文中載體 pZH36D 應(yīng)用了質(zhì)粒ColEl的復(fù)制起始位點(diǎn)和來(lái)源于質(zhì)粒pVSl的復(fù)制起始位點(diǎn)分別在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中起始復(fù)制；下文中其余的載體包括分子A、B、C、D、E均用來(lái)源于質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起始位點(diǎn)起始復(fù)制。大腸桿菌 DH5 a {F endAl gin V44 thi~l recAl reIAl gyrA96 deoR nupG080dlacZA MJ5 Δ (lacZYA~argF)U169 hsdR17(rK %Λ』_)被應(yīng)用于重組分子的轉(zhuǎn)化及回收。
[0038])載體A的構(gòu)建載體A含有2個(gè)不同的不可逆重組位點(diǎn)Al和A2，Al與A2之間為外源目的基因插入?yún)^(qū)域；不可逆重組位點(diǎn)Al的另一端連有可逆的重組位點(diǎn)A’ ；載體A中還含有篩選標(biāo)記基因。在本實(shí)施例中不可逆重組位點(diǎn)Al為phiC31 a?/重組位點(diǎn)，不可逆重組位點(diǎn)A2為Bxbl組位點(diǎn)，可逆的重組位點(diǎn)A’為Cre 1x重組位點(diǎn)，篩選標(biāo)記基因?yàn)槁让顾乜剐曰蚝涂钩輨┗蛉鐁，插入的目的基因?yàn)槿鐖D1 (a)所述。
[0039]載體A的具體構(gòu)建過(guò)程如下所述:
來(lái)源于載體 pYWSP3 (Lili Hou, Yuan-Yeu Yau, Junjie Wei, Zhiguo Han, ZhichengDong, David ff.0w An Open-Source System for In Planta Gene Stacking by Bxbland Cre Recombinases.Molecular Plant, Dec 2014)的 phiC31 attP~lox DNA 片段由 PCR 擴(kuò)增得到，引物為 5’ -CCCA AGCTTAAATATGATATCTGGGCCCC-3’ (SEQ ID NO:1)和5’-AGCTTTGTTTAAACTCGGTG ATAACTTCGTATAATGTA-3，( SEQ ID N0:2)，并通過(guò)作￡? I 和Hind I I I限制性酶切位點(diǎn)插入到pC35ScreB (來(lái)自O(shè)w lab)中，從而獲得中間載體pDTOlo 嚴(yán)(CaMV 35S promoter)~gus~ nos 3， (nopaline synthase gene terminator)DNA 片段由 PCR 從 pCAMBIA1301 載體中擴(kuò)增得到，引物為 5’_CGAGCTCAGCCTGAATGGCGAATGCTAGA-3’ (SEQ ID NO:3)和 5，_CCCAAGCT TCTCTTAGGTTTACCCGCCAATAT-3，(SEQ ID NO:4)，并插入到PDTOl載體的歷III和I位點(diǎn)之間，獲得載體pDTC^dDTO〗中的戶55被從載體 pYWSP72( Yuan-Yeu Yau.Yueju Wang.James G.Thomson and David ff.0w Methodfor Bxbl-mediated site-specific integrat1n in planta.Methods Mol.B1l.2011)中通過(guò)PCR擴(kuò)增而得到的竹節(jié)花黃斑駁病毒(CommelinaYellowMottleVirus, CoYMV)啟動(dòng)子所取代，從而得到載體PDT03。Cai基因(氯霉素抗性基因)由PCR從載體pACY⑶uet_l(N0VAGEN)中擴(kuò)增得到并插入到載體 pYWJTSB2 (Yuan-Yeu Yau.Yueju Wang.James G.Thomson and David ff.0w Method for Bxbl-mediated site-specific integrat1n inplanta.Methods Mol.B1l.2011)白勺 I Pvu I 之間，得到載體 pCat。由 CaMV 35Stermiriator-bai^F^5S-F-gus-nos3f -phiC31所組成的 DNA 片段通過(guò) PCR 的方法從載體 PDT03 中擴(kuò)增得到，引物為 5’ - ATTTGCGGCCGCGACGCTT AGACAACTTAATAAC-3’ (SEQID N0:5)和 5’- GGACTAGTTCGGTGATAACTTCGTAT AATGTA-3’ (SEQ ID NO:6)，并插入到載體pCat的Abi I和分e I之間，得到載體pDT04。然后把一段人工合成的Bxbl attB序列(5，- CCCGGCTTGTCGACGACGGCGGTCTCC GTCGTCAGGATCATCC-3’ (SEQ ID NO:7))插入到載體PDT04的說(shuō)oR I位點(diǎn)上，從而得到pDT05。最后，位于載體pDT05 Pst I和Hind III之間的1x重組位點(diǎn)被一段人工合成的1x位點(diǎn)所取代(用以改變1x的方向，序列不變)，從而得到最終載體A。
[0040])載體B的構(gòu)建
