為了證實(shí)這些在N:Y167I+R170L中自身酶解切割位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，將蛋白酶在37℃以2毫克/毫升的濃度在0.1M磷酸鈉中溫育，pH7.5溫度。在從0分鐘到6小時(shí)的不同的時(shí)間點(diǎn)，從溫育混合液中取20微升樣品，加入80微升1％TFA導(dǎo)致N:Y167I+R170L的蛋白酶活性的不可逆的抑制。樣品置于冰箱中直到進(jìn)行矩陣輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析。
質(zhì)譜法的結(jié)果清楚地顯示出質(zhì)量分別為12698.9kDa±13kDa和8396.1kDa±8kDa片段的數(shù)量穩(wěn)定的增加，以及質(zhì)量為26607.0kDa±26kDa的組分穩(wěn)定的減少。N:Y167I+R170L的理論質(zhì)量為26605.4kDa。實(shí)施例4隨機(jī)蛋白酶變異體的構(gòu)建在蛋白自身酶解切割位點(diǎn)132-133的附近構(gòu)建3個(gè)隨機(jī)文庫。在三個(gè)文庫的每一個(gè)中，用BLS309變異體Y167I+R170L作為模板。
氨基酸1)129-131,2)132-133,3)134-135三個(gè)文庫的構(gòu)建根據(jù)上述材料與方法中的描述制備。
合成一個(gè)寡核苷酸，在待誘變的氨基酸密碼子處，其第一個(gè)和第二個(gè)堿基是四種堿基中每一種堿基占25％。密碼子的第三個(gè)核苷酸(擺動(dòng)堿基)的合成采用50％G/50％C，為用一個(gè)或兩個(gè)密碼子改變氨基酸提供更大的可能性。
誘變引物和一個(gè)合適的反向引物被用于PCR反應(yīng)，以質(zhì)粒pJS3:(Y167I+R170L)為模板。產(chǎn)生的PCR片段被純化并作為引物與另一個(gè)合適的反向引物用于另一個(gè)PCR反應(yīng)。這個(gè)步驟的優(yōu)點(diǎn)是能夠?qū)⒄T變的區(qū)域消化并克隆到pJS3穿梭載體中。
區(qū)域129-131、132-133、134-135的文庫已被制備，每個(gè)文庫含有10000到80000個(gè)克隆。
十個(gè)隨機(jī)選擇的克隆被測序以證實(shí)設(shè)計(jì)的突變。實(shí)施例5具有增強(qiáng)的蛋白自身酶解活性的蛋白酶變異體的鑒定根據(jù)實(shí)施例4所述構(gòu)建的文庫中的克隆按上述方法測驗(yàn)蛋白自身酶解穩(wěn)定性。
對每個(gè)文庫500個(gè)獨(dú)立的克隆在微滴板中含10微克/毫升氯霉素(CAM)的200微升LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜。
以SAVINASE變異體N:Y167I+R170L作為參照菌株，鑒定了兩個(gè)具有相對增強(qiáng)的蛋白自身酶解穩(wěn)定性的變異體，X:A133D+Y167I+R170L,Y:P129K+Y167I+R170L，和GG:P129K+P131H+Y167I+R170L。
這說明位于132-133之間蛋白自身酶解切割位點(diǎn)附近的替換(P129K,P131H,A133D)提供了增強(qiáng)的蛋白自身酶解穩(wěn)定性。實(shí)施例6用具有增強(qiáng)的蛋白自身酶解穩(wěn)定性的變異體進(jìn)行比較性發(fā)酵實(shí)驗(yàn)在發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中SAVINASE的變異體“M:Y167I+R170L+A194P”與其前體變異體相比較其前體變異體“N:Y167I+R170L”沒有在192-193之間蛋白自身酶解切割位點(diǎn)附近的A194P的替換。
兩個(gè)變異體都克隆在pSX222表達(dá)載體背景中，并按上述在含有10微克/毫升氯霉素的100毫升BPX培養(yǎng)基中發(fā)酵。
經(jīng)過5天發(fā)酵，將1.5毫升BPX發(fā)酵培養(yǎng)基離心，上清液按上述進(jìn)行蛋白酶活性測定。
含有“M:Y167I+R170L+A194P”變異體的發(fā)酵培養(yǎng)基與含有“N:Y167I+R170L”變異體的發(fā)酵培養(yǎng)基相比具有明顯較高水平的蛋白酶活性。
現(xiàn)在相信兩個(gè)變異體具有相同的比活性，所以現(xiàn)在認(rèn)為含有“M:Y167I+R170L+A194P”變異體的發(fā)酵培養(yǎng)基的較高的蛋白酶活性水平是由于與沒有A194P替換的“N:Y167I+R170L”前體變異體相比，“M:Y167I+R170L+A194P”變異體具有相對增強(qiáng)的蛋白自身酶解穩(wěn)定性。
