一種新的黑曲霉菌株及其應(yīng)用
【專利說(shuō)明】一種新的黑曲霉菌株及其應(yīng)用發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本申請(qǐng)大體上涉及生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體而言，本申請(qǐng)涉及利用黑曲霉作為生產(chǎn)宿主、棕櫚仁柏作為營(yíng)養(yǎng)素來(lái)產(chǎn)生異冰片的生物發(fā)酵技術(shù)。
[0002]發(fā)明背景
[0003]掠桐仁柏(又稱為PKC (palm kernel cake)或 PKM(palm kernel meal))是將掠桐仁通過(guò)機(jī)械壓榨或溶劑萃取榨油后的副產(chǎn)品，其形狀、顏色與菜籽柏相似。近年來(lái)，隨著馬來(lái)西亞、印度尼西亞棕櫚樹(shù)的大規(guī)模擴(kuò)種，棕櫚仁柏的產(chǎn)量也大大增加，對(duì)棕櫚仁柏的開(kāi)發(fā)利用成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，段東洋(段東洋，《復(fù)合菌種固態(tài)發(fā)酵棕櫚仁柏為菌體蛋白飼料的研究》，華南理工大學(xué)碩士論文，2005)描述了棕櫚仁柏的生物利用法包括酶降解法和微生物發(fā)酵法。
[0004]黑曲霉(Aspergillus niger)是曲霉屬(Aspergillus)真菌中的一個(gè)常見(jiàn)種，其廣泛分布于糧食、植物產(chǎn)品和土壤中。黑曲霉的生長(zhǎng)適溫為37°C，最低相對(duì)濕度為88%，能導(dǎo)致水分較高的糧食霉變。黑曲霉是重要的發(fā)酵工業(yè)菌種，F(xiàn).B.1luyemi《Fungal solidstate culture of palm kernel cake)) (B1resource technology, 2006, 97 (3): 477-482.),Pang Pei Kheng (<Xylanase product1n by a local fungal isolate Aspergillusniger USM AIlvia solid state fermentat1n using palm kernel cake as substrate》(Songklanakarin J.Sc1.Technol, 2005, 27(2):325-336)中公開(kāi)了黑曲霉可用于生產(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、檸檬酸、葡糖酸和沒(méi)食子酸等。某些黑曲霉菌株還可將羥基孕留酮轉(zhuǎn)化為雄烯。
[0005]由于黑曲霉在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中能產(chǎn)生多種代謝酶，且遺傳背景清晰，安全可靠，所以被廣泛應(yīng)用于各種植物蛋白源柏類的增值開(kāi)發(fā)。例如，ZL200910272714.7中公開(kāi)了一株黑曲霉CCTCC No:M209143，該菌株能在以植物纖維作為唯一碳源的基料中生長(zhǎng)且生長(zhǎng)迅速，纖維素酶的產(chǎn)率高、酶活高。
[0006]目前，本領(lǐng)域仍需要開(kāi)發(fā)棕櫚仁柏的新的利用途徑以及黑曲霉的新用途，本申請(qǐng)滿足了上述需求。
[0007]發(fā)明概述
[0008]第一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝四軌蛞宰貦叭拾刈鳛闋I(yíng)養(yǎng)素產(chǎn)生異冰片的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株。所述黑曲霉菌株的一個(gè)實(shí)例是保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(China General Microb1logical Culture Collect1nCenter(CGMCC))、保藏號(hào)為CGMCC N0.9069的黑曲霉菌株。本申請(qǐng)還單獨(dú)提供了保藏于CGMCC、保藏號(hào)為CGMCC N0.9069的黑曲霉菌株。
[0009]第二方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝酥苽洚惐姆椒?，包括在含有棕櫚仁柏的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第一方面所述的黑曲霉菌株。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括從發(fā)酵液中分離和/或純化異冰片。
[0010]第三方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝说谝环矫嫠龅暮谇咕暝谏a(chǎn)異冰片中的用途。
[0011]第四方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝松a(chǎn)異冰片的組合物，所述組合物包含第一方面所述的黑曲霉菌株，還包含棕櫚仁柏和黑曲霉培養(yǎng)基中的至少一項(xiàng)。
[0012]第五方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝髓b定能利用生物質(zhì)產(chǎn)生異冰片的微生物的方法，包括分離所述生物質(zhì)上生長(zhǎng)的微生物，在含有所述生物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)分離出的微生物，并檢測(cè)培養(yǎng)物中是否存在異冰片。在一些實(shí)施方案中，所述生物質(zhì)是油料作物的柏。在一些實(shí)施方案中，所述柏是棕櫚仁柏。在一些實(shí)施方案中，所述微生物為真菌。在一些實(shí)施方案中，所述真菌為曲霉屬(Aspergillus)真菌。在一些具體實(shí)施方案中，所述真菌為黑曲霉(Aspergillus niger)。
