一種專用于米曲霉液體發(fā)酵生產(chǎn)胞外酶制劑的復(fù)合蛋白胨制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食品酶發(fā)酵培養(yǎng)基制備技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種專用于米曲霉深層發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶和核酸酶的復(fù)合蛋白胨的制備方法。
技術(shù)背景
[0002]酶制劑是一類從動(dòng)物、植物、微生物中提取具有生物催化能力的蛋白質(zhì)。具有高的催化反應(yīng)性能、反應(yīng)專一性，在適宜條件下具有活性。其廣泛應(yīng)用于輕工、食品、化工、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、能源和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域。植物由于生長地域、季節(jié)、氣候等的影響，生產(chǎn)酶制劑的產(chǎn)量、質(zhì)量都不穩(wěn)定。動(dòng)物產(chǎn)生的酶主要從屠宰牲畜的腺體中提取，來源有限。只有微生物生產(chǎn)的酶，可滿足任何規(guī)模的需求，產(chǎn)率高、質(zhì)量穩(wěn)定。微生物酶制劑既可取代性能相同的動(dòng)、植物主要酶制劑種類，又能生產(chǎn)出在10°c起催化作用的酶制劑(如高溫-淀粉酶)和在PHlO?12起作用的洗滌劑(堿性蛋白酶等品種)。20世紀(jì)40年代，微生物酶制劑工業(yè)迅速發(fā)展起來。現(xiàn)在酶制劑的生產(chǎn)是以深層發(fā)酵為主，以半固體發(fā)酵為輔，菌株產(chǎn)酶的能力也有很大的提高，已經(jīng)展現(xiàn)了良好的商品應(yīng)用價(jià)值。近些年來，酶制劑市場(chǎng)增長迅速，以全球最大的酶制劑企業(yè)丹麥NOVO公司為例，1998年酶的銷售額為16億美元，2008年銷售額達(dá)30億美元，未來酶制劑市場(chǎng)增長潛力依舊強(qiáng)勁。
[0003]世界上已在工業(yè)上使用的酶種將近60余種，至今常用的品種主要為二十來種。據(jù)行業(yè)統(tǒng)計(jì)，我國生產(chǎn)的主要酶制劑品種有糖化酶、淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、植酸酶、木聚糖酶、果膠酶、飼用聚合酶、啤酒復(fù)合酶等九大酶系列，淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、植酸酶等少數(shù)品種約占我國酶制劑產(chǎn)品市場(chǎng)銷售額的90%以上。其中應(yīng)用在食品加工領(lǐng)域中的淀粉酶、蛋白酶，還包括核酸酶用到的工業(yè)生產(chǎn)的菌株為米曲霉。
[0004]米曲霉是美國食品與藥物管理局和美國飼料公司協(xié)會(huì)公布的安全微生物菌株之一，在食品工業(yè)生產(chǎn)中主要發(fā)酵生產(chǎn)胞外淀粉酶、胞外蛋白酶、胞外核酸酶，常用到的發(fā)酵氮源為動(dòng)物蛋白胨。菌株的產(chǎn)酶水平與相應(yīng)蛋白的表達(dá)量密切相關(guān)，因此酶的產(chǎn)量與蛋白胨的質(zhì)量密切相關(guān)。一方面，南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司一些客戶反應(yīng)，希望我公司專門針對(duì)米曲霉深層發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶和核酸酶開發(fā)一些質(zhì)量高和成本低的蛋白胨產(chǎn)品。另一方面，市場(chǎng)上蛋白胨產(chǎn)品尚無針對(duì)米曲霉發(fā)酵產(chǎn)胞外酶制劑品種開發(fā)專用蛋白胨，也無相關(guān)專利報(bào)道。