用變異體O:Y167A+R170S+A194P,P:Y167A+R170L+A194P和Q:Y167A+R170N+A194P與其相應(yīng)的沒有A194P突變的前體變異體相比，也得到了相似的結(jié)果。
另外，用變異體HH:A133P+Y167A+R170S與其相應(yīng)的沒有A133P突變的前體變異體相比也得到了相似的結(jié)果，顯示出替換A133P提供增強(qiáng)的蛋白自身酶解活性。
權(quán)利要求
1．一種枯草桿菌酶變異體，其特征在于衍生自在殘基132和133(以BASBPN編號)之間具有蛋白自身酶解切割位點(diǎn)的前體枯草桿菌酶，其還通過在位于相應(yīng)于BLS309的殘基129、130、131、132、133、134、135、136(以BASBPN編號)位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)殘基的替換、插入或缺失進(jìn)行改造；籍此該變異體與其前體枯草桿菌酶相比顯示出增強(qiáng)的蛋白自身酶解穩(wěn)定性。
2．一種枯草桿菌酶變異體，其特征在于衍生自在相應(yīng)于BLS309的殘基G159、S164、I165、Y167、R170、Y171(以BASBPN編號)位點(diǎn)上具有一個(gè)或多個(gè)殘基的改造的前體枯草桿菌酶變異體，其還通過在相應(yīng)于殘基129、130、131、132、133、134、135、136(以BASBPN編號)位點(diǎn)中一個(gè)或多個(gè)殘基的替換、插入或缺失進(jìn)行改造；籍此該變異體與其在任何所說的位點(diǎn)129-136上都沒有改造的前體枯草桿菌酶變異體相比顯示出增強(qiáng)的蛋白自身酶解穩(wěn)定性。
3．一種枯草桿菌酶變異體，其特征在于衍生自在殘基192和193(以BASBPN編號)之間具有蛋白自身酶解切割位點(diǎn)的前體枯草桿菌酶，其還通過在位于相應(yīng)于殘基189、190、191、192、193、196(以BASBPN編號)位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)殘基的替換、插入或缺失進(jìn)行改造；籍此該變異體與其前體枯草桿菌酶相比顯示出增強(qiáng)的蛋白自身酶解穩(wěn)定性。
4．一種枯草桿菌酶變異體，其特征在于衍生自在位于相應(yīng)于BLS309的殘基P129、P131、E136、G159、S164、I165、Y167、R170、Y171(以BASBPN編號)位點(diǎn)上具有一個(gè)或多個(gè)殘基的改造的前體枯草桿菌酶變異體，其還通過在位于相應(yīng)于BLS309的殘基189、190、191、192、193、194、195、196(以BASBPN編號)位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)殘基的替換、插入或缺失進(jìn)行改造；籍此該變異體與其在任何所說的位點(diǎn)189-196上都沒有改造的前體枯草桿菌酶變異體相比顯示出增強(qiáng)的蛋白自身酶解穩(wěn)定性。
5．根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)的枯草桿菌酶變異體，其中所說的前體枯草桿菌酶在兩處進(jìn)行改造ⅰ)在位于相應(yīng)于BLS309殘基129、130、131、132、133、134、135、136(以BASBPN編號)位點(diǎn)上的一個(gè)或多個(gè)殘基，以及ⅱ)在位于相應(yīng)于BLS309的殘基189、190、191、192、193、194、195、196(以BASBPN編號)位點(diǎn)上的一個(gè)或多個(gè)殘基。
6．權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)的變異體，其中前體枯草桿菌酶選自I-S1亞組。
7．權(quán)利要求6的變異體，其中前體枯草桿菌酶選自包括ABSS168、BASBPN、BSSDY和BLSCAR，或者是其保留了I-S1亞組特征的功能性變異體的組。
8．權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)的變異體，其中前體枯草桿菌酶選自I-S2亞組。
9．權(quán)利要求8的變異體，其中前體枯草桿菌酶選自包括BLS147、BLS309、BAPB92和BYSYAB，或者是其保留了I-S2亞組特征的功能性變異體的組。
