一種抗犬細(xì)小病毒蛋白VP2特異性IgY的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗犬細(xì)小病毒蛋白VP2特異性IgY的制備方法，包括以下步驟：（1）根據(jù)CPV-VP2基因序列，設(shè)計一對引物，PCR擴(kuò)增CPV-VP2基因，連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，提取質(zhì)粒，酶切分析，陽性質(zhì)粒測序，對測序結(jié)果進(jìn)行比較分析；（2）VP2蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化:pMD18-T-VP2和pET-32a載體使用BamH?I和Xho?I雙酶切，目的片段連接，構(gòu)建pET-32a-VP2表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化Bal21（DE3）pLysS感受態(tài)細(xì)菌，酶切和PCR鑒定后，優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)濃度和時間，進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，使用Ni+親和層析柱對重組蛋白進(jìn)行純化；（3）抗VP2-IgY抗體的制備：純化的VP2蛋白免疫產(chǎn)蛋雞，使用PEG6000提取特異性IgY抗體，并進(jìn)行SDS-PAGE分析。本發(fā)明提取的抗VP2-IgY抗體可較好地結(jié)合VP2蛋白，而與降解片段無交叉反應(yīng)。
【專利說明】一種抗犬細(xì)小病毒蛋白VP2特異性IgY的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種特異性IgY的制備和應(yīng)用，具體涉及一種抗酸性橙II卵黃抗體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus, CPV)可引起犬發(fā)生出血性腸炎和心肌炎，以6月齡動物發(fā)病較多，占全年發(fā)病數(shù)的65.7%。流行季節(jié)差異不大，以春秋季節(jié)略多(劉大飛等
2009)。在中國，犬細(xì)小病毒病首次報道時間為1983年，嚴(yán)重危害我國養(yǎng)犬業(yè)，并造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。[0003]CPV為單鏈DNA病毒，含有5323個核苷酸，包含兩個ORF (Open readingframe, 0RF)，3’端ORF編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSl和NS2，5’端ORF編碼結(jié)構(gòu)蛋白VPl和VP2(Zhaoet al.2011)。病毒空衣殼蛋白含有VPl (83ku)和VP2 (67ku)兩種蛋白質(zhì)。CPV粒子由60個亞單位裝配而成，VP2占90%，而VPl只占10% (Reed et al.1988)。VP2構(gòu)成CPV衣殼蛋白的主要成分，是CPV的主要保護(hù)性抗原蛋白，且具有識別宿主受體、決定病毒感染不同組織細(xì)胞的功能。CPV衣殼由8個反向平行的β-折疊組成，在折疊間的四個環(huán)，環(huán)1、3、4來自VP2，構(gòu)成了衣殼的表面，形成2.2nm纖突，該纖突的頂部和肩部為病毒衣殼的功能部分，包含了 CPV的兩個主要中和位點，同時為病毒識別受體的部位(Agbandje et al.1995)。使用全病毒粒子進(jìn)行免疫吸附試驗顯示可能有6-10個抗原表位位于衣殼表面，3個抗原位點位于VP2蛋白的氨基端，3個抗原表位位于VP2蛋白中環(huán)所形成的纖突上，且可能是病毒誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要目標(biāo)位點(Langeveld et al.1993)。使用軟件分析，CPV病毒的B細(xì)胞表位主要位于VP2蛋白上，同時VP2蛋白有兩個親水性區(qū)域，分別位于VP2蛋白氮端第5-30氨基酸和第340-420位氨基酸，如1_38，73-83，294-326等，但其最終效果還需通過試驗進(jìn)一步證實(蘇建青等2007;王凈等2011)。
[0004]犬心肌炎和出血性胃腸炎是CPV感染的不同表現(xiàn)形式，3-4周齡的幼犬感染后易患急性心肌炎，而成年犬和10周齡以上的犬易患腸炎綜合征。CPV感染細(xì)胞后可使細(xì)胞線粒體腫脹，造成細(xì)胞損壞，病死犬剖檢出現(xiàn)小腸壞死現(xiàn)象，有時伴有心肌淤血、變薄(周云朵等2011)。CPV在感染不同時期，病毒通過腸道排出數(shù)量不同，HA檢測發(fā)現(xiàn)，犬在感染CPV后，在第5-8天可檢測出相應(yīng)的病毒，感染4天后，可分離出相應(yīng)的病毒，實時熒光定量PCR檢測顯示其排毒持續(xù)時間達(dá)I月左右(Decaro et al.2005)。
[0005]CPV實驗室檢測方法主要包括免疫層析(Immunochromatography, 1C)、血凝實驗(Hemagglutination test, HA)、PCR等，各檢測方法的檢測限不同。實時熒光定量PCR靈敏度最高，檢測限可達(dá)到102拷貝/ μ L左右，且具有較好的重復(fù)性(李英俊等2010;劉海防等
2010)。將IC、HA、PCR和敏感性較高的實時熒光定量PCR比較，符合率分別為56.2%,68.5%、93.2% (Decaro et al.2010)。臨床普遍使用CPV膠體金檢測試劑盒進(jìn)行檢測，在樣品病毒含量大于105/mg時，檢出率可達(dá)70%，且對各亞型檢出率基本相同(Decaro et al.2010)。劉忠華等(2003)建立的PCR診斷方法，可以區(qū)別疫苗株和野毒株，具有較好的敏感性和特異性。PCR檢測方法敏感性較高，但需特殊儀器，不適合基層檢測的需要。楊慧等(2010)建立的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)，不需要相應(yīng)的PCR儀，且檢測時間短暫，敏感性達(dá)到9.3 X 10-5ng/μ L，具有較好的特異性，適合基層推廣使用。
