一種可利用藍白篩選檢測kras熱點突變的引物對的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及分子生物學(xué)和臨床檢驗醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,涉及基因 工程和醫(yī)學(xué)診斷。
【背景技術(shù)】
[0002] KRAS基因突變在腫瘤中發(fā)生頻率較高,不但與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān),還與腫 瘤的治療選擇密切相關(guān)。目前對KRAS基因突變的常用方法,包括直接測序分析,位點特異 性引物擴增,PCR產(chǎn)物熔點曲線分析等。這些技術(shù)各有優(yōu)缺點,目前對腫瘤早期篩查和治療 后效果監(jiān)測領(lǐng)域,還需要研發(fā)沒有假陽性而同時又具有高效率的新技術(shù)。
[0003] 藍白斑篩選-半乳糖苷酶系統(tǒng))是分子生物學(xué)實驗中較常用的篩選標(biāo)記,具有 高效和簡單的優(yōu)勢,主要用于基礎(chǔ)研究,包括提高克隆效率。近年來,藍白斑篩選用于體細 胞突變的體外基礎(chǔ)研究,后者如big-blue小鼠和大鼠(ref);以及用于人類遺傳性突變的 基因分析。但藍白斑篩選技術(shù)用于人類KRAS基因突變,還是一種有待研發(fā)的新技術(shù)。
[0004] 在離體研究中,此類載體攜帶lacZ基因,它編碼e-半乳糖苷酶的N-末端 (a-肽),并且處于誘導(dǎo)物IPTG(異丙基-0 -D-硫代半乳糖苷,與乳糖結(jié)構(gòu)類似但不能 被半乳糖苷酶降解)誘導(dǎo)的啟動子調(diào)控之下。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主菌為LacZAM15基 因型(含有編碼N-末端缺陷型的半乳糖苷酶多肽的基因)。未重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主 菌后,在IPTG的誘導(dǎo)下,質(zhì)粒與宿主菌分別表達缺陷但可以相互補償?shù)膬蓚€肽(即a-互 補),形成了有功能的0 -半乳糖苷酶,該酶能把培養(yǎng)基中無色的X-gal(5-溴-4-氯-3- 口引 哚-0 -D-半乳糖苷)底物分解成半乳糖和深藍色的5-溴-4-氯-靛藍,菌落呈現(xiàn)藍色。但 當(dāng)外源DNA插入質(zhì)粒位于a-肽編碼序列中的多克隆位點時,由于破壞了a-肽的閱讀框 架,使其編碼的a-肽失去活性,則重組子所在的細菌不能完成a互補,不能形成有活性的 半乳糖苷酶,致使重組菌形成白色菌落。因此,可以借助藍白斑篩選出重組子。
[0005] 在多種腫瘤相關(guān)突變中,如缺失突變,插入突變,和多種點突變,或者可以直接導(dǎo) 致TAA,TAG,TGA等終止密碼子的出現(xiàn)與喪失,或者通過人工移碼技術(shù)獲得野生基因與突變 基因具有含或不含終止密碼子的情形。這樣,利用位于突變序列上下游的擴增引物對對其 進行擴增,并將擴增片段插入原核表達載體,便可以得到藍白顏色不同的菌落。本發(fā)明針對 KRAS熱點突變,獲得了兩條可檢測基因突變的PCR引物對。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可以在可能混合有野生與突變基因片段的 生物標(biāo)本中檢測KRAS突變基因的引物對。
[0007] 為了解決上述的技術(shù)問題,本發(fā)明提供了一種可利用藍白篩選檢測KRAS熱點突 變的引物對,其特征在于,上游引物a序列為TAGCCAAGCTTTGACTGCATACAAACTTGT,SeqNo. 2 所示;下游引物d序列為:CGTCAGGATCCTTGGACCATAITCGTCCACA,如SeqNo. 3 所示。
[0008] 本發(fā)明的兩條引物的五末端分別帶有用于亞克隆的限制性酶切位點Hindlll位 點和BamHI位點,還具有與KRAS基因熱點突變位點側(cè)翼序列完全互補的序列。本發(fā)明的引 物針對野生序列的擴增產(chǎn)物在亞克隆后不產(chǎn)生終止密碼子、針對熱點突變的擴增產(chǎn)物在亞 克隆后產(chǎn)生終止密碼子。
