一種與重組酶介導(dǎo)的體內(nèi)基因疊加相兼容的體外基因疊加技術(shù)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種適合體外基因疊加的載體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，含有多個轉(zhuǎn)基因性狀的轉(zhuǎn)基因作物已成為未來發(fā)展的主流方向。當下，將多個轉(zhuǎn)基因性狀疊加到農(nóng)作物品種中主要有四種方法:1，通過對含有不同轉(zhuǎn)基因性狀的的株系進行遺傳雜交，從而將多個轉(zhuǎn)基因性狀聚合到同一株系中。2，通過對已有的轉(zhuǎn)基因品種進行再轉(zhuǎn)化(re-transformat1n)而將多個新的轉(zhuǎn)基因性狀整合到同一品種中。該方法中新的轉(zhuǎn)基因性狀是以隨機的方式整合到植物染色體當中。3，通過位點特異性重組或者同源重組將多個轉(zhuǎn)基因性狀定點整合到已有的轉(zhuǎn)基因座位上。4，將所有的轉(zhuǎn)基因性狀，通過打包的方式(體外基因疊加)以一段DNA的形式重新轉(zhuǎn)化到植物基因組當中。
[0003]以上四種方法中，方法I和方法2會隨著轉(zhuǎn)基因數(shù)目的上升而增多可分離的轉(zhuǎn)基因座位數(shù)?？煞蛛x的轉(zhuǎn)基因座位的增加會對下游的育種工作帶來不便。因為轉(zhuǎn)基因育種過程中，不僅需要獲得含有純合轉(zhuǎn)基因性狀的株系，與此同時植物品種本身內(nèi)在的優(yōu)良性狀也要保持純合狀態(tài)。因此對于二倍體植物或者遺傳上類似于二倍的的多倍體植物，當含有三個不連鎖的轉(zhuǎn)基因性狀時，獲得純合個體的概率為O3。若此時增加7個品種本身具有的、內(nèi)在的優(yōu)良性狀，則獲得具有純合轉(zhuǎn)基因性狀和內(nèi)在優(yōu)良性狀的株系的概率為O'這需要育種學(xué)家在至少大于1000000的后代植株中尋找唯一的一株純合個體。相比較于方法I和方法2，方法3隨著轉(zhuǎn)基因性狀的增加，可分離的轉(zhuǎn)基因座位不會增多，因此更受轉(zhuǎn)基因育種者的青睞。在方法4中，若轉(zhuǎn)基因性狀全部為新的的基因，則該方法較為理想。若舊的轉(zhuǎn)基因性狀已獲得監(jiān)管部門批準，再次將舊的轉(zhuǎn)基因性狀與新的轉(zhuǎn)基因性狀打包并轉(zhuǎn)化到基因組另外位置上，這雖然降低了可分離的轉(zhuǎn)基因座位，但是之前通過監(jiān)管部門認證的舊性狀很可能會需要再次接受監(jiān)管部門的重新審查。
[0004]將多個基因打包到同一個DNA載體上(體外基因疊加)有很多較為流行的方法:1，通過傳統(tǒng)的酶切鏈接完成。2，運用 sequence and ligat1n-1nd印endent cloning (SLIC)03，運用Gateway cloning。4，基于Cre-Λλ?重組系統(tǒng)的多基因疊加。
[0005]方法I會隨著需要操作的DNA片段的增多而難以找到可用的限制性內(nèi)切酶酶切位點，因此，不適合于多基因的體外疊加。方法2運用的同源重組和DNA單鏈退火技術(shù)。SLIC首先將含有5’同源序列的DNA用DNA外切酶處理，然后不同的DNA片段通過單鏈退火而形成一個帶有缺口的瞬時環(huán)形DNA。之后將帶有缺口的環(huán)形DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。大腸桿菌通過自身的DNA修復(fù)機制將瞬時環(huán)形DNA的缺口補平，從而完成鏈接。該方法可以一次鏈接多個DNA片段。方法3是基于λ位點特異性重組系統(tǒng)。λ位點特異性重組系統(tǒng)有兩個序列不同的重組位點aiiiS和且成。