[0013]附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0014]圖1顯示實(shí)施例1中使用的棕櫚仁柏樣品的示例性照片，本申請(qǐng)的示例性黑曲霉菌株從該棕櫚仁柏樣品表面生長(zhǎng)的菌絲中分離和鑒定。
[0015]圖2顯示了本申請(qǐng)中分離到的黑曲霉菌株WRD-007的孢子形態(tài)圖。
[0016]圖3顯示了發(fā)酵前的含5%棕櫚仁柏(PKC)的培養(yǎng)基的總離子色譜圖。
[0017]圖4顯示了用黑曲霉菌株WRD-007發(fā)酵后的發(fā)酵液的總離子色譜圖。
[0018]圖5顯示了發(fā)酵前的培養(yǎng)基和發(fā)酵后的發(fā)酵液中揮發(fā)性成分的含量比較。
[0019]發(fā)明的詳細(xì)描述
[0020]本申請(qǐng)部分基于對(duì)棕櫚仁柏中自然生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行分離和鑒定，并令人驚奇地發(fā)現(xiàn)能夠以棕櫚仁柏作為營(yíng)養(yǎng)素產(chǎn)生異冰片的黑曲霉菌株。由于異冰片對(duì)真菌具有殺菌、抑菌的作用，因此發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生異冰片的生產(chǎn)宿主是令人意想不到的。
[0021]異冰片(isoborneol),又名異龍腦、異樟醇、異茨醇等,純品為白色晶體,有類似樟腦的清涼感。
[0022]目前，劉永根(劉永根，合成龍腦的研究，江西師范大學(xué)碩士論文，2005)概述了異龍腦主要有兩種來(lái)源:一種是利用龍腦香科植物龍腦香樹(shù)的樹(shù)干經(jīng)水蒸氣蒸餾、冷卻而得的晶體，天然龍腦中主要成分是正龍腦，通常只含有微量的異龍腦；另一種是人工合成龍腦，合成龍腦一般是正龍腦和異龍腦的混合物。隨著香料和醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展，龍腦或異龍腦的需求與日俱增，由于天然龍腦提煉和生產(chǎn)的成本高、資源稀缺，滿足不了人們對(duì)龍腦的需求，陳慧宗等(陳慧宗等，龍腦合成方法的改進(jìn)，應(yīng)用化學(xué)，2005，22 (5):563-565.)描述了合成龍腦原料易得，價(jià)格低廉，但反應(yīng)中通常需要催化劑(如硼酐、納米固體超強(qiáng)酸等)，反應(yīng)控制難度大，易爆炸，產(chǎn)量和得率也不高。
[0023]關(guān)于龍腦的生物合成法，印度學(xué)者通過(guò)富集培養(yǎng)，得到了一種能利用α -菔烯或β -菔烯、雙戊烯等作為碳源的綠膿桿菌，該菌能發(fā)酵產(chǎn)生龍腦及羧酸。同時(shí)，日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)α-松油醇可被某種綠膿桿菌轉(zhuǎn)化為龍腦。
[0024]異冰片具有抗菌作用，作用方式為接觸抑菌，在較低濃度時(shí)有抑菌作用，高濃度時(shí)有殺菌作用，抗菌效果隨接觸時(shí)間的增加而增強(qiáng)。Maria Armaka等(Armaka et.al.Antiviral properties of isoborneol a potent inhibitor of herpes simplex virus typeI, Antiviral research, 1999, 43(2):79-92.)研究發(fā)現(xiàn)，異冰片在0.06%的濃度下即能完全抑制單純皰疹I(lǐng)型病毒復(fù)制，并且異冰片可特異性地抑制病毒多肽的糖蛋白。牟家琬等(牟家琬等，龍腦與異龍腦的體外抗菌作用的研究，華西藥學(xué)雜志，1989，4 (I): 20-22.)發(fā)現(xiàn)，異冰片對(duì)諸如金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、綠色鏈球菌和大腸桿菌等臨床常見(jiàn)的細(xì)菌具有低濃度抑菌、高濃度殺菌的功效。據(jù)報(bào)道，冰片對(duì)黑曲菌等真菌有抑制作用，其作用于真菌細(xì)胞壁，使細(xì)胞壁通透性增強(qiáng)，從而允許藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，破壞線粒體，導(dǎo)致細(xì)胞氧化磷酸化和細(xì)胞能量偶聯(lián)系統(tǒng)被破壞，能量產(chǎn)生降低，導(dǎo)致細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)電子空白區(qū)，最終導(dǎo)致真菌死亡溶解，從而表現(xiàn)出抑菌殺菌功能。
[0025]除非另外說(shuō)明，本申請(qǐng)中的術(shù)語(yǔ)的含義與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同。對(duì)于本文中所提到的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可參考各種教科書(shū)、文獻(xiàn)以及商業(yè)產(chǎn)品說(shuō)明，也可以參考本申請(qǐng)的實(shí)施例部分給出的具體實(shí)例。