[0009] 本發(fā)明的引物對針對KRAS第12位的突變密碼子tga,藍白篩選檢測中相應(yīng)地產(chǎn)生 的終止密碼子為tga。
[0010] 本發(fā)明的引物對針對KRAS第12位的突變密碼子taa,藍白篩選檢測中相應(yīng)地產(chǎn)生 終止密碼子為taa。
[0011] 本發(fā)明的引物對針對KRAS第13位的突變密碼子tga,藍白篩選檢測中相應(yīng)地產(chǎn)生 終止密碼子為tga。
[0012] 本發(fā)明提供了一種引物對用于檢測KRAS基因的第12位密碼子或第13密碼子的 突變,所述引物對a,d序列如SeqNo. 2,SeqNo. 3所示。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種檢測試劑盒,其包含有如SeqNo. 2,SeqNo. 3所示的引物對 a和d〇
[0014] 通過設(shè)計一對序列特異性引物,在KRAS基因熱點突變的側(cè)翼開始進行PCR擴增反 應(yīng);將擴增反應(yīng)亞克隆至具有藍白篩選功能的原核載體,對待測標(biāo)本中的野生序列片段與 突變序列片段進行藍白菌落斑篩選。本發(fā)明提供的引物對具有從數(shù)以百計和數(shù)以千計的野 生基因片段中選擇性對突變序列形成白色菌落的能力,藍白斑篩選得到的白色菌落通過基 因測序分析,一方面可以確定該待測標(biāo)本中有無基因突變;另一方面,測序分析還能保證該 引物對擴增得到的產(chǎn)物突變位點是十二位密碼子還是十三位密碼子。
[0015] 本發(fā)明的技術(shù)關(guān)鍵為將KRAS基因熱點突變的堿基改變轉(zhuǎn)換成為顏色不同的大腸 桿菌菌落。該技術(shù)實施的措施為設(shè)計具有擴增功能,還同時能通過亞克隆調(diào)整以適應(yīng)貝塔 半乳糖苷酶基因閱讀框架能力的PCR引物對。
[0016] 用于亞克隆的藍白斑菌落篩選實驗,主要用于檢測亞克隆后插入片段是否成功插 入。其原理是插入片段尤其是長的插入片段的成功插入,一般都會由于插入而引入新的終 止密碼子導(dǎo)致貝塔半乳糖苷酶基因產(chǎn)物表達的終止,這樣大腸桿菌菌落因為缺乏貝塔半乳 糖苷酶而不能將沒有顏色的化學(xué)物質(zhì)5-溴-4-氯-3-吲哚-0 -D-半乳糖苷通過酶化學(xué)反 應(yīng)轉(zhuǎn)換為具有藍色的5-溴-4-氯-靛藍。我們最近的研究表明,在插入較短片段時,通過 引入終止密碼子,同樣可以進行藍白斑篩選。
[0017] 亞克隆常用方法為T/A克隆和利用限制性內(nèi)切酶位點定點克隆。前者的優(yōu)點是 PCR產(chǎn)物不需要后處理,直接進行連接反應(yīng)亞克隆至相應(yīng)T載體之上。該方法的原理是PCR低保真DNA聚合酶的反應(yīng)產(chǎn)物中有大約一半的產(chǎn)物的三末端帶有一個非模板依賴性的A堿 基,而克隆載體的五末端以預(yù)先設(shè)置了一個突出的T堿基,通過TA堿基互補配對,達到對 PCR產(chǎn)物直接克隆的效果。利用限制性酶切位點進行的亞克隆,缺點是需要對PCR產(chǎn)物繼 續(xù)后處理,先利用限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物酶切,然后進行亞克隆。限制性酶切位點進行的 亞克隆方案的優(yōu)點是能夠保證PCR產(chǎn)物在亞克隆后按照設(shè)計要求,適應(yīng)克隆載體的閱讀框 架。
[0018] 本發(fā)明提供的一對引物的5末端,采用上游引物5末端為限制性內(nèi)切酶Hindlll 和下游引物為5末端為限制性內(nèi)切酶BamHI。限制性內(nèi)切酶可以產(chǎn)生兩個不同粘性末端的 技術(shù)方案。不同粘性末端的使用,避免了對載體進行去磷酸化處理,保證高效率的同時,還 能減低非特異性克隆產(chǎn)物。