[0006]抗體的檢測可以為免疫接種程序的制定和臨床診斷提供依據(jù)。相比其它抗體檢測方法，膠體金試紙條和ELISA試劑盒操作簡便，價格低廉，在臨床上被廣泛應(yīng)用，膠體金試紙條和傳統(tǒng)的HI相比，其敏感性和特異性達(dá)到97.1%，76.6%，而ELISA試劑盒陽性檢出率達(dá)到85%，和HI符合率達(dá)到80% (Oh et al.2006;劉劍郁等2006)。
[0007]IgY技術(shù)，即通過對禽類(雞)免疫注射特定抗原，從卵黃中獲得特異性多克隆抗體。相對于哺乳動物抗體，IgY技術(shù)避免了常規(guī)的動物采血，滿足動物福利要求，且抗體產(chǎn)量大，制備相對簡單，經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢明顯，更為重要的是，IgY還具有一系列生物學(xué)與抗體特性與優(yōu)勢。近年來，IgY抗體在醫(yī)藥、生物【技術(shù)領(lǐng)域】都呈現(xiàn)出良好的發(fā)展勢頭。IgY已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒等病原體檢測，特異性、敏感性較好，同時能夠降低CPV治療成本和基于IgY檢測試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種抗犬細(xì)小病毒蛋白VP2特異性IgY的制備方法。
[0009]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0010]一種抗犬細(xì)小病毒蛋白VP2特異性IgY的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟:
[0011](I)犬細(xì)小病毒VP2基因的克隆與序列分析:根據(jù)CPV-VP2基因序列，利用primerprime5.0軟件，設(shè)計一對引物，PCR擴(kuò)增CPV-VP2基因(1755bp)，連接至pMD18_T載體，轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，`提取質(zhì)粒，酶切分析，陽性質(zhì)粒測序。結(jié)果表明，實驗所獲西安分離株為CPV-2a，和國外參考株核苷酸相似性在92.4%以上。
[0012](2)VP2蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化。pMD18-T-VP2和pET-32a載體使用BamHI和Xho I雙酶切，目的片段連接，構(gòu)建pET-32a-VP2表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化Bal21 (DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)菌，酶切和PCR鑒定后，優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)濃度和時間，進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析，使用Ni+親和層析柱對重組蛋白進(jìn)行純化。結(jié)果表明，構(gòu)建成功pET-32a-VP2表達(dá)載體，重組VP2蛋白在0.75mmol/L的IPTG誘導(dǎo)5h，主要以包涵體形式存在，除89ku的VP2目的蛋白外，在50ku和40ku附近出現(xiàn)2個低分子量片段，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni+柱純化后，出現(xiàn)89ku和50ku兩個片段。Western blot表明重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。
[0013](3)抗VP2_IgY抗體的制備。純化的VP2蛋白免疫產(chǎn)蛋雞，使用PEG6000提取特異性IgY抗體，并進(jìn)行SDS-PAGE分析。間接ELISA測定免疫后抗VP2_IgY抗體效價，Westernblot鑒定所獲抗VP2-1gY的特異性。結(jié)果表明，IgY抗體經(jīng)SDS-PAGE分析包含兩條鏈，重鏈(65ku)和輕鏈(19ku);四免后，抗VP2-1gY效價達(dá)到1:40560, Western blot表明，所制備IgY抗體可特異性結(jié)合VP2蛋白。
[0014]所述制備免疫蛋方法如下:向20周齡禽類進(jìn)行初次免疫注射，免疫劑量為300 μ g/只,初次免疫21天之后,進(jìn)行4次加強免疫,間隔時間為21天,免疫劑量為250 μ g/只，所屬禽類為雞。
[0015]所述提取IgY的方法如下；
[0016](I)將所述收集的蛋進(jìn)行卵黃與卵清分離，收集卵黃，將卵黃使用PBS (pH7.4)按照體積比1:2進(jìn)行稀釋；
[0017](2)向稀釋液加入質(zhì)量體積比為3.5%的PEG-6000，充分?jǐn)嚢?，搖床上室溫作用30分鐘；
[0018](3)將混合液離心，收集上清，過濾，濾液加入質(zhì)量體積比為8.5%的PEG-6000，充分?jǐn)嚢瑁瑩u床上室溫作用30分鐘；
[0019](4)將經(jīng)過攪拌后的混合液離心，棄去上清液，沉淀使用10毫升的PBS懸浮，加入質(zhì)量體積比為12%的PEG-6000，充分?jǐn)嚢?，搖床上室溫作用30分鐘，再進(jìn)行離心，獲得沉淀物；
[0020](5)將所述沉淀物使用1.2毫升PBS溶解后，使用透析帶進(jìn)行透析，使用PBS透析過夜，獲得IgY，并保存在-20°C備用。
[0021]本發(fā)明的有益效果:
[0022](I)本發(fā)明的方法提取的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性；
[0023](2 )本發(fā)明提取的抗VP2_IgY抗體可較好地結(jié)合VP2蛋白，而與降解片段無交叉反應(yīng)；
[0024](3)提取方法相對簡單，抗體產(chǎn)量大，制備成本低。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作詳細(xì)說明。
[0026]一種抗犬細(xì)小病毒VP2蛋白IgY的制備方法，所述方法包括以下步驟:
[0027](I)犬細(xì)小病毒VP2基因的克隆與序列分析。根據(jù)GenBank報道的有關(guān)CPV-VP2基因序列，利用primer prime5.0軟件，設(shè)計一對引物，PCR擴(kuò)增CPV-VP2基因(1755bp)，連接至pMDlS-T載體，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，提取質(zhì)粒，酶切分析，陽性質(zhì)粒測序。
[0028](2)VP2蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化。pMD18-T-VP2和pET_32a載體使用BamHI和XhoI雙酶切，目的片段連接，構(gòu)建pET-32a-VP2表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化Bal21 (DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)菌，酶切和PCR鑒定后，優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)濃度和時間，進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析，使用Ni+親和層析柱對重組蛋白進(jìn)行純化。結(jié)果表明，構(gòu)建成功pET-32a-VP2表達(dá)載體，重組VP2蛋白在0.75mmol/L的IPTG誘導(dǎo)5h，主要以包涵體形式存在，除89ku的VP2目的蛋白外，在50ku和40ku附近出現(xiàn)2個低分子量片段。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni+柱純化后，出現(xiàn)89ku和50ku兩個片段。Western blot表明重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。
[0029](3)抗VP2_IgY抗體的制備。純化的VP2蛋白免疫產(chǎn)蛋雞，使用PEG6000提取特異性IgY抗體，并進(jìn)行SDS-PAGE分析。間接ELISA測定免疫后抗VP2_IgY抗體效價，Westernblot鑒定所獲抗VP2-1gY的特異性。結(jié)果表明，IgY抗體經(jīng)SDS-PAGE分析包含兩條鏈，重鏈(65ku)和輕鏈(19ku);四免后，抗VP2-1gY效價達(dá)到1:40560, Western blot表明，所制備IgY抗體可特異性結(jié)合VP2蛋白。[0030]實施例
[0031]本實施例擬對CPV-VP2結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行克隆，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a_VP2，表達(dá)和純化VP2蛋白，并將其作為免疫原，免疫產(chǎn)蛋雞，生產(chǎn)抗VP2重組蛋白特異性IgY抗體。
[0032]1、引物設(shè)計與合成
[0033]根據(jù)GenBank登記的犬細(xì)小病毒參考株(FJ011098)序列，使用軟件PrimerPrime5.0設(shè)計一對引物，用于擴(kuò)增VP2基因全長DNA序列(1755bp)。上游引物P:5,-ATGGATCCCCAATGAGTGATGGAGCAG-3,(下劃線處為 BamH I 酶切位點)，下游引物R:5,-CCGCTCGAGATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTG-3，(下劃線處為Xho I酶切位點)。引物由上海生工公司合成，雙蒸水稀釋為IOpmol/μ L，-20°C保存。
[0034]2、VP2基因的PCR擴(kuò)增
[0035]模板制備:取病毒上清50 μ L，沸水煮IOmin后，12000rpm離心lOmin，取上清。
[0036]PCR反應(yīng)體系如下:
[0037]
試劑體積 模板15 μ L 10X緩沖液5 UL
MgCI2 (25 mmol/L)3 μ L
dNTPs (2.5 mmol/L)4 uL
上、下游引物 P，R (20 uraol/L) I μ L
TaqTM 酶(5 U/μ L)0.25 μ L
雙蒸水至50 μ L
[0038]反應(yīng)參數(shù):951:預(yù)變性51^11，941:變性lmin，55°C 復(fù)性 lmin，72°C 延伸 Imin，35 個循環(huán)，72°C延伸IOmin。
[0039]3、PCR產(chǎn)物的回收與純化
[0040]PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，100V, 50min。凝膠呈像系統(tǒng)進(jìn)行觀察，拍照。
[0041]紫外燈下，使用刀片切下含目的片段的凝膠，吸水紙吸干后，置于離心管中，稱重。按照北京百泰克生物技術(shù)有限公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒操作說明書進(jìn)行操作如下:
[0042]( I)加入三倍體積的溶膠/結(jié)合液；
[0043](2)56°C水浴放置IOmin (至膠完全溶解)，2-3分鐘渦旋震蕩數(shù)次，幫助加速溶解；
[0044](3)將溶解的膠溶液加入到收集管中的吸附柱，12000rpm離心30_60s ；
[0045](4)將700 μ L漂洗液加入到吸附柱中，12000rpm離心Imin ；
[0046](5)將吸附柱置于空收集管中，12000rpm離心2min ；
[0047](6)將吸附柱置于1.5ml無菌離心管中，將50 μ L洗脫緩沖液加入到吸附膜中間，室溫放置2min, 12000rpm離心Imin,收集物保存于-20 °C。[0048]4、回收產(chǎn)物與pMD18-T-VP2載體連接與轉(zhuǎn)化
[0049]連接
[0050]按大連寶生物pMD18-T載體操作試劑盒說明書將PCR回收產(chǎn)物與pMD18_T載體連接。連接體系如下:
[0051]pMD18_T VectorIuL
[0052]回收片段4yL
[0053]Solution I5 μ L
[0054]混勻后4°C連接過夜。
[0055]感受態(tài)細(xì)胞的制備
[0056](I)接種針挑取大腸桿菌(-80°C保存)，在LB培養(yǎng)基平板劃線，37 °C培養(yǎng)；挑取單菌落，接種于LB培養(yǎng)基(5ml),振蕩培養(yǎng)過夜；
