一種粉蚧耳霉cpmd140813及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種粉蟻耳霉[Conidiobolus pseudococci(Speare)Tyrrell&MacLeod]CPMD140813及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 煙姐Myzuspersicae是危害煙草的重要害蟲，它不僅能刺吸煙葉汁液影響煙草的 光合作用，從而影響煙葉生長發(fā)育，而且還能攜帶傳播煙草病毒病。對煙蚜的防治，長期以 來一直依賴施用化學(xué)殺蟲劑，然而殺蟲劑頻繁大量的使用帶來了農(nóng)藥環(huán)境染污、害蟲抗藥 性及害蟲再暴發(fā)現(xiàn)象。近年來，利用飼養(yǎng)和釋放煙蚜繭蜂防治煙蚜取得了成功，然而煙蚜繭 蜂是一種寄生性天敵昆蟲，每年需要大量投入人力和物力來飼養(yǎng)獲得大量煙蚜繭蜂，才能 供田間釋放應(yīng)用，同時煙蚜繭蜂在環(huán)境中易受到農(nóng)藥等化學(xué)物質(zhì)的影響，再加上煙蚜繭蜂 具有一定的迀飛擴散能力，在田間釋放后會出現(xiàn)隨意迀移擴散而不能長期在釋放田定殖， 因而投入量大而增加了應(yīng)用成本。昆蟲病原真菌因其在自然條件下的流行性明顯，致病力 強，且在建立種群后會引起寄主昆蟲的流行病而達到持續(xù)控制的作用，再加上昆蟲病原真 菌是唯一能侵染蚜蟲類害蟲的病原微生物。由此，以昆蟲病原真菌為基礎(chǔ)的害蟲生物防治 已成為害蟲生物防治的熱點。生物防治對人、畜、植物安全，害蟲極少或不產(chǎn)生抗性，有利于 環(huán)境保護。因此，研究煙蚜的生物防治，避免或減少因不合理使用化學(xué)農(nóng)藥所帶來的抗藥性 問題，已成為煙蚜科學(xué)治理和可持續(xù)控制的重要課題。
[0003]粉蟻耳霉[Conidioboluspseudococci(Speare)Tyrrell&MacLeod]屬于接 合菌亞門蟲霉目新月霉科耳霉屬。據(jù)記載，粉蚧耳霉在安徽東至可侵染大青葉蟬 (TettigellaviridisLinn)(同翅目：葉蝴科），在浙江黃巖侵染橘姐[Toxoptera citricidus(Kirkaldy)]，而對煙姐的侵染還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種粉蚧耳霉CPMD140813及其應(yīng)用，旨在克服現(xiàn)有粉蚧 耳霉未發(fā)現(xiàn)能寄生煙蚜的不足，通過生物技術(shù)手段防治煙蚜，避免或減少因不合理使用化 學(xué)農(nóng)藥所帶來的抗藥性問題。
[0005] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種粉蟻耳霉[Conidioboluspseudococci(Speare) Tyrrell&MacLeod]CPMD140813,于2014年12月4日保藏于中國微生物保藏管理委 員會普通微生物中心，分類命名為粉蟻耳霉[Conidioboluspseudococci(Speare) Tyrrell&MacLeod]CPMD140813,保藏號為CGMCCNo. 10136,保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號院3號。
[0006] 本發(fā)明的進一步的目的在于提供上述粉蚧耳霉CPMD140813在煙蚜防治方面的應(yīng) 用。本發(fā)明于2014年7月，在云南省彌渡煙田調(diào)查時發(fā)現(xiàn)粉蚧耳霉在煙蚜種群中大量發(fā)生 流行，引起煙蚜種群中90%的個體感染死亡。因此，該菌株是目前國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)的寄生煙 蚜、流行性很強的蟲生真菌，在煙蚜防治中具有很大的開發(fā)應(yīng)用前景。
[0007] 本發(fā)明從罹病煙蚜上分離獲得粉蚧耳霉野生菌株，將野生菌株回接于煙蚜上復(fù)壯 得到粉蚧耳霉菌株，對該菌株采用按常規(guī)方法進行單孢分離、培養(yǎng)得到純的、致病力強的粉 蚧耳霉菌。初生分生孢子無色或淡黃色，透明，多核，內(nèi)含物粗粒狀。分生孢子球形，大小為 23~37. 80umX22. 5~35ym,平均為31.8±3. 48ym。分生孢子具乳突，乳突略去鈍圓或 略尖，與孢子體界線清楚，部分孢子乳突與本體交界處有一明顯的縊縮痕。次生分生孢子與 初生分生孢子同形而略小。分生孢子可方向不定地萌發(fā)出多根小芽管，末端形成小分生孢 子，球形或近球形，大小為5~IOym±3. 8~7.5ym。菌絲段帶狀，不規(guī)則分枝狀，平均 粗12.3ym。分生孢子梗簡單，不分枝，直立。具假根，假根粗狀，末端裂片狀或毛發(fā)狀。囊 狀體缺如。在SDAY培養(yǎng)基上可形成分生孢子和休眠孢子，休眠孢子為假接合孢子，光滑、透 明，直徑35~55ym。
