基于宏基因組學(xué)的病毒感染檢測(cè)及鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及病毒的檢測(cè)與鑒定，具體涉及一種基于宏基因組學(xué)和高通量測(cè)序的病 毒檢測(cè)鑒定技術(shù)。
【背景技術(shù)】：
[0002] 隨著人類經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的不斷發(fā)展，人類的活動(dòng)范圍越來越大，與野生動(dòng)物的接觸 越來越密切、越來越頻繁，野生動(dòng)物攜帶的病毒直接或通過媒介如蚊子、蜱等傳致人的風(fēng)險(xiǎn) 越來越大，構(gòu)成了人類新發(fā)傳染病的70%左右。這些新發(fā)傳染病如2003年中國發(fā)生的非 典、2007 -2010年中國發(fā)生的新布尼亞病毒導(dǎo)致的疫情、2014年在西非肆虐的埃博拉疫情、 2015年由中東傳致韓國的MERS，給病毒感染的檢測(cè)鑒定技術(shù)提出了極大的挑戰(zhàn)。由于這 些新發(fā)傳染病的病原體往往是未知病原，與已知病原的同源性很低，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法如基 于已知病毒核酸序列建立的PCR技術(shù)、基于已知病毒組分建立的血清學(xué)技術(shù)等通常都會(huì)失 靈。這給新發(fā)傳染病的及時(shí)防控帶來了極大的負(fù)面影響。
[0003] 基于PCR或者血清學(xué)的技術(shù)都需要預(yù)先已知病毒的信息，或者是核酸序列，或者 是病毒的關(guān)鍵組分，這些技術(shù)特點(diǎn)嚴(yán)重限制了它們?cè)谛掳l(fā)傳染病病原體檢測(cè)上的應(yīng)用。另 外一項(xiàng)有希望用于新發(fā)傳染病病原體檢測(cè)的技術(shù)是在特點(diǎn)的培養(yǎng)基或細(xì)胞上對(duì)病原體進(jìn) 行培養(yǎng)，然后提取核酸進(jìn)行基因組測(cè)序。但是這一技術(shù)因?yàn)槿齻€(gè)缺點(diǎn)其應(yīng)用受到嚴(yán)重限制。 首先，培養(yǎng)基或細(xì)胞類型的選擇是個(gè)難題。由于對(duì)新發(fā)傳染病病原體的認(rèn)識(shí)非常有限甚至 是空白，所以應(yīng)用這一技術(shù)進(jìn)行新發(fā)傳染病病原體的檢測(cè)幾乎完全是靠運(yùn)氣。選對(duì)了培養(yǎng) 基或細(xì)胞類型，可以得到正確的檢測(cè)結(jié)果。選錯(cuò)了培養(yǎng)基或細(xì)胞類型就會(huì)得到陰性結(jié)果。這 一選擇難題嚴(yán)重影響了這一檢測(cè)方法的靈敏度。其次，活的病原體的培養(yǎng)對(duì)生物安全防護(hù) 水平提出了很高的要求。例如，2003年非典是由SARS冠狀病毒導(dǎo)致的，需要達(dá)到生物安全 三級(jí)（P3)防護(hù)水平才能開展病毒培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。2014年西非的埃博拉病毒需要生物安全四級(jí) (P4)的防護(hù)水平。而具備這些生物安全防護(hù)水平的實(shí)驗(yàn)室非常有限，嚴(yán)重限制了這一技術(shù) 的廣泛應(yīng)用。第三，從培養(yǎng)到提取核酸再到基因組測(cè)序整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程耗時(shí)長，不能滿足傳 染病防控的需求。
[0004] 鑒于上述檢測(cè)技術(shù)的局限性，發(fā)明新的快速、靈敏、準(zhǔn)確、方便的病原體檢測(cè)技術(shù) 勢(shì)在必行。針對(duì)傳染病防控的這一特殊需求，我們發(fā)明了一套基于宏基因組學(xué)的病毒檢測(cè) 鑒定技術(shù)體系。該體系不需要培養(yǎng)病原體，對(duì)生物安全防護(hù)水平要求低，不限于特定的病 毒種類，可適用于所有已知的和未知遠(yuǎn)緣的病毒的檢測(cè)，不限于單一病毒的檢測(cè)，也可用于 病毒混合感染的檢測(cè)，對(duì)樣本的需求量低，檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)靈敏，結(jié)果可靠，給出的信息全 面。盡管這套技術(shù)體系針對(duì)傳染病的防控而發(fā)明，但其應(yīng)用不限于傳染病的防控，可以進(jìn)一 步拓展到其他方面如臨床樣本的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)分析、動(dòng)植物樣本的微生物組成分析等等。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于宏基因組學(xué)的病毒檢測(cè)方法。
[0006] 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，包括樣本制備、高通量測(cè)序、生物信息學(xué)分析、結(jié)果復(fù)核 等四個(gè)步驟。
[0007] 具體的，本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0008] (1)樣本制備：基于微量、痕量待檢測(cè)樣本富集、提取病毒核酸構(gòu)建可用于高通量 測(cè)序的核酸庫；