[0057](2)菌液接種于100ml LB( 1:100)液體培養(yǎng)基，震蕩培養(yǎng)3h，至0D600 ^ 0.4-0.6 ;
[0058](3)無菌條件下將100ml 細(xì)菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到一個用冰預(yù)冷的50ml離心管中，冰上放置20min ；
[0059](4) 4°C離心，5000rpm, IOmin ；
[0060](5)棄上清，將離心管倒置lmin，以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡；
[0061](6)加 IOml 預(yù)冷的 CaCl2 (0.lmol/L)溶液，冰上放置 30min ；
[0062](7) 4°C離心，5000rpm, IOmin,棄上清；
[0063](8)加IOml預(yù)冷的CaCl2 (0.lmol/L)溶液重懸細(xì)胞，加入20%甘油，_80°C貯存。
[0064]轉(zhuǎn)化
[0065](I)從_80°C取出制備的DH5a感受態(tài)細(xì)菌，置冰上，完全解凍后，加入10 μ L連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰上放置30min ；
[0066](2)將混合物42°C加熱45s后，置冰上Imin ；
[0067](3)加入890 μ L LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)60min ;
[0068](4)菌液涂于含有X_gal、IPTG、Amp的LB瓊脂培養(yǎng)基，正向放置30min后，37°C倒置培養(yǎng)過夜，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；
[0069](5)挑選3個白色菌落，接種于含有氨芐青霉素(100μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0070]5、重組質(zhì)粒的提取
[0071]含有重組質(zhì)粒的DH5 α菌在含有Amp的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，提質(zhì)粒酶切鑒定:
[0072]參照威格拉斯質(zhì)粒小量提取試劑盒，提取pMD18-T-VP2質(zhì)粒，操作如下
[0073](I)收菌:取過夜培養(yǎng)的DH5a細(xì)菌2ml，置于2ml離心管中，離心，12000rpm，2min,棄上清,取沉淀；
[0074](2)重懸:加入200 μ L Pl緩沖液，充分混懸震蕩菌體沉淀10_15s，使其完全散開，至無絮狀物存在；
[0075](3)裂解:加入200 μ L P2緩沖液，輕輕點到離心管3-5次，室溫放置2_3min，使細(xì)菌完全裂解，溶液透明，裂解時間不超過5min ；
[0076](4)中和:加入300 μ L P3緩沖液，輕輕顛倒離心管4_6次，充分混勻，室溫放置l_5min,可見白色絮狀產(chǎn)生,離心12000rpm,8min ；[0077](5)柱平衡:向插入套管的離心柱內(nèi)加入300 μ L PE緩沖液，12000rpm，30s ；
[0078](6) DNA結(jié)合:中和后離心的質(zhì)粒粗提物上清小心吸出，轉(zhuǎn)移至經(jīng)平衡液處理過的離心柱內(nèi)，離心，12000rpm, 30s,棄去套管內(nèi)液體，將離心柱插回套管；
[0079](7)清洗:向離心柱內(nèi)加入500 μ L PWT緩沖液，離心，12000rpm，30s，棄去套管內(nèi)廢液；
[0080](8)再清洗:加入700 μ L Pff PWT緩沖液，離心，12000rpm，30s，棄去套管內(nèi)廢液，再次離心2min ；
[0081](9)收離心柱:小心取出離心柱，不要沾上套管內(nèi)的廢液，棄去套管；
[0082](10)洗脫DNA:將離心柱插入一個新的1.5ml離心管，在離心管內(nèi)硅膠膜中心位置加入100 μ L洗脫液，12000rpm, lmin,離心管中即得純化的質(zhì)粒DNA溶液，-20°C保存。
[0083]6、重組質(zhì)粒的酶切鑒定
[0084]重組質(zhì)粒使用BamH 1、XhoI進(jìn)行酶切鑒定，酶切體系如下。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠(0.89ODNA電泳，100V，50min。電泳后，凝膠置凝膠呈像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。目的片段使用DNA凝膠回收試劑盒回收(操作如上)，-20°C保存。
[0085]
BamH II μ L
Xho II uL
IOX緩沖液2 UL
質(zhì)粒5 μ L
加蒸餾水至20 μ L
[0086]37 O酶切反應(yīng)2h
[0087]7、表達(dá)質(zhì)粒pET_32a擴(kuò)增
[0088]取實驗室保存的含pET_32a載體的Bal21 (DE3)菌株，按1:100接種于含有氨芐青霉素(100 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜。質(zhì)粒使用試劑盒提取，-20°c貯存?zhèn)溆谩?br> [0089]8、重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a_VP2的構(gòu)建及鑒定
[0090]克隆載體pMD18-T-VP2及表達(dá)載體pET_32a分別使用BamH I及Xho I雙酶切，酶切體系如上所述。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，目的片段使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，操作如上所述。按照DNA連接試劑盒操作說明，將酶切回收片段pET-32a載體和VP2片段進(jìn)行連接，連接體系如下。