在λ整合酶(integrase)和整合宿主因子(integrat1n host factor)的作用下，和間發(fā)生重組，從而生成兩個子位點attL$\ attRo而aiiZ和aiiTi位點在λ整合酶、整合宿主因子和刪除酶(excis1nase)的作用下重組，形成attB和attP。而Gateway技術(shù)運用開發(fā)了來源于a?戰(zhàn)(? aii/的的突變位點:a?價和attPl, attB2$\ attP2。不同序號的位點之間不會發(fā)生重組反應(yīng)。因此一段被<3?價和a?故狹在中間的DNA可以通過attB I a?/重組轉(zhuǎn)移到含有aii/5/和attP2的載體上，同理，位于aiiZl和位于aiiZi之間的DNA可以通過attL x aiiT?重組反應(yīng)轉(zhuǎn)移到含有和的載體上。然而該方法受限于可用的突變的重組位點的數(shù)目。目前只研發(fā)出了 4對突變的重組位點。方法4運用了 Cre-hx位點特異性重組系統(tǒng)。其中Cre是重組酶，hx是它的識別位點。該體外基因疊加方法由一個含有1x位點的，基于可轉(zhuǎn)化人工染色體的雙元載體，和兩個含有1x位點的供給載體組成。因此位于供給載體內(nèi)的目的基因可通過Cre-1ox重組而共整合到雙元在體內(nèi)，之后不需要的DNA序列可以通過歸巢核酸內(nèi)切酶切除掉。因此兩種歸巢核酸內(nèi)切酶1-SceI和P1-SceI就可以滿足循環(huán)式體外基因置加。
[0006]如背景介紹第二段方法4所述，若體外疊加的基因全部為新基因，則將它們打包在一起轉(zhuǎn)化是一個可取的方案，并且第三段中提到的體外基因疊加方法均可實施。然而，若將含有已通過審查部門認定的舊基因與新基因一起重新體外疊加再轉(zhuǎn)化，則會增加額外的審查費用與時間。理想的方案為:若有舊的轉(zhuǎn)基因性狀，無需對其進行更多的修飾，只需將新的轉(zhuǎn)基因進行體外疊加，然后定點整合到舊基因座位上。這樣不僅舊轉(zhuǎn)基因性狀不需要再次經(jīng)過審查部門的認證，并且還可以降低可分離的轉(zhuǎn)基因座位。若無舊的轉(zhuǎn)基因性狀，則體外疊加的新基因可以直接通過傳統(tǒng)方法轉(zhuǎn)化到異源生物基因組中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種體外定點基因疊加系統(tǒng)。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于提供上述基因疊加系統(tǒng)的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種體外基因疊加系統(tǒng)，該系統(tǒng)含有3個載體，即載體A、B、C ;
所述載體A中含有2個不同的不可逆重組位點Al和A2，Al與A2之間為外源目的基因插入?yún)^(qū)域；不可逆重組位點Al的另一端連有可逆的重組位點A’ ；
所述載體B中含有3個不可逆重組位點B1、B2和B3，B2、B3之間為外源目的基因插入?yún)^(qū)域；B2的另一端連有BI，BI的另一端連有可逆的重組位點B’ ；
所述載體C中含有3個不可逆重組位點Cl、C2和C3，C2、C3之間為外源目的基因插入?yún)^(qū)域；C2的另一端連有Cl，Cl的另一端連有可逆的重組位點C’ ；
所述Al、C2和C3為相同的不可逆重組位點，將其堿基序列記為SEQ-1 ;
所述B2和B3為相同的不可逆重組位點，將其堿基序列記為SEQ-2 ;
所述A2、B1和Cl為相同的不可逆重組位點，將其堿基序列記為SEQ-3 ;
所述SEQ-1、SEQ-2、SEQ-3的序列均不相同；其中SEQ-1與SEQ-2之間能夠發(fā)生不可逆的位點特異性重組；
所述A’、B’和C’為相同的可逆重組位點，將其堿基序列記為SEQ-4，兩兩之間均能發(fā)生可逆的位點特異性重組；
當B3與Al位點發(fā)生不可逆的特異性重組時獲得載體AB，即可實現(xiàn)載體A和載體B中的外源目的基因的疊加；同時，載體AB中的可逆重組位點A’和B’能夠在對應(yīng)的重組酶的作用下發(fā)生重組，將位點A’和B’之間的堿基序列刪除，只留下一個可逆重組位點，所得到的載體記為AB-;