[0026]應(yīng)當(dāng)理解，本文所用的術(shù)語(yǔ)“約”(例如，在組分含量和反應(yīng)參數(shù)中)以本領(lǐng)域技術(shù)人員通常能夠理解的含義來(lái)解釋。一般情況下，術(shù)語(yǔ)“約”可以理解為給定數(shù)值的正負(fù)5%范圍內(nèi)的任意數(shù)值，例如，約X可以代表95% X至105% X的范圍中的任意數(shù)值。
[0027]還應(yīng)當(dāng)理解，本文中給出的具體數(shù)值(例如，在組分含量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間中)不僅可作為單獨(dú)的數(shù)值理解，還應(yīng)當(dāng)認(rèn)為提供了某一范圍的端點(diǎn)值，并且可以相互組合提供其他范圍。例如，當(dāng)公開(kāi)了某一組分的含量可以為1%或5%時(shí)，也相當(dāng)于公開(kāi)了其含量可以為1%至5%。
[0028]以下詳細(xì)描述本申請(qǐng)的一些示例性實(shí)施方案。應(yīng)當(dāng)理解，這些詳細(xì)描述僅為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員更清楚地了解本申請(qǐng)的內(nèi)容，而并非意圖在任何方面加以限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)λ鰧?shí)施方案進(jìn)行各種改動(dòng)和變化。
[0029]第一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝四軌蛞宰貦叭拾刈鳛闋I(yíng)養(yǎng)素產(chǎn)生異冰片的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株。所述黑曲霉菌株的一個(gè)實(shí)例是保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(China General Microb1logical Culture Collect1nCenter(CGMCC))、保藏號(hào)為CGMCC N0.9069的黑曲霉菌株。本申請(qǐng)還單獨(dú)提供了保藏于CGMCC、保藏號(hào)為CGMCC N0.9069的黑曲霉菌株。該菌株在本申請(qǐng)中所指定的編號(hào)為WRD-007。該菌株已于2014年4月17日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)樓)，保藏號(hào)為CGMCC N0.9069。關(guān)于該菌株的分離、純化、檢測(cè)和鑒定過(guò)程，在后文的實(shí)施例中有詳細(xì)描述。由于冰片類對(duì)于真菌具有抑菌、殺菌活性，因此能夠利用黑曲霉作為生產(chǎn)宿主來(lái)產(chǎn)生異冰片的發(fā)現(xiàn)是令人意想不到的。
[0030]該菌株的整體形態(tài)學(xué)特征包括:初始培養(yǎng)時(shí)，菌絲為白色、絨毛狀，菌落中間突起(培養(yǎng)24h)，向四周輻射生長(zhǎng)，菌落中央的菌絲漸變?yōu)楹谏?，非常厚?培養(yǎng)48h);分生孢子為黑色，數(shù)量極多。該菌株的顯微鏡形態(tài)特征包括:菌絲長(zhǎng)且致密，菌絲梗光滑；分生孢子頭呈輻射狀，直徑約為200 μ m,分生孢子梗莖約為Imm ;頂囊近球形，直徑20-30 μ m,分生孢子呈球形，黑褐色。
[0031]第二方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝酥苽洚惐姆椒ǎㄔ诤凶貦叭拾氐呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)第一方面所述的黑曲霉菌株。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括從發(fā)酵液中分離和/或純化異冰片。
[0032]棕櫚仁柏是制油工業(yè)的常見(jiàn)副產(chǎn)品，可以商購(gòu)獲得。在一些實(shí)施方案中，將棕櫚仁柏磨成粉后添加到培養(yǎng)基中。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中棕櫚仁柏的含量為約l_15w/w.%，例如約 l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14、15w/w.%0
[0033]適合于黑曲霉的培養(yǎng)條件(例如培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的?？梢韵蜻m合于培養(yǎng)黑曲霉的基礎(chǔ)培養(yǎng)基或常規(guī)培養(yǎng)基中添加合適量的棕櫚仁柏來(lái)制備本申請(qǐng)的培養(yǎng)基。也可以將棕櫚仁柏作為唯一營(yíng)養(yǎng)素來(lái)制備培養(yǎng)基。適合于培養(yǎng)黑曲霉的培養(yǎng)基的一個(gè)非限制性實(shí)例為PDA(potato dextrose agar)培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)溫度為約26-30°C，例如約26、27、28、29、30°C。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)時(shí)間為約12-72小時(shí)，例如約12、24、36、48、72小時(shí)。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中菌株孢子的接種量為約 l-10w/w.%，例如，約 l、2、3、4、5、6、7、8、9、10w/w.%0
[0034]從發(fā)酵液中分離和/或