[0091]連接產(chǎn)物(IOyL)轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞(轉(zhuǎn)化過程如上所述)，菌液涂布于含有氨芐青霉素(100 μ g/L)的LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，接種于含有氨芐青霉素(100 μ g/L)的LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切和PCR鑒定后，陽性質(zhì)粒命名為pET-32a-VP2，并將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Bal21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞。
[0092]連接體系如下
[0093]pET-32a3 μ L
[0094]VP22 μ L
[0095]Solution I5 μ L[0096]4 °C連接過夜。
[0097]9、VP2基因誘導(dǎo)表達(dá)時間的確定
[0098]將含有pET-32a_VP2的Bal21菌接種于含有氨芐青霉素(100 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)至0D600達(dá)到0.6-1.0時，加入IPTG (lmmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)，分別收集誘導(dǎo)后0h、2h、3h、4h、5h和6h菌液Iml,離心,8000rpm, 5min,收集沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。pET-32a空載體誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后4h，各取1ml，作為對照。
[0099]SDS-PAGE 電泳:
[0100]制膠:洗凈玻璃板，固定在制膠器上，按分離膠配方，依次加入各試劑，最后加入過硫酸銨，上下顛倒混勻后，快速注入兩玻璃板之間，膠上覆蓋一層雙蒸水，靜置30min。傾去上層雙蒸水，吸水紙吸干殘留的雙蒸水，加入配置好的5%濃縮膠，水平插入梳子，靜置2h。垂直移去梳子，去掉制膠器，移入電泳槽，在內(nèi)、外槽加入電泳緩沖液，電泳液沒過膠孔，使用注射器吸取電泳液，沖洗膠孔中殘留膠。
[0101]上樣:樣品按照2:1比例加入電泳上樣緩沖液，渦旋混勻，沸水浴10min，8000rpm離心lmin，取上清。使用移液槍上樣，20 μ L/孔。電泳，濃縮膠電壓為90V，當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠時，提高電壓至120V，溴酚藍(lán)至膠底部1cm，停止電泳。
[0102]染色:電泳結(jié)束后，取下凝膠，使用刀片切掉濃縮膠，蒸餾水沖洗后，置于凝膠染色液中，室溫?fù)u床上染色5h。
[0103]脫色:染色結(jié)束后，取凝膠置于脫色液中，搖床上進(jìn)行脫色，其間更換染色液3-4次，直至凝膠背景變淡。
[0104]10、VP2基因IPTG誘導(dǎo)濃度的確定
[0105]培養(yǎng)含有pET-32a-VP`2 的 Bal21 菌，待 0D600 達(dá)到 0.6-1.0 時，分別加入 0.5mmol/L、0.75mmol/L、lmmol/L、1.25mmol/L> 1.5mmol/L 和 2mmol/L 的 IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)。收集各組誘導(dǎo)4h菌液，進(jìn)行SDS-PAGE分析。
[0106]11、重組蛋白可溶性分析
[0107]在IPTG最佳誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時間的條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)含有pET-32a_VP2的Bal21菌(200ml)，4°C離心收集菌液，8000rpm，5min。菌體在冰浴中超聲破碎(120W，IOs/次，間隔5s，20min),離心，12000rpm, 5min,分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。pET_32a空載體誘導(dǎo)前、后上清和不溶部分，各取Iml作為對照。
[0108]12、融合蛋白的Western blot分析
[0109]SDS-PAGE電泳分離目的蛋白，操作如上，電泳后，進(jìn)行Western blot鑒定，操作如下:
[0110](I)轉(zhuǎn)膜前準(zhǔn)備:凝膠使用去離子水漂洗后，置于轉(zhuǎn)移緩沖液中。戴上手套，使用刀片分別裁剪與凝膠長、寬相同的6張濾紙，I張PVDF膜。將PVDF膜置于甲醇(100%)中浸泡，與6張濾紙一起浸于轉(zhuǎn)移緩沖液平衡。
[0111](2)轉(zhuǎn)膜:按照3張濾紙、PVDF膜、凝膠、3張濾紙的順序，將其疊放于半干轉(zhuǎn)移裝置的石墨板上，PVDF膜置于正極。使用玻璃棒除去膜與膜，膜與膠之間的氣泡，在濾紙上加入Iml轉(zhuǎn)移緩沖液，進(jìn)行轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移參數(shù):2V，100mA，50min左右。轉(zhuǎn)膜后的凝膠轉(zhuǎn)移至盛有考馬斯亮藍(lán)染液的托盤中，進(jìn)行染色，以檢查蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移是否完全，同時切去濾膜的左下角作為標(biāo)記。[0112](3)封閉:帶上手套，將PVDF膜置于可加熱封接的塑料袋中，加入IOml封閉緩沖液(0.lml/cm2),排除氣泡,搖床上室溫溫育I小時。
[0113](4) 一抗和靶蛋白的結(jié)合:棄去封閉液，加入封閉緩沖液稀釋的抗組氨酸標(biāo)簽一抗(1:5000)，排除氣泡后密封袋口，平放于搖床，室溫溫育1-2小時。
[0114](5)洗膜:剪開塑料袋，棄去封閉液和抗體，TBST漂洗PVDF膜3次，每次10分鐘。
[0115](6) 二抗和一抗的結(jié)合:經(jīng)TBST最后一次洗滌后，把PVDF膜轉(zhuǎn)移至塑料袋，按濾膜面積加入封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(1:5000)，37°C平緩搖動、溫育I小時。
[0116](7)洗滌:將PVDF膜轉(zhuǎn)移至TBST溶液，室溫洗滌3次，IOmin/次。