10．權(quán)利要求8的變異體，其中母體枯草桿菌酶為TVTHER或者是其保留了I-S2亞組特征的功能性變異體。
11．權(quán)利要求1到10中任一項(xiàng)的變異體，其中所說的替換與在至少一個(gè)其它位點(diǎn)的替換、插入或缺失相結(jié)合。
12．權(quán)利要求11的變異體，其中所說的替換與任何一個(gè)或多個(gè)在位點(diǎn)36、222、218、76的替換、插入或缺失相結(jié)合。
13．權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)的變異體，其是下列任何一個(gè)的組合T129V,T129I,T129L,T129M,T129FA129V,A129I,A129L,A129M,A129FG131V,G131I,G131L,G131M,G131FK136V,K136I,K136L,K136M,K136F,S159V,S159I,S159L,S159M,S159F,T164V,T164I,T164L,T164M,T164F,K170V,K170I,K170L,K170M,K170F,Q136V,Q136I,Q136L,Q136M,Q136F,T159V,T159I,T159L,T159M,T159F,A164V,A164I,A164L,A164M,A164F,Y170V,Y170I,Y170L,Y170M,Y170F,Y171A,Y171H,Y171N,Y171P,Y171C,Y171W,Y171Q,Y171S,Y171T,Y171GY171V,Y171I,Y171L,Y171M,Y171FE136V,E136I,E136L,E136M,E136F,G159V,G159I,G159L,G159M,G159F,G164V,G164I,G164L,G164M,G164F,S164V,S164I,S164L,S164M,S164F,Y167A,Y167H,Y167N,Y167P,Y167C,Y167W,Y167Q,Y167S,Y167T,Y167GY167V,Y167I,Y167L,Y167M,Y167FR170A,R170H,R170N,R170P,R170C,R170WR170Q,R170S,R170T,R170Y,R170GR170V,R170I,R170L,R170M,R170F,與在任何一個(gè)下列位點(diǎn)129、130、131、132、133、134、135、136(以BASBPN編號)的一個(gè)或多個(gè)改造相結(jié)合。
14．權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)的變異體，其是任何一個(gè)下列改造的組合T129V,T129I,T129L,T129M,T129FA129V,A129I,A129L,A129M,A129FG131V,G131I,G131L,G131M,G131FK136V,K136I,K136L,K136M,K136F,S159V,S159I,S159L,S159M,S159F,T164V,T164I,T164L,T164M,T164F,K170V,K170I,K170L,K170M,K170F,Q136V,Q136I,Q136L,Q136M,Q136F,T159V,T159I,T159L,T159M,T159F,A164V,A164I,A164L,A164M,A164F,Y170V,Y170I,Y170L,Y170M,Y170F,Y171A,Y171H,Y171N,Y171P,Y171C,Y171W,Y171Q,Y171S,Y171T,Y171GY171V,Y171I,Y171L,Y171M,Y171FE136V,E136I,E136L,E136M,E136F,G159V,G159I,G159L,G159M,G159F,G164V,G164I,G164L,G164M,G164F,S164V,S164I,S164L,S164M,S164F,Y167A,Y167H,Y167N,Y167P,Y167C,Y167W,Y167Q,Y167S,Y167T,Y167GY167V,Y167I,Y167L,Y167M,Y167FR170A,R170H,R170N,R170P,R170C,R170WR170Q,R170S,R170T,R170Y,R170GR170V,R170I,R170L,R170M,R170F,與在任何一個(gè)下列位點(diǎn)189、190、191、192、193、194、195、196(以BASBPN編號)的一個(gè)或多個(gè)改造相結(jié)合。
