一種分步酶解發(fā)病異育銀鯽制備不同分子量段抗氧化肽粉的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酶解制備抗氧化肽領(lǐng)域，特別涉及一種分步酶解發(fā)病異育銀鯽制備不同分子量段抗氧化肽粉的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自由基可以造成機(jī)體的多種損傷及病變，加速機(jī)體的衰老；抗氧化劑可以清除體內(nèi)多余的自由基，增加機(jī)體免疫力，延緩衰老，從而實(shí)現(xiàn)機(jī)體的自我保護(hù)。將蛋白質(zhì)通過酶解制備成抗氧化活性肽是目前食品及藥品科學(xué)界的研究熱點(diǎn)，抗氧化肽具有清除機(jī)體內(nèi)自由基，減輕機(jī)體所受氧化損傷及抗衰老的作用。國內(nèi)外的科學(xué)工作者以各種動(dòng)植物蛋白質(zhì)為原料，通過酶解法制備抗氧化肽多有報(bào)道。
[0003]然而另一方面，由于開發(fā)技術(shù)的局限和人為的忽略，導(dǎo)致我國有很多優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源沒有得到很好地綜合開發(fā)利用，而遭到浪費(fèi)，并造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。比如近年來由于鰓出血病的影響，江蘇沿海養(yǎng)殖的異育銀鯽出現(xiàn)大量的死亡，只2014年全年損失接近10億元人民幣，而死亡的魚富含豐富的蛋白質(zhì)資源，經(jīng)過特殊處理后，再經(jīng)過特定蛋白酶的酶解，可以制成抗氧化肽粉再生利用，并創(chuàng)造一定的經(jīng)濟(jì)效益。但沿海當(dāng)?shù)貙?duì)于鰓出血死亡的病魚多采取粗礦的處理方法，比如，掩埋或焚燒；這不僅造成蛋白質(zhì)資源的大量浪費(fèi)，而且造成環(huán)境的污染，影響當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種分步酶解發(fā)病異育銀鯽制備不同分子量段抗氧化肽粉的方法，該方法利用發(fā)病異育銀鯽制備具有高活性的抗氧化肽粉，不僅可以解決發(fā)病異育銀鯽蛋白質(zhì)資源浪費(fèi)及環(huán)境污染問題，而且可以變廢為寶減少養(yǎng)殖戶的損失，具有良好的應(yīng)用前景。
[0005]本發(fā)明的一種分步酶解發(fā)病異育銀鯽制備不同分子量段抗氧化肽粉的方法，包括:
[0006](I)將發(fā)病異育銀鯽去魚頭、魚鱗、魚皮及內(nèi)臟，并將剩余的魚身部分切段；將得到的魚段在室溫下于紫外燈下照射20-30min，以初步滅活病毒及細(xì)菌；
[0007](2)將初步滅活病毒及細(xì)菌的魚段按質(zhì)量體積比1:20?30置于正丁醇中，于4?8°C下不斷攪拌對(duì)魚段進(jìn)行脫脂24?32h，沖洗干凈，最后用純水浸泡；
[0008](3)按質(zhì)量體積比Ig: 3?5ml向魚段中加入水，調(diào)節(jié)pH至7.0?8.0，并按魚段質(zhì)量的I?2%加入風(fēng)味蛋白酶，加熱至40?60°C，在攪拌的條件下酶解l_2h ;隨后調(diào)節(jié)酶解液pH至6.5?7.0，并按魚段質(zhì)量的0.5?I %加入菠蘿蛋白酶，加熱至45?50°C，在攪拌的條件下酶解l_2h ;
[0009](4)酶解完畢后于沸水浴中煮15-20min滅活蛋白酶及進(jìn)一步滅活病毒和細(xì)菌，離心，收集上清液；
[0010](5)于冰水浴條件下向步驟⑷的上清液中緩慢加入研磨細(xì)碎的硫酸銨至飽和度為85?88%，攪拌待硫酸銨溶解完全后，置于4?6°C過夜鹽析；
[0011](6)鹽析后離心，收集沉淀，用磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，得到復(fù)溶液；按體積向復(fù)溶液中加入0.5?1%的活性炭，于35?40°C下攪拌脫腥，離心，收集上清液；
[0012](7)用截留分子量不同的超濾板于4?6°C下將步驟(5)的上清液分成#>10kDa、10kDa>#>5kDa、5kDa>#>3kDa和#>3kDa四段；將各段上清液于4?6°C透析脫鹽，旋蒸濃縮，最后冷凍干燥制得不同分子量段抗氧化肽粉。
[0013]所述步驟(I)中的魚身部分切成2-3cm段。
[0014]所述步驟(2)中的正丁醇濃度為10%。
[0015]所述步驟(2)中的脫脂每Sh更換一次液體。
[0016]所述步驟(4)中的離心具體為:于4°C 10000r/min條件下離心20min。
[0017]所述步驟(6)中的鹽析后離心具體為:于4°C 8000r/min條件下離心1min ;脫腥后離心具體為:于室溫5000r/min條件下離心1min。
[0018]所述步驟(6)中的磷酸鹽緩沖液pH7.0，含0.15M氯化鈉。
[0019]所述步驟(7)中的透析脫鹽每12h更換一次透析液。
[0020]所述步驟(7)中的旋蒸濃縮溫度為50°C。
[0021]本發(fā)明以發(fā)病異育銀鯽為原料，以DPPH自由基清除率為抗氧化活性評(píng)價(jià)指標(biāo)的不同分子量段抗氧化肽粉的制備。
[0022]有益效果
[0023]本發(fā)明利用發(fā)病異育銀鯽制備具有高活性的抗氧化肽粉，不僅可以解決發(fā)病異育銀鯽蛋白質(zhì)資源浪費(fèi)及環(huán)境污染問題，而且可以變廢為寶減少養(yǎng)殖戶的損失，具有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0024]圖1為實(shí)施例1的技術(shù)路線圖；
[0025]圖2為各酶酶解液的DPPH清除率；
[0026]圖3為不同硫酸銨的飽和度鹽析效果；
[0027]圖4為1.0mg/mL不同分子量段抗氧化肽粉的DPPH清除效果。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0029]實(shí)施例1
[0030](I)將10條發(fā)病異育銀鯽去魚頭、魚鱗、魚皮及內(nèi)臟，并將剩余的魚身部分切成2_3cm 段；
[0031](2)將切段的魚身在室溫(25°C左右)下于紫外燈下照射20min，以初步滅活病毒及細(xì)菌；
[0032](3)將初步滅活病毒及細(xì)菌的魚段按質(zhì)量體積比1:20置于10%正丁醇中，于4°C下不斷攪拌對(duì)魚段進(jìn)行脫脂24h，期間每Sh更換一次液體，再用自來水沖洗干凈，最后用純水浸泡一次；
[0033](4)按質(zhì)量體積比lg:3ml向魚段中加入水，調(diào)節(jié)pH至7.0 (酶解期間不斷調(diào)整，保證pH值在此范圍內(nèi))，并按魚段質(zhì)量的1%加入風(fēng)味蛋白酶，加熱至50°C，在攪拌的條件下酶解Ih ；
[0034](5)將(4)中酶解液調(diào)節(jié)pH至6.5 (酶解期間不斷調(diào)整，保證pH值在此范圍內(nèi))，并按魚段質(zhì)量的0.5%加入菠蘿蛋白酶，加熱至45°C，在攪拌的條件下酶解Ih ；
[0035](6)將酶解液置于沸水浴中15min，以滅酶及