鄰苯二甲酸二丁酯人工免疫原dbp-bsa制備及用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鄰苯二甲酸二丁酯人工免疫原DBP-BSA的制備及用途，具體是 一種用于新興持久性有機污染物一一塑化劑類免疫檢測的鄰苯二甲酸二丁酯人工免疫原 DBP-BSA及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002] 鄰苯二甲酸酯類塑化劑（縮寫為PAEs)，又稱酞酸酯類，是一類由鄰苯二甲酸與含 有4-15個碳的醇發(fā)生費歇爾（Fischer)酯化反應所形成的酯的重要衍生物的統稱。這類物 質有特殊性氣味，毒性較大，一般情況下狀態(tài)為粘稠液體；液態(tài)條件下溫度范圍寬，流動性 大，揮發(fā)性低，不溶于水，易溶于大多數有機溶劑。這類物質用途廣泛，它不僅可作為食品包 裝材料、玩具、農藥載體、驅蟲劑、潤滑劑、乙烯地板和壁紙、去泡劑、清潔劑、醫(yī)用材料（如 人工心臟瓣膜等人工器官、血袋、注射器和膠管）和個人護理用品（主要有化妝品、香味品、 指甲油、頭發(fā)噴霧劑、香皂和洗發(fā)液）等近千種產品的生產原材料，還常作為塑料增塑劑被 用于改造塑料制品性能。
[0003] 鄰苯二甲酸二丁酯（英文名稱：Dimethylphthalate，簡稱DBP)，又名酞酸二丁 酯、避蚊酯、驅蚊油等，CAS號為131-11-3,分子式為C1idH1idO4，分子量為194. 19,無色透明微 黃色油狀液體，稍具芳香味，能與乙醇、乙醚等一般有機溶劑混溶，不溶于水和石油醚；高度 易燃，遇明火、高熱、氧化劑有燃燒的危險。該物質微毒，對眼睛粘膜有較強的刺激性；可能 對胎兒造成傷害，對水生生物有極高毒性；有損害生育能力的危險性；吸入、皮膚接觸及吞 食有毒；人體組織內可蓄積，從而抑制中樞神經系統。由于其具備良好的塑膜性、粘著性和 防水性，故常被用于制作醋酸纖維素的薄膜、清漆涂料、透明紙和成模塑料粉等；還可用作 驅蚊油、聚氟乙烯涂料以及殺蟲劑的溶劑 ]。近些年來，由于頻頻發(fā)現該物質在食品、水體中 的含量過高，因此，該物質含量的檢測便備受關注。
[0004]目前，關于鄰苯二甲酸二丁酯的研究主要集中在水體、沉積物、大氣等環(huán)境領域和 生物體的毒性方面，但樣品的檢測方法方面研究較少。目前對鄰苯二甲酸二丁酯的檢測手 段主要為氣相色譜和高效液相色譜等儀器檢測方法，這些方法雖然準確可靠，但對樣品的 預處理方法和操作人員的專業(yè)性有很高的要求。正因為這些方法的處理復雜、耗時、儀器價 格昂貴而不適合推廣使用，也不利于在環(huán)境污染事故現場快速檢測。為克服這些缺點，尋求 一種快速、簡便、靈敏且經濟實用的分析方法就成為環(huán)境監(jiān)測領域的主要研究方向。
[0005] 20世紀60年代發(fā)展起來的免疫分析（Immunoassay,IA)是基于抗原和抗體的特 異性、可逆性結合反應的分析技術。免疫分析具有常規(guī)理化分析技術無可比擬的選擇性和 高靈敏性，非常適合復雜介質中痕量組分的分析。因此免疫分析具有的特異性強、靈敏度 高、方法快捷簡單、分析通量大、檢測成本低等優(yōu)點，使得該類方法可以滿足簡單、快速、靈 敏地檢測持久性有機污染物的要求。1971年Engvail,VanWeerman等報道了檢測體液中 微量物質的固相免疫分析技術，即酶聯免疫吸附分析法（enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)。