[0117](8)顯色:暗室中，將魯米唑和雙氧水按照1:1比例混合，制成發(fā)光液。將PVDF膜置于發(fā)光液進(jìn)行顯色，直至條帶清晰后，使用鑷子拿出，置于蒸餾水中漂洗，放到定影液中，定影5min。
[0118]13、表達(dá)蛋白的純化
[0119]在最佳IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時間下，誘導(dǎo)培養(yǎng)含有pET-32a_VP2的Bal21菌(1000ml),8000rpm離心5min,收集菌體沉淀。沉淀使用預(yù)冷的超聲破碎緩沖液洗漆3次，12000rpm離心IOmin,收集沉淀,按3ml/g濕菌比例加入預(yù)冷的超聲波破碎緩沖液,重懸后，冰浴中超聲破碎(120W，IOs/次，間隔5s，20min)。4°C離心，12000rpm, lOmin，取沉淀。沉淀重懸于9倍體積的包涵體洗漆緩沖液I,懸浮后4°C離心，12000rpm, IOmin,取沉淀。沉淀分別使用包涵體洗滌緩沖液I1、III洗滌后，4°C離心，12000rpm, lOmin，取沉淀。將洗滌后的包涵體重懸于包涵體溶解液中(10倍體積),室溫放置,充分裂解。裂解后的包涵體4°C離心，12000rpm, 20min,取上清，0.22 μ m濾膜過濾后，使用Ni+親和層析柱純化，收集洗脫液，進(jìn)行SDS-PAGE分析。純化過程如下:
[0120](I)將Ni+親和層析柱、注射器、核酸蛋白檢測儀進(jìn)行連接；
[0121](2)用5倍柱體積蒸餾水洗親和層析柱，使吸光光度值A(chǔ)達(dá)到最低，且保持不變；
[0122](3)至少5倍柱體積結(jié)合緩沖液平衡親和層析柱，流速控制為lml/min，至吸光光度值A(chǔ)穩(wěn)定；
[0123](4)處理好的樣品上樣,5ml/次；
[0124](5)上樣完畢，使用結(jié)合緩沖液洗親和層析柱，至吸光光度值A(chǔ)穩(wěn)定；
[0125](6)使用洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液各組分進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析；
[0126](7)洗脫完畢后，使用蒸餾水洗親和層析柱，置于15%乙醇，4°C保存。
[0127]親和層析柱Ni+剝離與再生:使用Ni+親和層析柱5次后，進(jìn)行Ni+的剝離與再生。使用10倍柱體積剝離緩沖液洗滌Ni+親和層析柱后，加入lmol/L的NaOH溶液，緩慢洗滌Ih,然后分別加入10倍柱體積蒸餾水和結(jié)合緩沖液進(jìn)行洗滌，加入2ml0.lmol/L Ni+S04溶液進(jìn)行Ni+的再生。
[0128]14、包涵體蛋白復(fù)性
[0129]透析袋處理:透析袋在大體積2% (W/V)NaHC03中煮沸l(wèi)Omin，蒸餾水洗滌后，置于lmmol/L EDTA (pH8.0)中煮沸 lOmin，冷卻后，存放于 4°C。
[0130]洗脫蛋白置于透析袋(截留量為8000-10000)進(jìn)行透析復(fù)性。透析袋置于尿素濃度逐漸降低的PBS溶液中,尿素濃度依次為6mol/L, 5mol/L, 4mol/L, 3mol/L, 2mol/L, OmoI/L,換液間隔時間2h。
[0131]VP2基因的擴(kuò)增
[0132]PCR擴(kuò)增CPV-VP2基因全長序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析后，得到一條與預(yù)計大小(1755bp)相符的電泳條帶。
[0133]15、pMD18-T_VP2 酶切鑒定
[0134]重組克隆質(zhì)粒pMD18-T-VP2經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切分析后，電泳得到兩條片段，與VP2目的基因(1755bp)和pMD18-T載體(2672bp)相符，說明克隆片段連接入pMD18_T載體。
[0135]重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-VP2的構(gòu)建及鑒定
[0136]重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a_VP2I和Xho I雙酶切分析鑒定后，使用PCR進(jìn)行鑒定。酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳后出現(xiàn)兩條條帶，與VP2目的基因(1755bp)和載體片段(5900bp)大小相符，表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增后，出現(xiàn)與VP2大小(1755bp)相似片段，表明VP2目的基因連接至pET-32a載體，表達(dá)載體pET-32a-VP2構(gòu)建成功。
[0137]16、VP2融合蛋白最佳誘導(dǎo)時間的確定
[0138]pET-32a-VP2 在 lmmol/L 的 IPTG誘導(dǎo)下，在80-100ku 間出現(xiàn)目的條帶。VP2(65ku)融合蛋白帶有組氨酸標(biāo)簽，接近89ku。在誘導(dǎo)的不同時間下，取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，表明誘導(dǎo)5h，可獲得相對較好的表達(dá)，pET-32a-VP2分別經(jīng)IPTG誘導(dǎo)2h、3h、4h、5h、6h表達(dá)產(chǎn)物。
[0139]17、VP2融合蛋白IPTG誘導(dǎo)濃度的確定
[0140]在優(yōu)化的誘導(dǎo)時間(5h)下，以0.75mmol/L的IPTG誘導(dǎo)pET_32a_VP2進(jìn)行表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析可獲得相對較好的表達(dá)，分別為pET-32a-VP2在0.5mmol/L、0.75mmol/L、lmmol/L、1.25mmol/L、1.5mmol/L、2mmol/L IPTG誘導(dǎo) 4h 表達(dá)產(chǎn)物,表明增加 IPTG 的誘導(dǎo)濃度，表達(dá)產(chǎn)量并未顯著增加。
[0141]18、VP2融合蛋白的可溶性分析及鑒定