為此，本發(fā)明公開一種米曲霉發(fā)酵生產(chǎn)胞外酶專用復(fù)合蛋白胨，它能保證在等同成本條件下，生產(chǎn)出具有較高酶產(chǎn)量的發(fā)酵液。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是提供一種制備應(yīng)用于米曲霉深層發(fā)酵生產(chǎn)胞外酶制劑的復(fù)合蛋白胨方法，并要求該蛋白胨相比于常用于該菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的蛋白胨在等同生產(chǎn)成本條件下使用，具有更高的產(chǎn)酶水平。
[0006]本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007](I)精選新鮮豬骨、豬內(nèi)臟、豬精肉。大豆經(jīng)篩選、低溫脫脂后，粉碎過100-200目篩。以上均作原料備用；
[0008](2)新鮮豬骨、豬內(nèi)臟、豬精肉占整個(gè)原料的重量比例范圍為豬骨25-35%，豬內(nèi)臟10-20%，豬精肉10-20%，配好的原料置于盆內(nèi)，用40-50°C水沖洗一遍，將原料用相應(yīng)機(jī)器進(jìn)行粉碎，骨頭面積不超過2cmX2cm，內(nèi)臟和精肉用絞肉機(jī)絞2_3次；
[0009](3)將骨、內(nèi)臟、精肉混合原料，按照質(zhì)量比1: 2-2.5的比例加入0.1 % -0.3%的NaOH溶液，浸泡12-18小時(shí)；
[0010](4)加入質(zhì)量比5-10倍的自來水浸泡和清洗堿處理后的豬原料，在動(dòng)物原料中加入I: 2-2.5比例的稀醋酸，浸泡1-4小時(shí)；
[0011](5)將醋酸處理后原料清洗兩遍。第一遍，加2-4倍質(zhì)量的水，用0.1 % -0.3%的NaOH調(diào)pH為7.0，水洗0.5-1小時(shí)。第二遍，加入2_4倍質(zhì)量的水，水洗0.5-1小時(shí)；
[0012](6)將制備好的豬原料和占整個(gè)原料質(zhì)量比例為25-55%的脫脂大豆粉，加入到高壓蒸汽爐內(nèi)，將壓力升至0.1Mpa-0.2Mpa，保持壓力平衡，溫度為150°C _180°C，抽提3_4小時(shí)，獲得抽提液；
[0013](7)將抽提液溫度冷卻并控制在45-55°C，用0.1 % -0.3的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH到9.0后，添加地衣芽孢桿菌2709產(chǎn)的堿性蛋白酶，進(jìn)行酶解1-3小時(shí)，當(dāng)pH降低到6.0-7.0時(shí)，升高溫度到60-70°C，添加木瓜酶進(jìn)行酶解2-4小時(shí)，降低溫度到40-50°C，調(diào)節(jié)pH到
7.0-8.0后，添加牛胰蛋白酶，進(jìn)行酶解1-3小時(shí)，最后再調(diào)節(jié)pH到7.0-8.0后，維持溫度在40-50°C，添加復(fù)合酶(由枯草桿菌1398酶產(chǎn)的中性蛋白酶和牛胰蛋白酶組成，總酶活單位比例為1: 3)，進(jìn)行酶解2-4小時(shí)；
[0014](8)酶解結(jié)束后，調(diào)pH值至6.0-6.5，在不斷攪拌下將料液升溫至75°C _85°C后，并煮開5-10分鐘，加入活性白陶土脫色，用量為原料中蛋白總量的1_2%，時(shí)間是1-1.5小時(shí)；
[0015](9)將酶解液經(jīng)板框過濾，獲得濾液，經(jīng)過0.3 μπι?0.5 μπι超濾膜過濾，以除去致病菌；
[0016](10)將澄清酶解液經(jīng)雙效蒸發(fā)器，在60°C -80°C減壓濃縮，獲得濃縮液；
[0017](11)將濃縮液經(jīng)噴霧塔中進(jìn)行噴霧干燥成粉狀，控制進(jìn)風(fēng)溫度160°C _175°C，出風(fēng)溫度85 °C -95 °C，得到產(chǎn)品。