[0008] 相比于現(xiàn)有技術(shù)的缺點和不足，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明是初次從煙蚜 體上分離得到的菌株，培養(yǎng)比較簡單，生長快速，產(chǎn)孢量大，孢子萌發(fā)率高。其分生孢子對煙 蚜致病力強，環(huán)保無污染、不易產(chǎn)生抗藥性，可以廣泛地用于煙蚜的防治。
【附圖說明】：
[0009]圖1是粉蚧耳霉感染的煙蚜癥狀及粉蚧耳霉分生孢子的形態(tài)特征圖；其中，a圖為 被粉蚧耳霉CPMD140813感染的煙蚜；b圖為被粉蚧耳霉CPMD140813的分生孢子。
【具體實施方式】：
[0010] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對 本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0011] 實施例一、病原菌的分離、鑒定
[0012] I. 1材料與方法
[0013]I.I. 1 材料
[0014] 在云南省大理州彌渡縣采集到被一種蟲生真菌侵染后的罹病煙蚜[Myzus persicae(Sulzer)]〇
[0015] 薩氏培養(yǎng)基（SDAY) :1%蛋白胨+1 %酵母粉+4 %葡萄糖+1.5~2%瓊脂粉 +1OOOmT,水。
[0016] 無菌操作條件：所有的器皿和用具均經(jīng)高溫滅菌鍋（12rc，30min)，接種等操作 均在超凈工作臺內(nèi)進行。
[0017] 培養(yǎng)條件：置于25°C光照（12L:12D)恒溫箱中培養(yǎng)，待菌落形成后，轉(zhuǎn)移到試管 SDAY斜面，培養(yǎng)2-3天，轉(zhuǎn)入4 °C冰箱儲存。
[0018] LL2病原菌的分離和純化
[0019]分離：從罹病煙蚜尸體上分離病原菌。將罹病煙蚜帶回實驗室，將處理好的煙蚜尸 體用雙面膠粘于培養(yǎng)皿蓋上，再將該培養(yǎng)皿蓋蓋于含有SDAY培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上。在溫度為 25°C條件下培養(yǎng)，長出菌絲后按常規(guī)方法進行單孢分離、培養(yǎng)得到純的、產(chǎn)孢能力強的菌株 粉蟻耳霉[Conidioboluspseudococci(Speare)Tyrrell&MacLeod]，轉(zhuǎn)移到SDAY斜面上生 長3-4天，在4°C冰箱儲存。
[0020] 復(fù)壯：將分離到的菌株在SDAY上培養(yǎng)2~3天后，產(chǎn)生大量分生孢子，再將該分生 孢子挑入含1%吐溫-80的無菌水，用玻璃棒攪拌均勻，得到適當(dāng)濃度（10s孢子/mL)的孢 子懸浮液，用小型噴霧器均勻噴于煙蚜體表（以蟲體表面濕潤為度），保持相對濕度80%以 上。收集死蟲并保濕，得到的蟲尸再按以上方法分離得到致病力更強的菌株。
[0021] 純化：挑取培養(yǎng)基上分生孢子粉，再次接種在新的培養(yǎng)基上。如此培養(yǎng)2~3代， 菌株就被純化。
[0022] I. 1. 3病原菌的鑒定
[0023] 根據(jù)病原菌的培養(yǎng)性狀、菌絲和分生孢子的形態(tài)進行鑒定。利用40X10倍顯光學(xué) 微鏡，鏡檢菌絲、分生孢子和休眠孢子的形態(tài)。
[0024] 1.2結(jié)果
[0025]從被蟲生真菌自然感染的煙蚜上分離獲得野生菌株，在薩氏瓊脂培養(yǎng)基（SDAY) 上培養(yǎng)，并回接于煙蚜復(fù)壯獲得一菌株，對該菌株進行單菌絲分離獲得純化的菌株，即粉蚧 耳霉CPMDl40813。
[0026] 在光學(xué)顯微鏡（40X10倍）下，如圖1所示，初生分生孢子無色或淡黃色，透 明，多核，內(nèi)含物粗粒狀。分生孢子球形，大小為23~37.80ymX22.5~35ym，平均 為31. 8±3. 48ym。分生孢子具乳突，乳突略去鈍圓或略尖，與孢子體界線清楚，部分孢子 乳突與本體交界處有一明顯的縊縮痕。次生分生孢子與初生分生孢子同形而略小。分生 孢子可方向不定地萌發(fā)出多根小芽管，末端形成小分生孢子，球形或近球形，大小為5~ 10ym±3. 8~7.5ym。菌絲段帶狀，不規(guī)則分枝狀，平均粗12.3ym。分生孢子