[0142]沉淀和上清分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果在80_100ku間，pET_32a_VP2經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，沉淀中出現(xiàn)條帶，與VP2融合蛋白(89ku)相近，而對照在此處無相應(yīng)目的條帶；沉淀在約50ku及40ku各有一條帶，可見pET-32a-VP2經(jīng)誘導(dǎo)后，上清與對照相比，無相應(yīng)目的條帶出現(xiàn)，說明目的蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中。
[0143]19> Western blot 分析
[0144]使用抗His標(biāo)簽的一抗進(jìn)行Western blot鑒定,在80_100ku之間及50ku附近出現(xiàn)條帶，40ku及上清中無反應(yīng)條帶,說明VP2及50ku融合蛋白表達(dá)正確,帶有組氨酸標(biāo)簽，且具有較好的反應(yīng)原性。
[0145]20、VP2融合蛋白的純化
[0146]VP2融合蛋白使用Ni+色譜柱進(jìn)行純化，收集洗脫液。結(jié)果在89ku及50ku附近出現(xiàn)條帶。
[0147]21、Braford法測定重組蛋白含量
[0148](I)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(lmg/ml)完全溶解于PBS溶液中(0.5mg/ml)；
[0149](2)將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20μ L分別加入各孔中，加PBS稀釋液補足至Ij20 μ L ；[0150](3)將樣品進(jìn)行稀釋，加入到各孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液到20μ L ;
[0151](4)各孔加入200yL Bradford染色液，輕輕用加樣槍吹打均勻，室溫放置3_5min ；
[0152](5)用酶標(biāo)儀測定0D630的吸光光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0153]按照以上步驟加入被測樣品(重組VP2蛋白)，測定A630nm的吸光光度值，使用Origins.0軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算重組蛋白含量。
[0154]22、免疫原制備及免疫[0155]用生理鹽水Iml將純化抗原凍干粉末(含400 μ g抗原)進(jìn)行溶解，加入等量的費氏完全佐劑進(jìn)行乳化，乳化抗原胸肌分點注射海蘭褐產(chǎn)蛋雞(2只)。初免2周、4周、6周后，加入等量費氏不完全佐劑進(jìn)行二免、三免和四免。收集免疫前后雞蛋，消毒，標(biāo)號，4°C保存。
[0156]23、IgY抗體提取與鑒定
[0157]聚乙二醇沉淀法提取IgY抗體,參考Zhang等(2008),操作步驟如下:
[0158](I)使用蛋黃分離器分離卵黃；
[0159](2)卵黃和PBS緩沖液(ρΗ7.5)1:2混合，渦旋，充分混勻；
[0160](3)加入3.5% (W/V，下同)的PEG-6000，渦旋混合，搖床上室溫作用IOmin ；
[0161](4)離心(10000g，4°C，20min，下同)后，出現(xiàn)分層，由上而下為黃色脂肪層、清亮層(IgY)和半固體層；
[0162](5)液體經(jīng)濾紙過濾，棄去沉淀物，測量所得濾液體積，加8.5%PEG-6000，搖床上室溫作用IOmin ；
[0163](6)離心，如上，棄去上清液，沉淀物加IOml PBS溶解，加12% (1.2g) PEG6000，在搖床上室溫作用IOmin ；
[0164](7)離心，如上，棄去上清液，沉淀物加1.2ml PBS溶解；
[0165](8)溶解液轉(zhuǎn)移到透析袋中，大容量PBS溶液中(1000ml)透析過夜；
[0166](9)隔天將透析器內(nèi)IgY抗體液取出，標(biāo)記，-20°C儲存?zhèn)溆谩?br> [0167]提純IgY抗體經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，以鑒定IgY抗體提取純度。
[0168]24、IgY抗體效價的測定
[0169]間接ELISA法測定抗CPV_VP2IgY抗體效價，操作步驟如下:
[0170](I)重組蛋白使用包被緩沖液進(jìn)行稀釋(10 μ g/ml), 100 μ L/孔進(jìn)行包被，4°C孵育過夜；
[0171](2) PBST 洗滌 3 次，5min/次；
[0172](3)加入封閉緩沖液200 μ L/孔，至濕盤中，37°C封閉2H ；
[0173](4) PBST 洗滌，同上；
[0174](5) IgY抗體使用封閉液進(jìn)行稀釋，倍比稀釋1:10、1:20,1:40，直至1:40960 ;未免疫IgY抗體，PBS分別作為陰性和空白對照，37°C孵育Ih ；
[0175](6) PBST 洗滌，同上；
[0176](7)加HRP標(biāo)記的羊抗雞二抗(1:6000)，37°C孵育Ih;
[0177](8) PBST 洗滌，同上；
[0178](9)每孔加入 100 μ L 底物，37°C作用 15min ；
[0179](10)每孔加入50 μ L的2Μ H2S04進(jìn)行終止，讀值0D450。[0180]25、IgY 抗體 Western blot 鑒定
[0181]SDS-PAGE電泳分離VP2重組蛋白，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行Western blot鑒定，方法如上。IgY抗體作為一抗，1:1000稀釋，HRP標(biāo)記的羊抗雞二抗進(jìn)行稀釋，稀釋度為1:5000。
[0182]26、結(jié)果
[0183](I)重組蛋白含量
[0184]重組蛋白洗脫后，經(jīng)過透析,使用Bradford法測定,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=l.63x+0.609(R2=0.998)，VP2重組蛋白純化后濃度接近300 μ g/ml。 [0185](2) IgY抗體的提取及鑒定
[0186]提純IgY經(jīng)SDS-PAGE電泳后，主要包括兩條帶，65ku和19ku，且在40ku附近出現(xiàn)低分子量片段。
