一種檢測(cè)gstm1基因多態(tài)性的引物與方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)GSTMl基因多態(tài)性的引物與方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鉑類抗癌藥物，包括順鉑、卡鉑和奧沙利鉑等，是目前臨床應(yīng)用中對(duì)多種癌癥具 有較高活性的抗癌藥物，主要通過(guò)引起細(xì)胞內(nèi)DNA損傷來(lái)清除癌細(xì)胞。
[0003] 谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶Ml(GSTM1)的純合缺失，即GSTMl_Loss可導(dǎo)致酶活性喪失或 降低，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)某些毒物或致癌物的敏感性。現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)顯示，GSTMl基因多態(tài)性 在不同地區(qū)、不同種族的人群間有著不同的分布頻率，GSTMl_Loss基因型頻率在華人群體 中分布較高。
[0004] 因此，通過(guò)GSTMl基因多態(tài)性的檢測(cè)，有助于預(yù)測(cè)鉑類藥物化療的預(yù)后，在幫助指 導(dǎo)用藥和個(gè)性化治療方面具有重要意義?，F(xiàn)有技術(shù)缺少一種特異性好、靈敏度高、可實(shí)現(xiàn) GSTMl基因多態(tài)性檢測(cè)的引物及其方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種檢測(cè)GSTMl基因多態(tài)性的引物與 方法，具有特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了GSTMl基因多態(tài)性的檢測(cè)。本發(fā)明 檢測(cè)的位點(diǎn)包括GSTMl_Loss:GSTM1基因缺失。
[0006] 本發(fā)明提供一種檢測(cè)GSTMl基因多態(tài)性的引物，包括PCR擴(kuò)增引物和 SNaPshotPCR引物；所述PCR擴(kuò)增引物包括：針對(duì)GSTMl_Loss的上游引物5'-GAACTC CCTGAAAAGCTAAAGC-3'（SEQIDNO. 1)和下游引物 5' -CTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3'（S EQIDNO. 2);所述SNaPshotPCR引物包括：針對(duì)GSTMl_Loss的SNaPshotPCR引物 5'-TTTTCATCATAGACGAGAAAATCTACAA-3'（SEQIDN0.3)。
[0007] 采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明提供的檢測(cè)GSTMl基因多態(tài)性的引物，可以實(shí)現(xiàn)GSTMl 基因多態(tài)性的特異性檢測(cè)，準(zhǔn)確性好。
[0008] 相應(yīng)地，本發(fā)明還提供一種檢測(cè)GSTMl基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟：A)提取 DNA樣品；B)采用權(quán)利要求1中所述的PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化； C)采用權(quán)利要求1中所述的SNaPshotPCR引物進(jìn)行SNaPshotPCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 純化；D)毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，確定SNP位點(diǎn)及其基因型。
[0009] 優(yōu)選地，所述步驟A)中的DNA樣品為EDTA抗凝外周血的DNA樣品。
[0010] 優(yōu)選地，所述步驟B)中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括：階段I:98°C3min;階段2 : 98°(：1〇8;階段3:581€3〇8;階段4:72°(：11^11 ;階段5:返回到階段2,29個(gè)循環(huán)；階段6: 72。〇5111111;階段7:25。(：保溫。即，3七印1:98。〇€(^3111111扯68 ;5七印2:98。〇€(^10 seconds；Step3 :58°Cfor30seconds；Step4 :72°CforIminute；Step5：Goto step2,29times；Step6 ：72°Cfor5minutes；Step7 ：25°Cforever〇
[0011] 所述步驟C)中的SNaPshotPCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括：階段I:96°CIOs;階段2 : 55°C5s;階段3:60°C30s;階段4:返回到階段1，25個(gè)循環(huán)；階段5:4°C保溫。即，St印 I：96°CforlOseconds；Step2 ：55°Cfor5seconds；Step3 :60°Cfor30seconds； Step4：Gotostep1,25times；Step5:4°Cforever。
[0012] 優(yōu)選地，所述步驟D)中，采用GENEMAPPERID V4. I軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