15．權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)的變異體，是任何一個(gè)下列改造的組合T129V,T129I,T129L,T129M,T129FA129V,A129I,A129L,A129M,A129FG131V,G131I,G131L,G131M,G131FK136V,K136I,K136L,K136M,K136F,S159V,S159I,S159L,S159M,S159F,T164V,T164I,T164L,T164M,T164F,K170V,K170I,K170L,K170M,K170F,Q136V,Q136I,Q136L,Q136M,Q136F,T159V,T159I,T159L,T159M,T159F,A164V,A164I,A164L,A164M,A164F,Y170V,Y170I,Y170L,Y170M,Y170F,Y171A,Y171H,Y171N,Y171P,Y171C,Y171W,Y171Q,Y171S,Y171T,Y171GY171V,Y171I,Y171L,Y171M,Y171FE136V,E136I,E136L,E136M,E136F,G159V,G159I,G159L,G159M,G159F,G164V,G164I,G164L,G164M,G164F,S164V,S164I,S164L,S164M,S164F,Y167A,Y167H,Y167N,Y167P,Y167C,Y167W,Y167Q,Y167S,Y167T,Y167GY167V,Y167I,Y167L,Y167M,Y167FR170A,R170H,R170N,R170P,R170C,R170WR170Q,R170S,R170T,R170Y,R170GR170V,R170I,R170L,R170M,R170F；與在任何一個(gè)下列位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)改造相結(jié)合ⅰ)130、131、132、133、134、135、136(以BASBPN編號)以及ⅱ)190、191、192、193、194、195、196(以BASBPN編號)。
16．權(quán)利要求1到15中任一項(xiàng)的變異體，其中所說的變異體與在任何一個(gè)下列位點(diǎn)的進(jìn)一步的替換、缺失和/或插入相結(jié)合27、36、57、76、97、101、104、120、123、206、218、222、224、235和274。
17．權(quán)利要求16的變異體，其中所說的枯草桿菌酶屬于I-S2亞組，所說的進(jìn)一步的改變選自K27R、*36D、S57P、N76D、G97N、S101G、V104A、V104N、V104Y、H120D、N123S、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、K235L和T274A。
18．權(quán)利要求17的變異體，它包括任何一個(gè)變異體V104N+S101G、K27R+V104Y+N123S+T274A或N76D+V104A，或這些突變(V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V104A)的其它組合，與在權(quán)利要求1到17的任何一個(gè)中提到的任何一個(gè)或多個(gè)替換、缺失和/插入相結(jié)合。
19．權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)的變異體，選自包括至少下列突變的變異體組A: Y167I+R170L+A133PB:Y167I+R170L+T134PC:Y167I+R170L+A133P+T134PD:Y167I+R170L+V104C+S132CE:Y167I+R170L+A108C+T134CF:Y167A+R170S+F189AG:Y167A+R170S+Y192AH:Y167A+R170S+Y192PI:Y167A+R170S+Y192A+A194PJ:Y167A+R170S+Y192P+A194PK:Y167A+R170S+F189GL:Y167A+R170S+F189EM:Y167A+R170S+F189RN:Y167I+R170LM:Y167I+R170L+A194PO:Y167A+R170S+A194PP:Y167A+R170L+A194PQ:Y167A+R170N+A194PR:V104C+S132C+Y167I+R170LS:A108C+T134C+Y167I+R170LT:V104C+S132C+Y167A+R170SU:V104C+S132C+Y167A+R170LV:V104C+S132C+Y167A+R170NX:A133D+Y167I+R170LY:P129K+Y167I+R170LZ:A133P+Y167A+R170S+A194PAA:T134P+Y167A+R170S+A194PBB:A133P+T134P+Y167A+R170S+A194PCC:A133P+Y167A+R170N+A194PDD:T134P+Y167A+R170N+A194PEE:A133P+T134P+Y167A+R170N+A194PFF:A133P+Y167A+R170LGG:P129K+P131H+Y167I+R170LHH:A133P+Y167A+R170SII:A133P+Y167A+R170NJJ:Y167A+R170S+F189KKK:V104C+T134C+Y167A+R170S