[0187](3) ELISA 效價測定
[0188]抗CPV重組VP2蛋白特異性IgY抗體，使用間接ELISA測定，抗體效價在二免后，開始升高，一周后，緩慢降低，三免加強免疫后，效價繼續(xù)升高，四免后，效價達(dá)到1:40960。
[0189](4) Western blot 鑒定
[0190]重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，使用抗VP2_IgY抗體作為一抗，檢測抗體特異性。提取的抗VP2-1gY抗體可較好地結(jié)合VP2蛋白(89ku)，而與降解片段無交叉反應(yīng)。
[0191]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
【權(quán)利要求】
1.一種抗犬細(xì)小病毒蛋白VP2特異性IgY的制備方法，其特征在于:所述方法包括以下步驟: (1)犬細(xì)小病毒VP2基因的克隆與序列分析； (2)VP2蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化； (3)抗VP2-1gY抗體的制備， 具體的包括以下步驟: (1)犬細(xì)小病毒VP2基因的克隆與序列分析:根據(jù)CPV-VP2基因序列，利用軟件設(shè)計一對引物，PCR擴(kuò)增CPV-VP2基因，連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，提取質(zhì)粒，酶切分析，陽性質(zhì)粒測序，對測序結(jié)果進(jìn)行比較分析； (2)VP2蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化:pMD18-T-VP2和pET_32a載體使用BamHI和Xho I雙酶切，目的片段連接，構(gòu)建pET-32a-VP2表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化Bal21 (DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)菌，酶切和PCR鑒定后，優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)濃度和時間，進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，使用Ni+親和層析柱對重組蛋白進(jìn)行純化； (3)抗VP2-1gY抗體的制備:純化的VP2蛋白免疫產(chǎn)蛋雞，使用PEG6000提取特異性IgY抗體，并進(jìn)行SDS-PAGE分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗犬細(xì)小病毒蛋白VP2特異性IgY的制備方法，其特征在于:步驟(1)中根據(jù)GenBank報道的有關(guān)CPV-VP2基因序列,利用primer prime5.0軟件，設(shè)計一對引物，PCR擴(kuò)增CPV-V P2基因，為1755bp，連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，提取質(zhì)粒，酶切分析，陽性質(zhì)粒測序。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗犬細(xì)小病毒蛋白VP2特異性IgY的制備方法，其特征在于:步驟(2)中表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析后使用Ni+親和層析柱對重組蛋白進(jìn)行純化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗犬細(xì)小病毒蛋白VP2特異性IgY的制備方法，其特征在于:步驟(3)中，對提取特異性IgY抗體進(jìn)行SDS-PAGE分析，間接ELISA測定免疫后抗VP2-1gY抗體效價，Western blot鑒定所獲抗VP2_IgY的特異性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗犬細(xì)小病毒蛋白VP2特異性IgY的制備方法，其特征在于:所述制備免疫蛋方法如下:向20周齡禽類進(jìn)行初次免疫注射,免疫劑量為300 μ g/只，初次免疫21天之后，進(jìn)行4次加強免疫，間隔時間為21天，免疫劑量為250 μ g/只。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種抗犬細(xì)小病毒蛋白VP2特異性IgY的制備方法，其特征在于:所述禽類為雞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗犬細(xì)小病毒蛋白VP2特異性IgY的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中提取IgY的方法如下； (1)將所述收集的蛋進(jìn)行卵黃與卵清分離，收集卵黃，將卵黃使用PBS按照體積比1:2進(jìn)行稀釋； (2)向稀釋液加入質(zhì)量體積比為3.5%的PEG-6000，充分?jǐn)嚢?，搖床上室溫作用30分鐘； (3)將混合液離心，收集上清，過濾，濾液加入質(zhì)量體積比為8.5%的PEG-6000，充分?jǐn)嚢?，搖床上室溫作用30分鐘； (4)將經(jīng)過攪拌后的混合液離心，棄去上清液，沉淀使用10毫升的PBS懸浮，加入質(zhì)量體積比為12%的PEG-6000，充分?jǐn)嚢瑁瑩u床上室溫作用30分鐘，再進(jìn)行離心，獲得沉淀物； (5)將所述沉淀物使用1.2毫升PBS溶解后，使用透析帶進(jìn)行透析，使用PBS透析過夜，獲得IgY，并保存在_20°C備用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種抗犬細(xì)小病毒蛋白VP2特異性IgY的制備方法，其特征在于:所述PBS的pH值為7.4。
【文檔編號】C07K16/02GK103570830SQ201310459834
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】張小鶯, 何金鑫, 田澤華 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)