一種利用重組鈍齒棒桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)l-鳥氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及到精氨酸酶基因的克隆表達(dá)獲得重組工程菌，同時(shí)將該工程菌應(yīng)用于 L-鳥氨酸的生產(chǎn)，屬于生物工程和生物技術(shù)領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] L-精氨酸酶（E.C. 3.5.3. 1)是尿素循環(huán)中的一種關(guān)鍵酶，其催化L-精氨酸形 成L-鳥氨酸和尿素，精氨酸酶廣泛存在于各種動(dòng)植物和微生物體內(nèi)，來源于Bacillus brevis，Bacillussubtilis和Bacillusthuringiensis等微生物的精氨酸酶已經(jīng)獲得較 好的研究。
[0003]鳥氨酸是一種堿性氨基酸，易溶于水和乙醇，微溶于乙醚等有機(jī)溶劑。鳥氨酸接受 二分子NH/和一分子CO 2形成一分子L-精氨酸。L-精氨酸亦可以在精氨酸酶的作用下被 水解成鳥氨酸和尿素。
[0004] L-鳥氨酸是一種重要的非蛋白質(zhì)氨基酸，是精氨酸和脯氨酸合成的重要前體物 質(zhì)。同時(shí)L-鳥氨酸是人體內(nèi)尿素循環(huán)的重要中間代謝產(chǎn)物，因此其對(duì)肝臟的解毒功能具有 重要的保障作用。L-鳥氨酸能夠刺激體內(nèi)生長(zhǎng)激素的分泌，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成以及糖類和 脂質(zhì)的分解代謝作用。L-鳥氨酸和其他氨基酸一起制成的復(fù)方氨基酸有很好的保肝護(hù)肝以 及激發(fā)病態(tài)下肝臟的活力的作用。聯(lián)合使用L-鳥氨酸和苯乙酸能有效治療肝性腦病，特別 是對(duì)于鳥氨酸循環(huán)障礙的患者，L-鳥氨酸能通過促進(jìn)谷氨酰胺的合成和排泄來穩(wěn)定的降低 患者血氨濃度。鳥氨酸a-酮戊二酸鹽是很好的臨床營(yíng)養(yǎng)劑，促進(jìn)外科創(chuàng)傷病人的恢復(fù)，改 善慢性營(yíng)養(yǎng)不良，改善免疫功能。同時(shí)鳥氨酸和蘋果酸鹽和檸檬酸鹽合用能夠改善食品和 飲料的口味，減少苦味。在歐洲、美國(guó)以及日本，L-鳥氨酸都是作為膳食藥物來銷售的。
[0005] 工業(yè)上L-鳥氨酸的合成包括化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和L-精氨酸水解法?；?學(xué)合成作為早期L-鳥氨酸的生產(chǎn)方法，一般以丙烯醛、氰化氫、氨氣、C02為原料合成L-鳥 氨酸。但效果并不是很理想，主要表現(xiàn)在于合成的步驟繁瑣，產(chǎn)物得率低，而且得到的產(chǎn)物 是L-鳥氨酸和D-鳥氨酸的混合物，為后期的分離純化帶來很大的困難。同時(shí)化學(xué)法合成 L-鳥氨酸由于其環(huán)境的危害性，越來越不被現(xiàn)代工業(yè)所接受。生物合成法相對(duì)化學(xué)合成法 具有生產(chǎn)成本較低，環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)而受到重視。微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-鳥氨酸主要是通過 誘變或者基因工程的方法獲得L-鳥氨酸高產(chǎn)菌株，以較為便宜的葡萄糖甚至是淀粉等最 為初始原料合成L-鳥氨酸。在這方面日本起步較早，上世紀(jì)五六十年代就開始鳥氨酸生產(chǎn) 的研究，主要以誘變篩選為主。1957年kinoshita等首先報(bào)道了利用谷氨酸棒狀桿菌的瓜 氨酸或精氨酸的突變株發(fā)酵生產(chǎn)鳥氨酸。此后，okumurahe Shibuya等人在這方面也做了 大量的工作總結(jié)出了具有精氨酸缺陷型及精氨酸氧肟酸鹽抗性的谷氨酸棒桿菌以及具有 精氨酸和瓜氨酸，以及霉酚酸抗性等標(biāo)記的檸檬酸節(jié)桿菌突變株用于工業(yè)生產(chǎn)中。國(guó)內(nèi)陳 寧、劉樹慶等人在1999年開始研究鳥氨酸的生產(chǎn)，并以谷氨酸棒桿菌為出發(fā)菌株，通過硫 酸二乙酯和紫外線誘變定向選育出一種鳥氨酸生產(chǎn)菌，并通過發(fā)酵優(yōu)化使得鳥氨酸產(chǎn)量達(dá) 到9. 85g/L。