20．一種鑒定表現(xiàn)蛋白自身酶解穩(wěn)定性的蛋白酶變異體的方法，其包括在至少一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)于BLS309的氨基酸P129、P131、E136、G159、S164、I165、Y167、R170、Y171的位點(diǎn)上(以BASBPN編號)誘變編碼枯草桿菌酶或其前體酶或前原酶的DNA；方法是用該突變的DNA轉(zhuǎn)化芽孢桿菌菌株；選擇產(chǎn)生這種蛋白酶變異體的菌株；發(fā)酵/培養(yǎng)該菌株；回收所述蛋白酶變異體，以及檢測提高的儲存穩(wěn)定性和/或在去污劑中的洗滌效果。
21．一種產(chǎn)生突變體枯草桿菌酶的方法，其包括根據(jù)權(quán)利要求20的步驟進(jìn)行鑒定后生產(chǎn)具有需要的增強(qiáng)的蛋白自身酶解穩(wěn)定性的突變體枯草桿菌酶。
22．一種編碼權(quán)利要求1到19中任一項(xiàng)的枯草桿菌酶變異體的DNA序列。
23．一種含有權(quán)利要求22的DNA序列的載體。
24．一種用權(quán)利要求23的載體轉(zhuǎn)化的微生物宿主細(xì)胞。
25．權(quán)利要求24的微生物宿主，它是一種細(xì)菌，優(yōu)選地是芽孢桿菌，特別是遲緩芽孢桿菌。
26．權(quán)利要求24的微生物宿主，它是一種真菌或酵母，優(yōu)選地是絲狀真菌，特別是曲霉。
27．一種產(chǎn)生權(quán)利要求1到19中任一項(xiàng)的變異體的方法，其中權(quán)利要求24到26的任一項(xiàng)的宿主培養(yǎng)在有助于表達(dá)和分泌該變異體的條件下，并回收所述變異體。
28．一種含有根據(jù)權(quán)利要求1到19中任一項(xiàng)的枯草桿菌酶變異體的組合物。
29．根據(jù)權(quán)利要求28的組合物，它額外地含有纖維素酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、氧化還原酶、另一種蛋白酶，或淀粉酶。
30．根據(jù)權(quán)利要求28或29的組合物，其中的組合物是去污劑組合物。
31．根據(jù)權(quán)利要求1到19中任一項(xiàng)的枯草桿菌酶變異體或根據(jù)權(quán)利要求28到30中任一項(xiàng)的酶組合物在洗衣用去污劑和/或洗盤用去污劑中的用途。
32．權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)的變異體，其選自包括至少下列突變并與一個(gè)或兩個(gè)A194P和/或A133P突變相結(jié)合的變異體組；R170AR170CR170FR170GR170HR170IR170LR170NR170MR170PR170QR170SR170TR170VR170YY167A+R170AY167C+R170AY167F+R170AY167G+R170AY167H+R170AY167I+R170AY167L+R170AY167M+R170AY167N+R170AY167P+R170AY167Q+R170AY167S+R170AY167T+R170AY167V+R170AY167A+R170CY167C+R170CY167F+R170CY167G+R170CY167H+R170CY167I+R170CY167L+R170CY167M+R170CY167N+R170CY167P+R170CY167Q+R170CY167S+R170CY167T+R170CY167V+R170CY167A+R170FY167C+R170FY167F+R170FY167G+R170FY167H+R170FY167I+R170FY167L+R170FY167M+R170FY167N+R170FY167P+R170FY167Q+R170FY167S+R170FY167T+R170FY167V+R170FY167A+R170GY167C+R170GY167F+R170GY167G+R170GY167H+R170GY167I+R170GY167L+R170GY167M+R170GY167N+R170GY