[0018]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):一、本發(fā)明以豬和大豆為原料，來源豐富，進(jìn)行混合保證原料更加均衡的營養(yǎng)，另外大豆來制備的蛋白胨較等質(zhì)量的動(dòng)物源蛋白胨成本要低50%，綜合導(dǎo)致復(fù)合蛋白胨成本大大較低；二是本工藝豬原料先經(jīng)過酸、堿水解。豬原料和脫脂大豆粉，經(jīng)單酶水解后，再利用復(fù)合酶進(jìn)行水解。較常用工藝僅經(jīng)過一次酶水解不同，豬原料和脫脂大豆粉水解更為徹底，有利于提高蛋白胨的品質(zhì)和得率；三、經(jīng)公司在10噸規(guī)模發(fā)酵罐試驗(yàn)驗(yàn)證，本工藝所生產(chǎn)的復(fù)合蛋白胨相對(duì)于常用蛋白胨，在相等成本條件下，每毫升發(fā)酵液分別具有更高淀粉酶活力、蛋白酶活力和核酸酶活力。
【具體實(shí)施方式】
[0019]實(shí)例I
[0020]精選新鮮豬骨、豬內(nèi)臟、豬精肉。大豆經(jīng)篩選、低溫脫脂后，粉碎過100目篩。以上均作原料備用。新鮮豬骨、豬內(nèi)臟、豬精肉各重量比例占整個(gè)原料的重量為豬骨25%，豬內(nèi)臟10%，豬精肉10%，配好的原料置于盆內(nèi)，用40°C水沖洗一遍，將原料用相應(yīng)機(jī)器進(jìn)行粉碎，骨頭面積不超過2cmX2cm，內(nèi)臟和精肉用絞肉機(jī)絞2次。將骨、內(nèi)臟、精肉混合原料，按照質(zhì)量比1: 2的比例加入0.1 %的NaOH溶液，浸泡12小時(shí)。加入質(zhì)量比5倍的自來水浸泡，并清洗堿處理后的豬原料，在動(dòng)物原料中加入重量比1: 2比例的稀醋酸，浸泡I小時(shí)。將醋酸處理后的清洗兩遍。第一遍，加2倍質(zhì)量的水，用0.1 % NaOH調(diào)pH為7.0，水洗0.5小時(shí)。第二遍，加入2倍質(zhì)量的水，水洗0.5小時(shí)。將制備好的豬原料和占整個(gè)原料比例為55 %的脫脂大豆粉加入到高壓蒸汽爐內(nèi)，將壓力升至0.1Mpa,保持壓力平衡，溫度為1500C，抽提3小時(shí)，獲得抽提液。將抽提液溫度冷卻并控制在45°C，用0.1 %的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH到9.0后，添加地衣芽孢桿菌2709產(chǎn)堿性蛋白酶，進(jìn)行酶解I小時(shí)，當(dāng)pH降低到6.0時(shí)，升高溫度到60°C，添加木瓜酶，進(jìn)行酶解2小時(shí)，降低溫度到40°C，調(diào)節(jié)pH到7.0后，添加牛胰蛋白酶，進(jìn)行酶解I小時(shí)，最后再調(diào)節(jié)PH到7.0后，溫度維持在40°C，添加復(fù)合酶(由枯草桿菌1398產(chǎn)的中性蛋白酶和牛胰蛋白酶組成，總酶活單位比例為1: 3)，進(jìn)行酶解2小時(shí)。酶解結(jié)束后，調(diào)PH值至6.0，在不斷攪拌下將料液升溫至75°C后，并煮開5分鐘，加入活性白陶土脫色，用量為原料中蛋白總量的1%，時(shí)間是I小時(shí)。將酶解液經(jīng)板框過濾，獲得濾液，經(jīng)過0.3 μπι超濾膜過濾，以除去致病菌。將澄清酶解液經(jīng)雙效蒸發(fā)器，在60°C減壓濃縮，獲得濃縮液。將濃縮液經(jīng)噴霧塔中進(jìn)行噴霧干燥成粉狀，控制進(jìn)風(fēng)溫度160°C，出風(fēng)溫度85 °C，得到產(chǎn)品。
[0021]在10噸發(fā)酵罐生產(chǎn)條件下，分別用等同成本的該復(fù)合蛋白胨替代常用蛋白胨發(fā)酵米曲霉產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶和核酸酶(常規(guī)蛋白胨發(fā)酵所獲得酶活力21.2U/mL發(fā)酵液、2432.6U/mL發(fā)酵液、832.5U/mL發(fā)酵液)，分別所獲得酶活力為35.7U/mL發(fā)酵液、4107.8U/mL 發(fā)酵液、1905.9U/mL 發(fā)酵液，綜合提高了 68.4% ,68.9% ,128.9% 0
[0022]實(shí)例2
[0023]精選新鮮豬骨、豬內(nèi)臟、豬精肉。大豆經(jīng)篩選、低溫脫脂