近幾年，隨著代謝工程技術(shù)的興起，通過代謝工程改造的方法，鳥氨酸的發(fā)酵生 產(chǎn)取得一定的進(jìn)展，其中，中山大學(xué)蔣玲艷等人以谷氨酸棒桿菌為出發(fā)菌株，通過表達(dá)異源 的谷氨酸脫氫酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶，增加代謝流中NADPH的含量，使得L-鳥氨酸產(chǎn) 量得到提高，最終到14. 8g/L，而后蔣又通過代謝進(jìn)化和代謝工程的方法，最后得到鳥氨酸 的產(chǎn)量為24.lg/L。通過發(fā)酵法進(jìn)行鳥氨酸生產(chǎn)可以利用較簡(jiǎn)單的碳源，如葡萄糖等，成本 非常低廉，適合于工業(yè)的發(fā)展，但發(fā)酵周期一般都相對(duì)較長(zhǎng)，而且發(fā)酵的產(chǎn)量較低對(duì)于后期 分離需要較高的技術(shù)需求。
[0006] L-精氨酸水解法生產(chǎn)L-鳥氨酸包括，堿水解法和酶水解法，特別是酶水解，由于 其反應(yīng)效率高，產(chǎn)物轉(zhuǎn)專一性高而受到越來越多的重視。近幾年，國(guó)內(nèi)有人開始嘗試以精氨 酸為底物進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-鳥氨酸。北京化工大學(xué)徐燾，通過篩選得到一株精氨酸酶活 力較高的蘇云金芽孢桿菌，以此細(xì)胞作為生物催化劑，以L-精氨酸為底物進(jìn)行L-鳥氨酸 生產(chǎn)，并最終得到43. 57g/LL-鳥氨酸。而后張濤等人提取蘇云金芽孢桿菌的精氨酸酶， 以精氨酸為底物，精氨酸酶純酶作催化劑，并最終得到72.lg/L的精氨酸酶。宋偉等人構(gòu) 建表達(dá)外源精氨酸酶的E.coliBL21，并以重組細(xì)胞為催化劑，L-精氨酸為底物，最終得到 112. 3g/L的L-鳥氨酸
[0007] 本發(fā)明通過表達(dá)載體pXMJ19,實(shí)現(xiàn)了將來源于Bacillus cereus的精氨酸酶基因 argl成功在純齒棒桿菌Corynebacterium crenatum SDNN403(該菌株為本課題組多年研 究，產(chǎn)用傳統(tǒng)誘變方法獲得一株菌株，保藏編號(hào)CGMCC0890,專利號(hào)為：ZL 03112896. 3)中 進(jìn)行高效表達(dá)，并利用此基因工程菌的全細(xì)胞作為生物催化劑，以L-精氨酸為底物，實(shí)現(xiàn) 了L-鳥氨酸的高效生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的主要研究?jī)?nèi)容：本發(fā)明利用分子技術(shù)克隆了來自Bacilluscereus 的精氨酸酶基因argl，構(gòu)建重組表達(dá)載體pXMJ19-argI，并通過電轉(zhuǎn)化方法將其轉(zhuǎn)化至 C.crenatumSDNN403 中，成功構(gòu)建了基因工程菌株C.crenatumSDNN403/pXMJ19_argI。酶 活力測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組C.crenatumSDNN403工程菌的精氨酸酶活實(shí)現(xiàn)從無到有，比酶活達(dá) 到24. 3U/mg?；讷@得的基因工程菌，對(duì)該菌株用于轉(zhuǎn)化L-精氨酸生產(chǎn)L-鳥氨酸進(jìn)行了 初步的研究。在8h內(nèi)，L-鳥氨酸的產(chǎn)量為149. 2g/L，精氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到99. 5%。
[0009] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案：
[0010] 精氨酸酶基因工程菌，是將出發(fā)菌株Bacilluscereus的精氨酸酶基因連接在表 達(dá)載體PXMJ19上，并轉(zhuǎn)化至C.crenatumSDNN403得到重組菌株。以該工程菌為基礎(chǔ)，基于 精氨酸酶酶學(xué)性質(zhì)為基礎(chǔ)，以L-精氨酸為底物，構(gòu)建轉(zhuǎn)化化法生產(chǎn)L-鳥氨酸的最佳轉(zhuǎn)化體 系，實(shí)現(xiàn)高效生產(chǎn)L-鳥氨酸的方法。
[0011] 1?精氨酸酶引物設(shè)計(jì)
[0012] 根據(jù)NCBI中Bacillus cereus全基因組核酸序列中argl基因序列，設(shè)計(jì)精氨酸 酶基因的PCR引物Pl和P2。
[0013] F :5' -ACCCGAAGCTTATGAAAAAAGAAATCTCAGTTATTGG-3' (Hind III)