[0013] 此外，本發(fā)明還提供檢測(cè)GSTMl基因多態(tài)性的引物在制備檢測(cè)GSTMl基因多態(tài)性 試劑中的用途。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種檢測(cè)GSTMl基因多態(tài) 性的引物，引物的特異性好，準(zhǔn)確性好，實(shí)現(xiàn)了GSTMl基因多態(tài)性的檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率。 此外，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)GSTMl基因多態(tài)性的SNaPshot法，通過(guò)使用特異性的PCR 擴(kuò)增引物和SNaPshotPCR引物，具有特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，可以為鉑類藥 物的臨床用藥提供指導(dǎo)。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1本發(fā)明提供的GSTMl基因引物的擴(kuò)增片段。
[0016] 圖2GSTMl基因引物擴(kuò)增產(chǎn)物的部分測(cè)序圖。
[0017] 圖3樣品的GSTMl基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0019] 實(shí)施例一引物 發(fā)明人針對(duì)GSTMl的基因多態(tài)性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了大量引物，通過(guò)引物反應(yīng)條件的優(yōu)化和 比較，篩選出了特異性好的引物。本發(fā)明提供的引物包括PCR擴(kuò)增引物和SNaPshotPCR引 物，PCR擴(kuò)增引物和SNaPshotPCR引物是相對(duì)應(yīng)的。本發(fā)明提供的所有引物序列均通過(guò) UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，無(wú)已知SNP位點(diǎn)。
[0020] 實(shí)施例二引物的特異性 將本發(fā)明提供的引物于UCSC中進(jìn)行Blasting，GSTMl_Loss引物擴(kuò)增片段位于chrl: 110232920-110233138,長(zhǎng)度為219bp;結(jié)果如圖1所示，所有引物的擴(kuò)增片段均覆蓋了相應(yīng) 的檢測(cè)位點(diǎn)，無(wú)其它同源基因。
[0021] 使用表1中PCR擴(kuò)增引物分別對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增及Sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯 示，各引物擴(kuò)增片段與GSTMl基因參考序列吻合，結(jié)果如圖2所示。使用表1中SNaPshot PCR引物，SNaPshot法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。從圖3可知，各產(chǎn)物峰的相對(duì)位置及測(cè) 序反應(yīng)摻入的堿基與預(yù)期相符，且無(wú)其它干擾峰。
[0022] 實(shí)施例二GSTMl基因多態(tài)性的檢測(cè) 提取m)TA抗凝外周血的DNA樣品，提取方法參照TIANampBloodDNAKit(購(gòu)自Tiagen，貨號(hào)：DP318)的說(shuō)明書(shū)，將DNA樣品稀釋至100ng/yL，備用。
[0023] PCR擴(kuò)增采用Q5?熱啟動(dòng)超保真2X Master Mix(購(gòu)自NEB公司，貨號(hào)：M0494L)，反 應(yīng)體系如表2所示，GSTMl_Loss的引物濃度為5pmol/uL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括：階段1 : 98°C 3min;階段2:98°C IOs;階段3:58°C 30s;階段4:72°C Imin;階段5:返回到階段2， 29個(gè)循環(huán)；階段6 :72°C 5min ;階段7:25°C保溫。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取2. 0 y L ExoSAP-IT (購(gòu)自Affymetrix，貨號(hào)：78205)和3.0 yLCldH2O，混勻，加入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2.0 yL，混勻微 離心；在PCR儀中進(jìn)行酶切反應(yīng)，程序：37°C，15 min ;80°C，15min ;4°C，保溫。
[0024] 采用SNaPshot?MultiplexKit(購(gòu)自ABI公司，貨號(hào)4323151)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體 系如表3所示，GSTMl_Loss的引物濃度為5pmol/uL。SNaPshotPCR反應(yīng)條件包括：階段 1:96°CIOs;階段2:55°C5s;階段3:60°C30s;階段4:返回到階段1，25個(gè)循環(huán)；階段5: 4C保溫。
[0025] 在SNaPshotPCR產(chǎn)物中加入LOyLSAP酶，按照以下程序進(jìn)行反應(yīng)：37°C， 60min;75°C，15min;4°C，保溫。反應(yīng)完畢后，毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果采用 GENEMAPPERIDV4. 1軟件進(jìn)行分析，確定SNP位點(diǎn)及其基因型，結(jié)果如圖3所示。
[0026] 實(shí)施例三檢測(cè)GSTMl基因多態(tài)性的方法的特異性 本檢測(cè)方法的特異性定義為陰性符合率。本檢測(cè)將GSTMl未缺失基因型的檢出定義為 陰性結(jié)果。
[0027] 采用本發(fā)明提供的SNaPshot法對(duì)19例樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用ARMS法進(jìn)行驗(yàn) 證。SNaPshot法的檢測(cè)結(jié)果與ARMS法的結(jié)果相符，如表4所示。本檢測(cè)方法的特異性為 100% 〇