當載體AB-中的B2與載體C中的C3位點發(fā)生不可逆的特異性重組時獲得載體ABC，即可實現(xiàn)載體A、B、C中的外源目的基因的疊加；同時，載體ABC中的可逆重組位點和C’能夠在對應(yīng)的重組酶的作用下發(fā)生重組，將2個可逆重組位點間的堿基序列刪除，只留下一個可逆重組位點，所得到的載體記為ABC-;
再將載體ABC-與帶有另一目的基因的載體B進行重組，當載體ABC-的C2與載體B中的B3位點發(fā)生不可逆的特異性重組時，即可將這一目的基因再疊加進來；依次類推，若還需疊加其他目的基因，就交叉使用B、C載體攜帶目的基因，將攜帶目的基因B或C載體與重組后的載體再進行不可逆的位特異性重組，即可實現(xiàn)體外多基因的疊加。
[0010]進一步的，上述體外基因疊加系統(tǒng)還含有載體PZH36D，載體PZH36D為PZH36在體外重組酶Cre的催化作用下，使載體PZH36內(nèi)同向的1x位點間發(fā)生重組，刪除同向1x位點間的堿基序列，即可獲得載體PZH36D。
[0011]進一步的，上述位點A1、C2 和 C3 為 phiC31、TP901-l、λ ,BxbUphiBTl 或 TGl 不可逆重組系統(tǒng)中的其中一個重組位點，位點Β2和Β3則為能與A1、C2或C3產(chǎn)生不可逆重組的重組位點。
[0012]進一步的，上述位點A2、BI 和 Cl 為 phiC31、TP901-l、λ ,BxbUphiBTl 或 TGl 不可逆重組系統(tǒng)中的其中一個重組位點。
[0013]進一步的，根據(jù)位點Α2、Β1和Cl的具體重組位點，載體pZH36D中的Bxbl attP重組位點還可以換成能與A2、BI和Cl發(fā)生DNA整合的不可逆重組的重組位點。
[0014]進一步的，上述載體A中還含有篩選標記基因和復(fù)制起始位點。
[0015]進一步的，上述載體B、C中均還含篩選標記基因。
[0016]—種體外基因疊加系統(tǒng)的應(yīng)用，所用的系統(tǒng)為上述所述的體外基因疊加系統(tǒng)，具體應(yīng)用方法包括以下步驟:
1)將需要疊加的基因分別裝入載體A、B、C中的外源目的基因插入?yún)^(qū)域；
2)將帶有目的基因的載體A和B在對應(yīng)重組酶的作用下進行重組反應(yīng)，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細菌，篩選出位點B3與位點Al發(fā)生重組的產(chǎn)物載體AB，即實現(xiàn)了 2個基因的疊加；
3)將載體AB在對應(yīng)重組酶的作用下使可逆重組位點A’和B’發(fā)生切除重組，即將位點A’和B’間的堿基序列刪除，只留下一個可逆重組位點，所得產(chǎn)物載體記為AB-;
4)將載體AB-與帶有目的基因的C載體在對應(yīng)重組酶的作用下使下進行重組反應(yīng)，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細菌，篩選出位點B2與位點C3發(fā)生重組的產(chǎn)物載體ABC，即實現(xiàn)了 3個基因的疊加；
5)同步驟3)使載體ABC中的2個可逆重組位點發(fā)生切除重組，得產(chǎn)物載體ABC-；
6)根據(jù)所需疊加基因的數(shù)量，交叉循環(huán)利用載體B和C依次將每個基因疊加到載體ABC-中，操作方法同上述步驟2)?5);即可獲得含多個目的基因的載體；
7)將上步所得的多基因載體中所含目的基因轉(zhuǎn)入對應(yīng)宿主體內(nèi)。
[0017]進一步的，上述當步驟7)中所述的宿主為植物時，步驟7)的具體操作為:將體外疊加好的多基因載體轉(zhuǎn)移到適合于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的雙元載體中進行植物遺傳轉(zhuǎn)化，或