目前，ELISA方法已經成為免疫分析方法中重要的組成部分。ELISA方法是 將抗原-抗體之間的免疫反應與酶的高效催化特性有機結合而發(fā)展起來的一種免疫分析 方法。其中，以親和素-生物素信號放大系統為基礎的親和素-生物素化酶聯免疫吸附分 析法，以生物素標記抗體（抗原），并以酶標親和素代替ELISA方法中酶標抗體。親和素是 卵白蛋白中的一種堿性糖蛋白，分子量約為68kDa。一個親和素分子由4個亞單位組成，每 個亞單位都可以與一個生物素分子（分子量為244)特異性結合。生物素與親和素結合特 異性強，其親和力比抗原抗體反應大得多，親和常數高達IO15Mi。由于一個親和素能與4個 生物素分子結合，因此在檢測中可提高被固相結合酶的數量，進而提高檢測方法的靈敏度。
[0006] 目前，尚沒有親和素-生物素化酶聯免疫吸附分析方法檢測鄰苯二甲酸二丁酯的 相關報道。而制備合格的鄰苯二甲酸二丁酯人工免疫原是建立鄰苯二甲酸二丁酯生物免疫 分析檢測方法的關鍵，更是建立DBP免疫檢測分析方法的關鍵，這將具有重要的應用價值 和理論研究意義。

【發(fā)明內容】

[0007] 針對現有技術中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種步驟簡單，速度快，產率高的鄰 苯二甲酸二丁酯人工免疫原（DBP-BSA)的制備方法和用途，為免疫得到特異性抗體和利用 人工抗原、抗體建立免疫檢測方法奠定基礎。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現的：
[0009] 第一方面，本發(fā)明涉及一種鄰苯二甲酸二丁酯的人工免疫原DBP-BSA，結構式如式 (I)所示：
牛血清蛋白BSA偶聯制備人工免疫原DBP-BSA。
[0012] 優(yōu)選的，所述方法具體包括如下步驟：
[0013] S1、將所述DBP半抗原溶于非質子有機溶劑（包括N，N-二甲基甲酰胺（DMF)或二 甲亞砜）中，形成DBP半抗原溶液；
[0014]S2、向所述DBP半抗原溶液中依次滴加（逐滴加入，就是一滴一滴的滴入，每滴之 間沒有間隔，DBP半抗原溶液加入速度過快容易導致重氮鹽制備效率降低）強酸、亞硝酸鈉 溶液（IM)，控制pH為2. 0~3. 0,反應結束后去除未反應的亞硝酸鈉，生成重氮鹽溶液；
[0015] S3、將牛血清蛋白BSA溶于0.01~0.05MpH9. 18 (pH過大或過小，都不利于本發(fā) 明人工免疫原的制備）硼酸鈉緩沖液中，形成牛血清蛋白溶液；
[0016] S4、在所述重氮鹽溶液加入所述牛血清蛋白溶液，用強堿溶液調節(jié)pH直至溶液逐 漸呈橙紅色，攪拌進行偶聯反應，即得所述人工免疫原DBP-BSA。
[0017] 本發(fā)明采用重氮化法合成鄰苯二甲酸二丁酯人工免疫原，其反應方程式如下：
[0018]
[0020] 優(yōu)選的，所述DBP半抗原、強酸、亞硝酸鈉、牛血清蛋白BSA的摩爾比為1:4~ 5:4 ~5:0. 005 ~0. 008。
[0021] 優(yōu)選的，所述強酸選自濃鹽酸、濃硫酸或濃硝酸；所述強堿為氫氧化鈉或氫氧化 鉀。
[0022] 優(yōu)選的，步驟Sl中，所述去除未反應的亞硝酸鈉是加入尿素以去除未反應的亞硝 酸鈉，所述尿素與DBP半抗原的摩爾比為150~160:1。
[0023] 優(yōu)選的，步驟S4中，所述偶聯反應是在0~4°C低溫磁力攪拌下進行；所述攪拌時 間為12~18小時。所有需要保持蛋白活性的長時間反應都需要在低溫情況下進行，經驗 表明0~4°C最合適。此外，為充分反應，根據經驗，當半抗原與強酸、亞硝酸鈉、尿素、BSA 的摩爾比為1:4:4:150:0. 005時攪拌反應12小時就可以，當半抗原與與強酸、亞硝酸鈉、尿 素、BSA的摩爾比為1:5:5:160:0. 008時反應就需要18小時。
[0024] 優(yōu)選的，所述步驟S4還包括偶聯反應結束后，離心分離，將上清液裝入透析袋中 透析，離心分離沉淀即得所述人工免疫原DBP-BSA的步驟。
[0025] 優(yōu)選的，所述DBP半抗原是通過包括如下步驟的方法制備而得：
應，生成4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯；
[0027] 以苯或甲苯為溶劑，所述4-硝基鄰苯二甲酸二甲酯和鋅粉、強酸發(fā)生還原反應， 生成所述DMP半抗原。
[0028] 具體步驟如下：
[0029]Al、將4-硝基鄰苯二甲酸溶于正丁醇后再逐滴滴加強酸A形成反應液a，加熱回流
[0030] A2、將所得式（II)化合物溶于苯或甲苯中形成反應液b，先向反應液b中加入鋅 粉，再反應液b中逐滴加入強酸B溶液，保持還原回流反應，至反應完全，即得DBP半抗原。 DBP半抗原化學名稱為4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯，分子式：C16H23NO4;分子量：293. 35。
[0031 ] 所述強酸A選自濃鹽酸或濃硫酸；所述強酸B選自濃鹽酸或濃硫酸。
[0032] 優(yōu)選的，所述步驟Al中，4-硝基鄰苯二甲酸、正丁醇、強酸A的摩爾比為為1: (6~ 7) : (0. 5~0. 7)，反應溫度為120~130°C，酯化反應時間為6~6. 5小時；所述步驟A2中， 式（II)化合物與強酸B、苯或甲苯、和鋅粉的摩爾比為I: (21~22) : (560~570) : (18~ 19)(其中苯或甲苯作為基質溶液并不參與反應），還原反應反應液b的溫度為25~30°C， 還原反應時間為10~12小時。
[0033] 理想狀態(tài)下，4-硝基鄰苯二甲酸、正丁醇的摩爾比是1:2,但為了反應順利進行， 一般正丁醇的用量是4-硝基鄰苯二甲酸的摩爾量的6倍以上，但不能超過4-硝基鄰苯二 甲酸的摩爾量的7倍；此外，強酸A作為酯化反應的催化劑，所用量一般是原料4-硝基鄰苯 二甲酸摩爾量的0. 5倍以上，但不超過原料4-硝基鄰苯二甲酸摩爾量的0. 7倍；正丁醇在 120°C處于沸騰狀態(tài)，那么130°C更處于沸騰狀態(tài)，反應向右進行。
[0034] 理想狀態(tài)下，4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯、強酸B和純鋅粉的摩爾比是1:10:10,為 確保反應順利向右進行，一般純鋅粉的用量是原料4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯摩爾量的18 倍以上，但不能超過原料4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯摩爾量的19倍；此外，強酸B作為還原 反應的強氧化劑，所用量一般是原料純鋅粉摩爾數的1倍以上，但不超過原料純鋅粉摩爾 數的1. 2倍，而非質子性有機溶劑的摩爾數需要是強氧化劑的摩爾數的25倍以上，但不超 過強氧化劑摩爾數的28倍。
[0035] 優(yōu)選的，所述步驟Al還包括酯化反應完全后，蒸餾除去未反應的正丁醇和生成的 水，再趁熱將液體倒入冰水中，下層的黃色油狀粗