[0028] 實(shí)施例四檢測(cè)GSTMl基因多態(tài)性的方法的靈敏度和準(zhǔn)確性 本檢測(cè)方法的靈敏度定義為陽(yáng)性符合率。采用本發(fā)明提供的SNaPshot法對(duì)19例樣品 進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用ARMS法進(jìn)行驗(yàn)證。SNaPshot測(cè)序法的檢測(cè)結(jié)果與ARMS法的結(jié)果相符， 如表5所示。本檢測(cè)方法的靈敏度和準(zhǔn)確度高。
[0029] 實(shí)施例五檢測(cè)GSTMl基因多態(tài)性的方法的精密度 本檢測(cè)方法的精密度定義為對(duì)樣品進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)得到同一結(jié)果的能力。本檢測(cè)進(jìn)行了 人員間、不同時(shí)間、不同儀器、同一標(biāo)本不同孔間的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表6所示，所有結(jié)果均 顯示一致，本檢測(cè)精密度為100%。
[0030] 因此，本發(fā)明所提供的引物和檢測(cè)方法可作為一種獨(dú)立的、應(yīng)用廣泛的鑒定方法， 解決了GSTMl進(jìn)行準(zhǔn)確分型鑒定的問(wèn)題，發(fā)揮PCR-SNaPshotPCR對(duì)所述基因位點(diǎn)基因分型 結(jié)果精確、高通量操作的特點(diǎn)，有助于預(yù)測(cè)鉑類藥物化療的預(yù)后，減少不良反應(yīng)，在幫助指 導(dǎo)用藥和個(gè)性化治療方面具有重要意義。
[0031] 以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)GSTMl基因多態(tài)性的引物，其特征在于：包括PCR擴(kuò)增引物 和SNaPshot PCR引物；所述PCR擴(kuò)增引物包括：針對(duì)GSTMl_Loss的上游引物 5'-GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3'和下游引物 5'-CTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3'； 所述SNaPshot PCR引物包括：針對(duì)GSTMl_Loss的SNaPshot PCR引物 5'-TTTTCATCATAGACGAGAAAATCTACAA -3'。2. -種檢測(cè)GSTMl基因多態(tài)性的方法，其特征在于：包括如下步驟：A)提取DNA樣品； B)采用權(quán)利要求1中所述的PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；C)采用權(quán) 利要求1中所述的SNaPshot PCR引物進(jìn)行SNaPshot PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；D)毛 細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，確定SNP位點(diǎn)及其基因型。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)GSTMl基因多態(tài)性的方法，其特征在于：所述步驟A)中 的DNA樣品為EDTA抗凝外周血的DNA樣品。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)GSTMl基因多態(tài)性的方法，其特征在于：所述步驟B)中 的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括：階段1:98°C 3min;階段2:98°C IOs;階段3:58°C 30s;階段4: 72°(：11^11;階段5:返回到階段2,29個(gè)循環(huán)；階段6 :721€51^11;階段7:25°(：保溫。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)GSTMl基因多態(tài)性的方法，其特征在于：所述步驟C) 中的SNaPshot PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括：階段I :96°C IOs ;階段2 :55°C 5s ;階段3 :60°C 30s ;階段4 :返回到階段1，25個(gè)循環(huán)；階段5 :4°C保溫。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)GSTMl基因多態(tài)性的方法，其特征在于：所述步驟D)中， 采用GENEMAPPERID V4. 1軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)GSTMl基因多態(tài)性的引物在制備檢測(cè)GSTMl基因多態(tài)性 試劑中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種檢測(cè)GSTM1基因多態(tài)性的引物與方法，包括PCR擴(kuò)增引物和SNaPshot？PCR引物。本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供的引物可以實(shí)現(xiàn)GSTM1基因多態(tài)性的特異性檢測(cè)，準(zhǔn)確性好。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開(kāi)號(hào)】CN105087774
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510384538
【發(fā)明人】趙薇薇, 胡昌明, 燕啟江, 郭周萍
【申請(qǐng)人】廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司
【公開(kāi)日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2015年6月30日