[0014] R :5' -ACCGGGATCCTTATTTTAGTTTTTCACCGAATAAAG-3' (BamH I)
[0015] 2.重組表達(dá)載體pXMJ19-argI的構(gòu)建
[0016] 參照博大泰克公司膠回收試劑盒說明書回收PCR產(chǎn)物，膠回收產(chǎn)物按一定比例與 PMD18-Tvector過夜連接，轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，使用氨芐青霉素抗性平板篩選 重組菌，重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI/hindlll酶切釋放出大小為2. 7kb和894bp的基因條帶，表明重 組質(zhì)粒構(gòu)建成功，重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-argI。
[0017] 提取保存于E.coliJM109 中的質(zhì)粒pMD18-T-argI和pXMJ19,質(zhì)粒pMD18-T-argI 和PXMJ19經(jīng)BamHI/hindllI雙酶切，膠回收純化，16°C過夜連接，將連接物熱擊轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，用卡那霉素抗性平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng) BamHI/HindIII雙酶切后釋放出大小為6. 6kb和894bp的基因片段，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成 功，重組質(zhì)粒命名為pXMJ19-argI。
[0018] 3?重組質(zhì)粒pXMJ19_argI轉(zhuǎn)化模式菌株C.crenatumSDNN403
[0019] 將經(jīng)驗(yàn)證構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pMA5_argI通過電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至模式菌株 C. crenatum SDNN403中。
[0020] 4?重組菌株C.crenatumSDNN403/pXMJ19_argI陽性轉(zhuǎn)化子的篩選
[0021] 挑取在具有氯霉素抗性平板上長(zhǎng)出的菌落，搖瓶發(fā)酵，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。
[0022] 5.重組菌株酶活力測(cè)定
[0023] 酶活測(cè)定方法：配制0. 2M底物L(fēng)-精氨酸（0. 2M碳酸鹽緩沖液，pH9. 0)，取0. 9ml 底物溶液，加入〇.Iml酶液，40°C反應(yīng)lOmin。將酶反應(yīng)液稀釋相應(yīng)的倍數(shù)，取Iml稀釋后 的反應(yīng)液，用Chinard比色法測(cè)定反應(yīng)液中L-鳥氨酸的含量。酶活定義單位為Imin催化 lumolL-精氨酸轉(zhuǎn)化成L-鳥氨酸所需的酶量。
[0024] Chinard比色法：1ml標(biāo)準(zhǔn)液中依次加入Iml的冰醋酸，Iml混合酸（諱三酮溶液）， 于沸水浴中反應(yīng)lh，測(cè)定515nm下的吸光度值。
[0025] 6.重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-鳥氨酸
[0026] 以重組菌C. crenatum SDNN403/pXMJ-argI的微生物菌體為生物催化劑。以一定 濃度的L-精氨酸為底物，在最佳轉(zhuǎn)化體系下進(jìn)行轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-鳥氨酸。用高效液相色譜 法測(cè)定轉(zhuǎn)化液中L-鳥氨酸和L-精氨酸的含量。
[0027] 氨基酸分析色譜條件
[0028] (a)色譜柱：安捷倫色譜柱TC-C18250*4. 6*5
[0029] (b)柱溫：40°C
[0030] (C)流動(dòng)相：A相：稱取8.0克結(jié)晶乙酸鈉于1000毫升燒杯中，加入1000毫升 水?dāng)嚢柚了薪Y(jié)晶水溶解，再加入225微升三乙胺，攪拌并滴加5 %的醋酸，將PH調(diào)到 7. 20 ±0. 05;加入5毫升四氫咲喃，混合后備用。
[0031] B相：稱取12. 0克結(jié)晶乙酸鈉于8