[0009] (2)高通量測(cè)序：設(shè)定輔助基于宏基因組學(xué)技術(shù)的病毒感染檢測(cè)的內(nèi)參、對(duì)照；
[0010] (3)生物信息學(xué)分析：本系統(tǒng)的主體部分，從高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中準(zhǔn)確分析樣本中 的物種組成，包括遠(yuǎn)緣未知的病毒組成。
[0011] (4)結(jié)果復(fù)核：綜合多方面信息，對(duì)生物信息學(xué)分析結(jié)果就行遴選、復(fù)核。
[0012] 一.樣本制備
[0013]其中，步驟（1)所述樣本制備：針對(duì)微量（彡1ml)、痕量（彡lul)待檢測(cè)樣本，本 發(fā)明采用了一套訂制的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR，PolymeraseChainReaction)擴(kuò)增技術(shù)制備高 通量測(cè)序所需的核酸文庫。
[0014] 具體地，步驟（1)所述樣本制備部分包括以下八個(gè)步驟：病毒滅活、樣本定量、病 毒純化、背景消除、提取核酸、合成互補(bǔ)DNA(cDNA，complementaryDNA)、等比例擴(kuò)增、核酸 純化。
[0015] 第一步，病毒滅活：樣本要根據(jù)疑似病毒的種類和樣本的特點(diǎn)采取通用的或特異 的病毒滅活方法進(jìn)行滅活。這一步不僅充分保障了實(shí)驗(yàn)人員的人身安全，而且簡便有效地 降低了病毒檢測(cè)任務(wù)對(duì)生物安全防護(hù)水平的要求，同時(shí)也充分保留了病毒的遺傳信息。
[0016] 第二步，樣本定量：對(duì)樣本總量、樣本所含病毒載量、病毒核酸量進(jìn)行初步測(cè)定和 估計(jì)，從而為后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟制定詳細(xì)計(jì)劃。
[0017] 第三步，病毒純化：通過超速離心將病毒顆粒進(jìn)行富集純化，從而提高病毒序列在 最后結(jié)果中所占的比例。
[0018] 第四步，背景消除：在提取病毒核酸前將宿主的DNA和RNA利用DNA酶和RNA酶進(jìn) 行充分消化。
[0019] 第五步，提取核酸：提取病毒核酸，主要提取病毒的核糖核酸。
[0020] 第六步，合成CDNA:將第五步提取出來的病毒核糖核酸轉(zhuǎn)化成更穩(wěn)定更易保存的 cDNA〇
[0021] 第七步，等比例擴(kuò)增：基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)將第六步獲得的cDNA進(jìn)行用隨機(jī) 引物進(jìn)行擴(kuò)增，直到滿足下一步高通量測(cè)序所要求的上樣量。這一步是可選步驟。如果第 六步獲得的cDNA量足夠進(jìn)行高通量測(cè)序，則直接進(jìn)入高通量測(cè)序環(huán)節(jié)。
[0022] 第八步，核酸純化：純化第六步或第七步獲得的病毒核酸用于后續(xù)的高通量測(cè)序。
[0023] 二.高通量測(cè)序
[0024] 其中，步驟2所述高通量測(cè)序：根據(jù)病毒檢測(cè)的需求，人工合成序列已知、數(shù)量已 知的核酸序列作為樣本核酸庫的內(nèi)參；對(duì)序列已知并與樣本檢測(cè)平行進(jìn)行的對(duì)照核酸庫進(jìn) 行測(cè)序。
[0025] 具體地，步驟（2)所述高通量測(cè)序包括三個(gè)步驟：構(gòu)建高通量測(cè)序文庫、高通量測(cè) 序、將圖像測(cè)序信號(hào)轉(zhuǎn)換為核酸序列信息。為提高基于高通量測(cè)序的病毒檢測(cè)技術(shù)的準(zhǔn)確 性，我們?cè)诟咄繙y(cè)序文庫構(gòu)建這一步增加了我們?cè)O(shè)計(jì)的內(nèi)參樣本，以衡量病毒核酸在樣 本中的豐度；與樣本測(cè)序平行，我們?cè)黾恿藢?duì)照樣本同時(shí)進(jìn)行高通量測(cè)序，以評(píng)價(jià)整個(gè)檢測(cè) 系統(tǒng)的平穩(wěn)運(yùn)行，同時(shí)為最后結(jié)果復(fù)核部分提供重要的背景信息。
[0026] 三?生物信息學(xué)分析
[0027] 其中，步驟3所述生物信息學(xué)分析包括以下8個(gè)單元：
[0028] 病原數(shù)據(jù)庫構(gòu)建系統(tǒng)：從公共生物信息數(shù)據(jù)庫中下載并整理病原體（包括病毒但 不限于病毒）和宿主相關(guān)的核酸、蛋白質(zhì)的序列信息、結(jié)構(gòu)信息、進(jìn)化信息；
[0029] 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制系統(tǒng)：對(duì)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，包括剔除不合 格序列、剪切不合格序列、修正不合格序列等部分；
[0030] 宿主序列去除系統(tǒng)：將高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中與宿主基因組、轉(zhuