專利名稱：一種檢測鄰苯二甲酸二丁酯含量的elisa方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測鄰苯二甲酸二丁酯含量的ELISA方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來在許多國家和地區(qū)，塑化劑對食品、環(huán)境的污染引起了人們強(qiáng)烈的擔(dān)憂。鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)屬于苯二甲酸酯類化合物，被普遍應(yīng)用于塑料制品、膠水、油漆、指甲油、洗發(fā)水和沐浴液等數(shù)百種產(chǎn)品中。鄰苯二甲酸二丁酯是半揮發(fā)性化合物，不與終產(chǎn)品共價結(jié)合，在生產(chǎn)和生活中，被不斷地釋放到大氣、土壤和水環(huán)境中。環(huán)境中的鄰苯二甲酸二丁酯又通過呼吸、飲食、皮膚接觸等三種途徑進(jìn)入人體。因此，人類正面臨著越來越高的鄰苯鄰苯二甲酸二丁酯暴露風(fēng)險。有研究報告指出我國普通人群DBP日攝入量為12. 2ug/kg bw,高于世界平均水平。動物模型研究和流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)鄰苯二甲酸二丁酯可以引起雄性生殖發(fā)育的障礙。鄰苯二甲酸酯還具有免疫毒性，能導(dǎo)致兒童產(chǎn)生哮喘、濕疹、鼻炎等持久性過敏癥。此夕卜，鄰苯二甲酸二丁酯還能能導(dǎo)致糖尿病、肥胖癥等。因此，鄰苯二甲酸二丁酯檢測已成為食品安全、環(huán)境監(jiān)測、毒理學(xué)研究等領(lǐng)域的重要工作。由于鄰苯二甲酸二丁酯在水環(huán)境、生物體內(nèi)的含量較低，常常在檢測域以下，因此鄰苯二甲酸二丁酯的含量分析是一件非常困難的工作。早期用含同位素14C的DBP飼喂實驗動物，然后檢測體內(nèi)組織中的放射性水平來評價DBP的水平。但是由于DBP在生物體內(nèi)降解快，所檢測到的放射量只是DBP和降解代謝物的總體水平，并不能代表DBP在生物組織內(nèi)的真正含量?，F(xiàn)在DBP的分析多采用氣相色譜(GC)、HLPC、GC-質(zhì)譜聯(lián)用法等色譜分析技術(shù)，但這些技術(shù)需要進(jìn)行樣品前處理等，耗時多，并且有較高的儀器要求，色譜柱等耗材價格昂貴，此外，還需要操作人員有豐富的經(jīng)驗。免疫分析由于選擇性強(qiáng)、靈敏度高，一次可檢測多種樣品，因此把免疫分析技術(shù)應(yīng)用于DBP檢測具有簡便、快速、成本低的優(yōu)點(diǎn)。張明翠等用一種DBP的多克隆抗體，通過免疫組化法分析了水和包裝的食品中DBP的含量。Yanaihara等運(yùn)用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)分析了鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)的含量。但是，這兩個研究都是基于多克隆抗體的免疫分析。多克隆抗體對抗原的專一選擇性、靈敏度上都不及單克隆抗體。多克隆抗體受限于實驗動物，不能無限制的獲取。此外，由于從不同動物個體中獲取的多克隆抗體的選擇性、靈敏度、效價等都不同，因此用多克隆抗體建立同一標(biāo)準(zhǔn)的免疫分析方法就很困難。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供操作簡便、靈敏度高的檢測鄰苯二甲酸二丁酯含量的ELISA方法。本發(fā)明提供兩種酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測生物樣品和非生物樣品中鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)含量。一種是人工抗原包被競爭抑制ELISA法測定DBP的含量，一種是半抗原包被競爭抑制ELISA法測定DBP的含量。本發(fā)明所提供的方法之一是
利用DBP人工抗原DBAP-BSA免疫小鼠而制得DBP單克隆抗體，樣品中DBP和包被抗原DBAP-BSA競爭結(jié)合DBP單克隆抗體，再通過酶聯(lián)二抗的顯色反應(yīng)和抑制率計算，而得到DBP
的含量。 上述方法具體包括如下步驟
1)DBP單克隆抗體的制備；
2)抗體效價的測定 將人工抗原DBAP-BSA于酶標(biāo)板中包被、封閉，與不同稀釋度的DBP單克隆抗體結(jié)合，后續(xù)加酶標(biāo)二抗，顯色，終止，用酶標(biāo)儀測定492nm出的吸光度，吸光度接近1. O處抗體稀釋度為單克隆抗體的工作濃度；
3)標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的建立
將人工抗原DBAP-BSA于酶標(biāo)板中包被，封閉，不同濃度DBP標(biāo)準(zhǔn)溶液與包被抗原競爭結(jié)合DBP單克隆抗體，后續(xù)加酶標(biāo)二抗，顯色，終止，用酶標(biāo)儀測定492nm處的吸光度，以抑制率為縱坐標(biāo)，DBP濃度為橫坐標(biāo)，建立抑制率標(biāo)準(zhǔn)曲線；
4)測定樣品抑制率，通過抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品中DBP含量
將人工抗原DBAP-BSA于酶標(biāo)板中包被，封閉，樣品溶液與包被抗原競爭結(jié)合DBP單克隆抗體，后續(xù)加酶標(biāo)二抗，顯色，終止，用酶標(biāo)儀測定492nm處的吸光度，計算出抑制率，通過抑制率標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品中DBP含量。上述方案中，所述DBP單克隆抗體制備過程如下人工抗原DBAP-BSA免疫小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞與瘤細(xì)胞融合，篩選出陽性雜交瘤細(xì)胞并克隆化；小鼠腹水法大量制備單克隆抗體；再通過硫酸銨沉淀法純化DBP單克隆抗體。上述方案中，將人工抗原DBAP-BSA于酶標(biāo)板中包被的過程為用包被緩沖液將人工抗原DBAP-BSA稀釋到O. 25 μ g/ml或O. 5 μ g/ml, 100 μ L/孔加入酶標(biāo)板中，同時設(shè)置加有100 μ L包被緩沖液的對照孔，4°C過夜。本發(fā)明所提供的方法之二是
利用DBP人工抗原DBAP-BSA免疫小鼠而制得DBP單克隆抗體，樣品中DBP和包被半抗原DBAP競爭結(jié)合DBP單克隆抗體，再通過酶聯(lián)二抗的顯色反應(yīng)和抑制率計算，而得到DBP的含量。上述方法具體包括如下步驟
1)DBP單克隆抗體的制備；
2)抗體效價的測定
將半抗原DBAP于酶標(biāo)板中包被、封閉，與不同稀釋度的DBP單克隆抗體結(jié)合，后續(xù)加酶標(biāo)二抗，顯色，終止，用酶標(biāo)儀測定492nm出的吸光度，吸光度接近1. O處抗體稀釋度為單克隆抗體的工作濃度；
3)標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的建立
將半抗原DBAP于酶標(biāo)板中包被，封閉，不同濃度DBP標(biāo)準(zhǔn)溶液與包被抗原競爭結(jié)合DBP單克隆抗體，后續(xù)加酶標(biāo)二抗，顯色，終止，用酶標(biāo)儀測定492nm處的吸光度，以抑制率為縱坐標(biāo)，DBP濃度為橫坐標(biāo)，建立抑制率標(biāo)準(zhǔn)曲線；4)測定樣品抑制率，通過抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品中DBP含量將半抗原DBAP于酶標(biāo)板中包被，封閉，樣品溶液與包被抗原競爭結(jié)合DBP單克隆抗體，后續(xù)加酶標(biāo)二抗，顯色，終止，用酶標(biāo)儀測定492nm處的吸光度，計算出抑制率，通過抑制率標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品中DBP含量。上述方案中，將半抗原DBAP于酶標(biāo)板中包被過程為
a.酶標(biāo)板的羧化向酶標(biāo)板中每孔加入5%的酸性高錳酸鉀溶液150μ L, 60°C放置Ih ；
b.洗板每孔加入6mol/L HCl 200 μ L,室溫?fù)u動5min，倒出孔內(nèi)液體，拍干，重復(fù)洗3次，以除去二氧化錳顆粒；再用蒸餾水洗3次；
c.包被用蒸餾水稀釋半抗原DBAP至一定濃度，每孔70μ L加到羧化后的酶標(biāo)板中，另設(shè)一不包被孔做空白對照；每孔加入70yL碳二亞胺(EDC)，37°C搖動過夜，用蒸餾水洗3次，拍干備用。本發(fā)明利用DBP單克隆抗體，分別通過人工抗原(或半抗原)包被競爭抑制ELISA法測定DBP的含量。本發(fā)明兩種方法都是利用DBP人工抗原(DBAP-BSA)免疫小鼠而制得DBP單克隆抗體，生物組織樣品(或非生物樣品)中DBP和包被抗原與DBP單克隆抗體競爭結(jié)合，再通過酶聯(lián)二抗的顯色反應(yīng)和抑制率計算而得到DBP的含量。本發(fā)明檢測結(jié)果已得到氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)方法的支持，并得到水樣中添加DBP回收計算的支持。本發(fā)明可以一次處理大量樣品，靈敏度高，方便快捷，穩(wěn)定性好，成本低廉，且由于本發(fā)明的單克隆抗體對DBP特異性強(qiáng)，因此檢測結(jié)果不受其它酞酸酯的影響；由于DBP在生產(chǎn)和生活中的廣泛使用，又易于釋放到環(huán)境中，DBP可以在某些生物體內(nèi)積累和在環(huán)境中大量存在，因此，本發(fā)明可以廣泛適用于檢測生物樣品和非生物樣品中鄰苯二甲酸二丁酯的含量，評價環(huán)境中鄰苯二甲酸二丁酯的污染水平。


圖1是以抑制率為縱坐標(biāo)，DBP濃度為橫坐標(biāo)，建立的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，抑制率的計算公式為I%= (A - Ai)/(A - A0)*100, A為陽性對照孔的吸光度值，Ai為含有濃度為i的DBP孔吸光度值，AO為空白孔的吸光度值。圖2顯示的是分別通過灌胃法、皮膚涂抹法將大鼠暴露于400mg/kg/d的DBP，染毒五天，分別在染毒結(jié)束后的24小時、48小時、72小時取肝組織制成勻漿，通過人工抗原包被競爭抑制ELISA法測定DBP的含量。圖3顯示的是分別通過灌胃法、皮膚涂抹法將大鼠暴露于400mg/kg/d的DBP，染毒五天，分別在染毒結(jié)束后的24小時、48小時、72小時耳部采血，通過人工抗原包被競爭抑制ELISA法測定DBP的含量。圖4顯示的是分別通過灌胃法、皮膚涂抹法將大鼠暴露于400mg/kg/d的DBP，染毒五天，分別在染毒結(jié)束后的24小時、48小時、72小時米集大鼠尿液樣品，通過人工抗原包被競爭抑制ELISA法測定DBP的含量。圖5顯示的是分別通過灌胃法、皮膚涂抹法將大鼠暴露于400mg/kg/d的DBP，染毒五天，分別在染毒結(jié)束后的24小時、48小時、72小時取腎組織制成勻漿，通過人工抗原包被競爭抑制ELISA法測定DBP的含量。
具體實施例方式 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。一、實驗材料1.分泌抗DBP單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株由華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院環(huán)境科學(xué)實驗室保存，可對外發(fā)售。該雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞能穩(wěn)定分泌抗體，生長狀態(tài)良好?！?br> 2. 4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯(DBAP)標(biāo)準(zhǔn)溶液(lmg/ ml) :DBAP50mg溶解于2，5-二甲基呋喃(DMF)并定容到50 ml ο3. DBAP-BSA:用重氮法將DBAP與載體蛋白BSA偶聯(lián)。將60mg (O. 2mM) DBAP溶于2ml 二氧六環(huán)中，攪拌條件下緩慢加入2ml IM的HCl，冷卻至4°C，滴加200 μ 17%的NaNO2溶液，攪拌30min，再將IOml含60mgBSA的O. 2M硼酸鹽緩沖液加入到上述溶液中，繼續(xù)反應(yīng)3h, IOOOOg離心5min,取上清,凝膠層析除去小分子得人工抗原。4. DBP標(biāo)準(zhǔn)溶液(lmg/ ml): DBP50mg溶解于2，5- 二甲基呋喃(DMF)并定容到50ml ο5. 5%酸性高錳酸鉀溶液Ig高錳酸鉀溶于20ml0. 6M的硫酸中，臨時配置。6. EDC (1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)(8 mg/ ml) 8mgEDC溶于IOmlO. 2M 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸MES中，避光保存。7. ELISA檢測用試劑及溶液
I)辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG, Sigma公司。2)包被緩沖液(O. 05M ρΗ9· 6 碳酸緩沖液)=Na2CO3L 59g，NaHCO3 2. 93g，加水稀釋至1000ml，調(diào)pH值到9. 6。3)磷酸鹽緩沖液(pH7. 4 PBS) NaCl 8. 0g, KH2PO4 O. 2g, Na2HPO4 · 12H20 2. 9g或者 Na2HPO41. 15g 稀釋至 1000ml。4)洗滌緩沖液(O. OlM pH7. 4 PBS-Tween-20) NaCl 8. 0g, KH2PO4 O. 2g,Na2HPO4 · 12H20 2. 9g 或者 Na2HPO41. 15g，Tween-20 0. 5ml (用前臨時加入)稀釋至1000ml。5)封閉緩沖液在pH7. 4 PBS緩沖液中加入5%脫脂奶粉。(用時現(xiàn)配)
6)抗體稀釋液在PBS緩沖液中加入O.1%BSA。(用時現(xiàn)配)
7)底物顯色液鄰苯二胺(OPD)(mg)/0. 2mol/L Na2HPO4(ml)/0. lmol/L，檸檬酸(ml)/dH20 (ml) /30%H202 ( μ 1)=4/2. 57/2. 43/5/4。用時現(xiàn)配。8)顯色終止液2M H2SO4,室溫保存。二、實驗方法1.實驗動物染毒處理
6周齡Wistar大鼠購自湖北省疾病控制中心，每籠2-3只飼養(yǎng)在22±3 C和濕度為55± 10%房間里，可自由進(jìn)食和飲水。將DBP溶解在玉米油中分別通過灌胃方式、皮膚涂抹方式暴露5天，暴露劑量為400mg/kg/d，分別在染毒結(jié)束后的24小時、48小時、72小時取大鼠肝、腎組織制成勻漿，或取血液、尿液樣品，進(jìn)行ELISA檢測?？笵BP單克隆抗體制備取10周齡BALB/C小鼠，腹腔注射O. 5ml滅菌石蠟油。10天后。取生長狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞，用PBS漂洗，吹下，IOOOrpm離心5min收集細(xì)胞，O. 4mlPBS重懸細(xì)胞。注射到石蠟處理過的小鼠腹腔內(nèi)，10-12天后收集小鼠腹水，IOOOrpm離心5min沉淀細(xì)胞，收集細(xì)胞上清。硫酸銨沉淀法純化DBP單克隆抗體
1)取腹水與醋酸鹽緩沖液按1:2混合，再加入33μ I正辛酸，室溫攪拌30min，4°C靜置 2h。2)4。。12000g 離心 15min，取上清調(diào) pH 值到 7.4。3)向上清液中加入等體積飽和硫酸銨溶液，攪拌30min，4°C靜置lh。4) 4°C 12000g離心15min，棄上清，用4ml半飽和硫酸銨溶液洗滌后，再溶于PBS中。5)向懸液中加適量飽和硫酸銨溶液使飽和度為33%，攪拌30min，4°C靜置lh。6)4°C 12000g離心15min，棄上清，再溶于PBS中，用100倍體積的PBS4°C透析24h，8h換一次液。7)取透析后樣品測定蛋白含量并用SDS-PAGE檢測抗體純度?？贵w效價測定
O包被用包被緩沖液將人工抗原(DBAP-BSA)稀釋到O. 25 μ g/ml或O. 5 μ g/ml，100 μ L/空加入酶標(biāo)板中，同時設(shè)置加有100 μ L包被緩沖液的對照孔，4°C過夜；
2)封閉倒出酶標(biāo)板內(nèi)孔內(nèi)液體，拍干，每孔加入250μL1%0VA，37°C封閉lh，倒出酶標(biāo)板內(nèi)孔內(nèi)液體，拍干；每孔加入200 μ L洗滌緩沖液洗板，倒出孔內(nèi)液體，拍干；重復(fù)洗3次；
3)用抗體稀釋液將DBP單抗從1:500開始2倍梯度稀釋后加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，37°C孵育lh，倒出酶標(biāo)板內(nèi)孔內(nèi)液體，拍干；每孔加入200 μ L洗滌緩沖液洗板，倒出孔內(nèi)液體，拍干；重復(fù)洗3次；
4)加酶標(biāo)二抗用抗體稀釋液將HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG以1:10000稀釋，100μ L每孔加入酶標(biāo)板中，37°C孵育lh，倒出酶標(biāo)板內(nèi)孔內(nèi)液體，拍干；每孔加入200 μ L洗滌緩沖液洗板，倒出孔內(nèi)液體，拍干；重復(fù)洗3次；
5)顯色每孔加入新鮮配制的底物顯色液，室溫避光反應(yīng)15min；
6)終止每孔加入50μ L 2mol/L H2SO4終止反應(yīng)；
7)用酶標(biāo)儀測定492nm處吸光度值；吸光度接近1.O處的抗體稀釋度1:1600)為抗體的工作濃度；
5.標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線建立
O包被(人工抗原包被競爭抑制ELISA法):人工抗原包被競爭抑制ELISA法用包被緩沖液將人工抗原(DBAP-BSA)稀釋到O. 25 μ g/ml或O. 5 μ g/ml，100 μ L/空加入酶標(biāo)板中，同時設(shè)置加有100 μ L包被緩沖液的對照孔，4°C過夜；
2)封閉倒出酶標(biāo)板內(nèi)孔內(nèi)液體，拍干，每孔加入250μL1%0VA，37°C封閉lh，倒出酶標(biāo)板內(nèi)孔內(nèi)液體，拍干；每孔加入200 μ L洗滌緩沖液洗板，倒出孔內(nèi)液體，拍干；重復(fù)洗3次；
3)競爭DBP標(biāo)準(zhǔn)溶液從4000μ g/L開始2倍梯度稀釋，50 μ L/孔加入酶標(biāo)板中，然后每孔加入2倍工作濃度的單抗50 μ L，混勻，另設(shè)50 μ L抗體稀釋液+50 μ L 2倍工作濃度單抗的陽性對照孔；37°C孵育lh，洗板；4)加酶標(biāo)二抗用抗體稀釋液將HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG以1:10000稀釋，100μ L每孔加入酶標(biāo)板中，37°C孵育lh，倒出酶標(biāo)板內(nèi)孔內(nèi)液體，拍干；每孔加入200μ L洗滌緩沖液洗板，倒出孔內(nèi)液體，拍干；重復(fù)洗3次；
5)顯色每孔加入新鮮配制的底物顯色液，室溫避光反應(yīng)15min；
6)終止每孔加入50μ L 2mol/L H2SO4終止反應(yīng)；
7)用酶標(biāo)儀測定492nm處吸光度值；
8)以抑制率為縱坐標(biāo)，DBP濃度為橫 坐標(biāo)，建立抑制曲線，抑制率的計算公式為I%=(A-Ai)/(A - A0) *100，A為陽性對照孔的吸光度值，Ai為含有濃度為i的DBP孔吸光度值，AO為空白孔的吸光度值。抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。6.樣品DBP檢測和計算
1)步驟I中準(zhǔn)備的大鼠肝、腎組織勻漿，和血液、尿液作為待測樣品，樣品的包被，封閉同標(biāo)準(zhǔn)曲線建立方法中步驟；
2)樣品DBP與包被抗原競爭結(jié)合DBP單克隆抗體
取樣品溶液50 μ L/孔加入酶標(biāo)板中，然后每孔加入2倍工作濃度的單抗50 μ L，混勻，另設(shè)50 μ L抗體稀釋液+50 μ L 2倍工作濃度單抗的陽性對照孔；37°C孵育lh，洗板；
3)后續(xù)加酶標(biāo)二抗、顯色、終止、測定同標(biāo)準(zhǔn)曲線建立方法中步驟；倒出酶標(biāo)板內(nèi)孔內(nèi)液體，拍干，每孔加入250 μ L，倒出酶標(biāo)板內(nèi)孔內(nèi)液體，拍干；每孔加入200 μ L洗滌緩沖液洗板，倒出孔內(nèi)液體，拍干；重復(fù)洗3次；
4)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算DBP含量
肝組織樣品中DBP含量如圖2所示,血液中DBP含量如圖3所示,尿液中DBP含量如圖4所示，腎組織中DBP含量如圖5所示。采用半抗原包被競爭抑制ELISA法中的包被過程為
a.酶標(biāo)板的羧化向酶標(biāo)板中每孔加入5%的酸性高錳酸鉀溶液150μ L, 60°C放置Ih ；
b.洗板每孔加入6mol/LHCl 200 μ L,室溫?fù)u動5min，倒出孔內(nèi)液體，拍干，重復(fù)洗3次，以除去二氧化錳顆粒；再用蒸餾水洗3次；
c.包被用蒸餾水稀釋半抗原DBAP至一定濃度，每孔70μ L加到羧化后的酶標(biāo)板中，另設(shè)一不包被孔做空白對照；每孔加入70 μ L碳二亞胺(EDC)，37°C搖動過夜，用蒸餾水洗3次，拍干備用。其它步驟同人工抗原包被競爭抑制ELISA法。
權(quán)利要求
1.一種檢測鄰苯二甲酸二丁酯含量的ELISA方法，其特征在于，利用DBP人工抗原DBAP-BSA免疫小鼠而制得DBP單克隆抗體，樣品中DBP和包被抗原 DBAP-BSA競爭結(jié)合DBP單克隆抗體，再通過酶聯(lián)二抗的顯色反應(yīng)和抑制率計算，而得到DBP的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ELISA方法，其特征在于，包括如下步驟1)DBP單克隆抗體的制備；2)抗體效價的測定將人工抗原DBAP-BSA于酶標(biāo)板中包被、封閉，與不同稀釋度的DBP單克隆抗體結(jié)合，后續(xù)加酶標(biāo)二抗，顯色，終止，用酶標(biāo)儀測定492nm出的吸光度，吸光度接近1. O處抗體稀釋度為單克隆抗體的工作濃度；3)標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的建立將人工抗原DBAP-BSA于酶標(biāo)板中包被，封閉，不同濃度DBP標(biāo)準(zhǔn)溶液與包被抗原競爭結(jié)合DBP單克隆抗體，后續(xù)加酶標(biāo)二抗，顯色，終止，用酶標(biāo)儀測定492nm處的吸光度，以抑制率為縱坐標(biāo)，DBP濃度為橫坐標(biāo)，建立抑制率標(biāo)準(zhǔn)曲線；4)測定樣品抑制率，通過抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品中DBP含量將人工抗原DBAP-BSA于酶標(biāo)板中包被，封閉，樣品溶液與包被抗原競爭結(jié)合DBP單克隆抗體，后續(xù)加酶標(biāo)二抗，顯色，終止，用酶標(biāo)儀測定492nm處的吸光度，計算出抑制率，通過抑制率標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品中DBP含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ELISA方法，其特征在于，所述DBP單克隆抗體制備過程如下人工抗原DBAP-BSA免疫小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞與瘤細(xì)胞融合，篩選出陽性雜交瘤細(xì)胞并克隆化；小鼠腹水法大量制備單克隆抗體；再通過硫酸銨沉淀法純化DBP單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的ELISA方法，其特征在于，將人工抗原DBAP-BSA于酶標(biāo)板中包被的過程為用包被緩沖液將人工抗原DBAP-BSA稀釋到O. 25 μ g/ml或O. 5 μ g/ml, 100 μ L/孔加入酶標(biāo)板中，同時設(shè)置加有100 μ L包被緩沖液的對照孔，4°C過夜。
5.一種檢測鄰苯二甲酸二丁酯含量的ELISA方法，其特征在于，利用DBP人工抗原DBAP-BSA免疫小鼠而制得DBP單克隆抗體，樣品中DBP和包被半抗原4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯競爭結(jié)合DBP單克隆抗體，再通過酶聯(lián)二抗的顯色反應(yīng)和抑制率計算，而得到DBP的含量。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的ELISA方法，其特征在于，包括如下步驟1)DBP單克隆抗體的制備；2)抗體效價的測定將半抗原DBAP于酶標(biāo)板中包被、封閉，與不同稀釋度的DBP單克隆抗體結(jié)合，后續(xù)加酶標(biāo)二抗，顯色，終止，用酶標(biāo)儀測定492nm出的吸光度，吸光度接近1. O處抗體稀釋度為單克隆抗體的工作濃度；3)標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的建立將半抗原DBAP于酶標(biāo)板中包被，封閉，不同濃度DBP標(biāo)準(zhǔn)溶液與包被抗原競爭結(jié)合DBP 單克隆抗體，后續(xù)加酶標(biāo)二抗，顯色，終止，用酶標(biāo)儀測定492nm處的吸光度，以抑制率為縱坐標(biāo)，DBP濃度為橫坐標(biāo)，建立抑制率標(biāo)準(zhǔn)曲線；4)測定樣品抑制率，通過抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品中DBP含量將半抗原DBAP于酶標(biāo)板中包被，封閉，樣品溶液與包被抗原競爭結(jié)合DBP單克隆抗體，后續(xù)加酶標(biāo)二抗，顯色，終止， 用酶標(biāo)儀測定492nm處的吸光度，計算出抑制率，通過抑制率標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品中DBP含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的ELISA方法，其特征在于，將半抗原DBAP于酶標(biāo)板中包被過程為a.酶標(biāo)板的羧化向酶標(biāo)板中每孔加入5%的酸性高錳酸鉀溶液150μ L, 60°C放置Ih ；b.洗板每孔加入6mol/LHCl 200 μ L,室溫?fù)u動5min，倒出孔內(nèi)液體，拍干，重復(fù)洗3 次，以除去二氧化錳顆粒；再用蒸餾水洗3次；c.用蒸餾水稀釋半抗原DBAP至一定濃度，每孔70μ L加到羧化后的酶標(biāo)板中，另設(shè)一不包被孔做空白對照；每孔加入70 μ L碳二亞胺，37°C搖動過夜，用蒸餾水洗3次，拍干備用。
全文摘要
本發(fā)明提供了兩種酶聯(lián)免疫吸附法檢測生物樣品和非生物樣品中鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)含量的方法。一種是人工抗原包被競爭抑制ELISA法測定DBP的含量，一種是半抗原包被競爭抑制ELISA法測定DBP的含量。兩種方法都是利用DBP人工抗原DBAP-BSA免疫小鼠而制得DBP單克隆抗體，樣品中DBP和包被抗原與DBP單克隆抗體競爭結(jié)合，再通過酶聯(lián)二抗的顯色反應(yīng)和抑制率計算而得到DBP的含量。本發(fā)明可以一次處理大量樣品，靈敏度高，方便快捷，穩(wěn)定性好，成本低廉，特異性強(qiáng)。
文檔編號G01N21/78GK103018460SQ201210530929
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者陳明清, 楊旭, 曾強(qiáng), 魏晨曦, 袁均林, 丁書茂 申請人:華中師范大學(xué)