載體B中含有3個(gè)不可逆重組位點(diǎn)B1、B2和B3，B2、B3之間為外源目的基因插入?yún)^(qū)域；B2的另一端連有BI，BI的另一端連有可逆的重組位點(diǎn)B’ ；載體B中還含有篩選標(biāo)記基因。在本實(shí)施例中不可逆重組位點(diǎn)BI為Bxbl ai拔重組位點(diǎn)；B2和B3均為phiC31 ai拔重組位點(diǎn)，二者同向；可逆的重組位點(diǎn)B’為Cre 1x重組位點(diǎn)，篩選標(biāo)記基因?yàn)榘逼S青霉素抗性基因辦/A插入的目的基因?yàn)閔c，如圖1 (a)所述。
[0041]載體B的具體構(gòu)建過(guò)程如下所述:
由ph1> I a ttB-loM.成的DNA片段通過(guò)PCR從載體pYWJTSB2中擴(kuò)增得到，引物為 5’ -CGAG CTCCGGGATCCATGGACCAGATGGGTGAGGTG-3，(SEQ ID NO:8)和 5’ -GGACTAGTAGTGTCGTGCTCCACCATGGT-3’ (SEQ ID NO:9)，并通過(guò) TA 連接插入到 pMD18 中，得到分子phiBB’ -lox-Τ。一段人工合成的Bxbl aiii?序列被插入到位于phiC31 和1x之間的 Sac II 位點(diǎn)之間得到分子 phiBB，-BxbIBB? -1ox-T0 分子 phiBB，-BxbIBB? -1ox-T 中的phiC31 attB-Bxbl attB-lox序列由Spe I和Sac I酶切得到，并連接到載體pYWJTSB2的骨架(骨架也用分e I和Sac I雙酶切)中，得到分子pDDOl。由phiC31 attB_Pd35S (CaMVpromoter with duplicated enhancer)-1uc (firefly luciferase)-ocs3> (octopinesynthase terminator)組成的DNA序列由PCR的方法獲得，并分兩部分克隆到pDDOl中得到分子 PDD03。第一部分由引物 5’- CG AGCTCGGGGTACCAAGCTTTCCATGGAAGACGC-3’ (SEQID NO:10)和 5，-CGGGATCCT GAATGGTGCCCGTAACTTT-3’ (SEQ ID NO: 11) PCR 擴(kuò)增得到，并通過(guò)SacI和BamHI位點(diǎn)克隆到pDDOl中，獲得載體pDD02。第二部分由引物5’-CGAGCGTGTCCTCTCCAAAT-3’ (SEQ ID NO: 12)和 5’- CGAGCTCCATCATGATGGACCAGATGG-3’(SEQ ID NO: 13)PCR擴(kuò)增得到，并通過(guò)SacI和HindII I位點(diǎn)克隆到pDDO中，獲得pDD03。
[0042]然而，測(cè)序發(fā)現(xiàn)在P35s上游多了一 phiC31 位點(diǎn)，因此該位點(diǎn)通過(guò)Abi I和Pac I雙酶切去掉并將粘性末端DNA用DNA聚合酶I大片段抹平，并進(jìn)行平末端鏈接，進(jìn)而得到分子PDD04。pDD04中的1x位點(diǎn)最后由一個(gè)人工合成的1x位點(diǎn)取代，用以改變其方向(序列不變)，最終得到分子B。
[0043])分子C的構(gòu)建
載體C中含有3個(gè)不可逆重組位點(diǎn)C1、C2和C3，C2、C3之間為外源目的基因插入?yún)^(qū)域；C2的另一端連有Cl，Cl的另一端連有可逆的重組位點(diǎn)C’ ；載體C中還含有篩選標(biāo)記基因。在本實(shí)施例中不可逆重組位點(diǎn)Cl為Bxbl組位點(diǎn)；C2和C3均為phiC31 重組位點(diǎn)，二者同向；可逆的重組位點(diǎn)C’為Cre 1x重組位點(diǎn)，篩選標(biāo)記基因?yàn)榘逼S青霉素抗性基因辦/A插入的目的基因?yàn)?7?如圖1 (a)所述。
[0044]載體C的具體構(gòu)建過(guò)程如下所述:
由ph1> I a t成的DNA片段通過(guò)PCR從載體pYWSP3中擴(kuò)增得到，引物為5’- CGAGCTCCCCGGAATTCAAATATGATATCTGGGCCCC-3’ (SEQ ID NO: 14)和 5’- GGACTAGTTCGGTGATAACTTCGTATAATGTA-3’ (SEQ ID NO:15)，并通過(guò) TA 連接插入到 pMD18 中，得到分子phiPP’-1ox-T ;再將一段人工合成的Bxbl 序列被插入到位于phiC31 attP$\ 1x之間的 Pst I 位點(diǎn)之間得到分子 phiPP’ -BxbIBB? -1ox-T0 分子 phiPP’ -BxbIBB? -1ox-T中的phiC31 attP-Bxbl attB-lox序列由Spe I和Sac I酶切得到，并連接到載體pYWJTSB2 的骨架中，得到分子 pDD05。由 j?AiC31 aii/^-sugarcane Bacilliform viruspromoter (,)-green fluorescent protein (gfp) -nos terminator 組成的 DNA 序列由PCR 的方法從載體 pYWSP3 上擴(kuò)增獲得，引物為 5’ - CGAGCTCCCCTTGTGTCATGTCGGCGAC-3’(SEQ ID N0:16)和 5’- CGGAATTCACCCATGAGAGCCCTGGTAGTC-3，(SEQ ID N0:17)，并連接到PDD05的Sac I和AcoR I中得到分子pDD06。pDD06中的Bxbl attB -1ox序列被一段人工合成的Bxbl-Asc1-1ox序列所取代，該過(guò)程目的為改變?cè)?x位點(diǎn)的方向，從而得到分子C。
[0045])載體D和E的構(gòu)建