[0019] 本發(fā)明的引物對具有對KRAS基因中包含12號和13號熱點突變所在區(qū)域進行序 列特異性擴增能力,同時因為KRAS基因熱點突變具有通過藍白載體進行大腸桿菌菌落顏 色轉(zhuǎn)換的能力。本發(fā)明的PCR引物對擴增的產(chǎn)物,在亞克隆至藍白篩選載體上后,只增加34 個氨基酸,不形成終止密碼子,也因此不影響貝塔半乳糖苷酶相關(guān)基因產(chǎn)物的表達,轉(zhuǎn)化后 相應(yīng)的大腸桿菌菌落為藍色。然而,該引物對擴增含有KRAS基因12位或13位密碼子的熱 點突變時,對于GG/AA突變,將產(chǎn)生TAA終止密碼子,對于GG/GA突變,將產(chǎn)生TGA終止密碼 子,對于GG/AG突變,將產(chǎn)生TAG終止密碼子,這些PCR擴增產(chǎn)物在亞克隆至原核克隆載體, 理論上轉(zhuǎn)化后得到的相應(yīng)大腸桿菌菌落為白色。
[0020] 在腫瘤診斷的臨床應(yīng)用方面,待測標(biāo)本主要為腫瘤組織和血中游離核酸兩類。對 腫瘤組織而言,當(dāng)活檢標(biāo)本中大于百分之十以上均為腫瘤細胞時,基因突變檢測的幾乎所 有相關(guān)技術(shù)均可以用于該標(biāo)本的基因突變檢測,其中最為臨床接受的金標(biāo)準(zhǔn)為部分鏈終止 法測序技術(shù)。然而,若活檢標(biāo)本中的腫瘤細胞含量低于百分之十,但仍高于百分之一時,新 一代高通量測序技術(shù)可用于該類標(biāo)本的基因突變檢測。
[0021] 對活檢標(biāo)本中腫瘤細胞含量低于百分之一的標(biāo)本,以及血中游離核酸標(biāo)本,由于 其中腫瘤突變基因部分與正?;虻谋壤陀诎俜种唬芏嘤糜诜治鲞z傳性基因異常的 基因診斷技術(shù)均難以有效檢測這些微量的突變基因。藍白篩選技術(shù)具有從大量野生菌落中 挑選可能含有突變基因片段的菌落的能力。對常用的10厘米細菌生長平板,可生長的單克 隆菌落可以達到2000-3000個菌落。從這些菌落中挑選一個至數(shù)個可能的白色菌落,通過 進一步的測序分析,可以對稀有突變進行有效的分析。本發(fā)明提供的引物對,借助PCR擴增 的高效率,借助藍白篩選的高效率,和測序技術(shù)的排除假陽性的高特異性,為含量稀有的腫 瘤突變基因標(biāo)本的基因診斷,提供了一種高效而又可靠的技術(shù)。
[0022] 本發(fā)明的引物對在KRAS基因13位密碼子熱點突變的檢測中得到了證實,可以檢 測到一千比一的低含量突變。該引物對對KRAS基因第12位熱點突變TGG同樣適用,在KRAS 的12位和13位密碼子熱點突變中,有三種突變均可通過采用本發(fā)明的PCR引物對轉(zhuǎn)化為 藍白菌落的差異。
[0023] 在與腫瘤突變相關(guān)的基因突變中,存在多種熱點突變可以通過體外調(diào)整貝塔半乳 糖苷酶基因的閱讀框架而達到采用藍白區(qū)分相應(yīng)基因的野生與突變基因片段的目的。因 此,本發(fā)明的PCR引物對可以作為一種技術(shù)方案,通過針對不同基因突變設(shè)計相應(yīng)的引物 對,研發(fā)相應(yīng)的基因檢測技術(shù)。
[0024] 本發(fā)明通過采用體外調(diào)整基因閱讀框架的原理,將用于亞克隆的藍白用于檢測腫 瘤突變KRAS基因12和13位氨基酸編碼子的熱點突變,本發(fā)明中的引物具有選擇性擴增、 調(diào)整閱讀框架雙重功能,對能將KRAS熱點突變轉(zhuǎn)換成貝塔半乳糖苷酶融合基因中的一種 終止密碼子,達到野生基因片段在亞克隆后形成藍色大腸桿菌菌落而突變基因片段在亞克 隆后形成白色菌落的篩選效果。
【附圖說明】
[0025] 圖1為a,d引物擴增的野生型PCR產(chǎn)品電泳圖譜。
[0026] 圖2為重疊延伸PCR工作原理示意圖。
[0027] 圖3為第一輪PCR電泳圖。1,2泳道為產(chǎn)物ab;3,4泳道為產(chǎn)物cd;5泳道為lOObp DNAmarker〇
[0028] 圖4為KRAS野生模板質(zhì)粒測序圖。
[0029] 圖5為含KRAS第12位密碼子突變質(zhì)粒的測序圖。
[0030] 圖6A野生型質(zhì)粒菌落形成圖;圖6B為KRAS第12位密碼子突變型質(zhì)粒菌落形成 圖。
[0031] 圖7A為KRAS野生型與12位密碼子突變基因片段質(zhì)粒為30:1的藍白斑檢測菌落 形成結(jié)果;圖7B為KRAS野生型與12位密碼子突變基因片段質(zhì)粒為100:1的藍白斑檢測菌 落形成結(jié)果;圖7C為KRAS野生型與12位密碼子突變基因片段質(zhì)粒為300:1的藍白斑檢測