167P+R170GY167Q+R170GY167S+R170GY167T+R170GY167V+R170GY167A+R170HY167C+R170HY167F+R170HY167G+R170HY167H+R170HY167I+R170HY167L+R170HY167M+R170HY167N+R170HY167P+R170HY167Q+R170HY167S+R170HY167T+R170HY167V+R170HY167A+R170IY167C+R170IY167F+R170IY167G+R170IY167H+R170IY167I+R170IY167L+R170IY167M+R170IY167N+R170IY167P+R170IY167Q+R170IY167S+R170IY167T+R170IY167V+R170IY167A+R170LY167C+R170LY167F+R170LY167G+R170LY167H+R170LY167I+R170LY167L+R170LY167M+R170LY167N+R170LY167P+R170LY167Q+R170LY167S+R170LY167T+R170LY167V+R170LY167A+R170MY167C+R170MY167F+R170MY167G+R170MY167H+R170MY167I+R170MY167L+R170MY167M+R170MY167N+R170MY167P+R170MY167Q+R170MY167S+R170MY167T+R170MY167V+R170MY167A+R170NY167C+R170NY167F+R170NY167G+R170NY167H+R170NY167I+R170NY167L+R170NY167M+R170NY167N+R170NY167P+R170NY167Q+R170NY167S+R170NY167T+R170NY167V+R170NY167A+R170PY167C+R170PY167F+R170PY167G+R170PY167H+R170PY167I+R170PY167L+R170PY167M+R170PY167N+R170PY167P+R170PY167Q+R170PY167S+R170PY167T+R170PY167V+R170PY167A+R170QY167C+R170QY167F+R170QY167G+R170QY167H+R170QY167I+R170QY167L+R170QY167M+R170QY167N+R170QY167P+R170QY167Q+R170QY167S+R170QY167T+R170QY167V+R170QY167A+R170SY167C+R170SY167F+R170SY167G+R170SY167H+R170SY167I+R170SY167L+R170SY167M+R170SY167N+R170SY167P+R170SY167Q+R170SY167S+R170SY167T+R170SY167V+R170SY167A+R170TY167C+R170TY167F+R170TY167G+R170TY167H+R170TY167I+R170TY167L+R170TY167M+R170TY167N+R170TY167P+R170TY167Q+R170TY167S+R170TY167T+R170TY167V+R170TY167A+R170VY167C+R170VY167F+R170VY167G+R170VY167H+R170VY167I+R170VY167L+R170VY167M+R170VY167N+R170VY167P+R170VY167Q+R170VY167S+R170VY167T+R170VY167V+R170VY167A+R170YY167C+R170YY167F+R170YY167G+R170YY167H+R170YY167I+R170YY167L+R170YY167M+R170YY167N+R170YY167P+R170YY167Q+R170YY167S+R170YY167T+R170YY167V+R170Y
全文摘要
提供了通過誘變一系列枯草桿菌酶(subtilase)的基因并在合適的宿主中表達(dá)經(jīng)誘變的基因而產(chǎn)生的酶。與其野生型母體酶相比,這些酶表現(xiàn)出增強(qiáng)的蛋白自身酶解(autoproteolytic)穩(wěn)定性。
文檔編號C12N15/57GK1235637SQ97199372
公開日1999年11月17日 申請日期1997年11月4日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月4日
發(fā)明者C·馮德奧斯坦, T·哈凱爾, C·安德森, P·巴迪特茨, P·K·漢森 申請人:諾沃挪第克公司 被以下專利引用 (1),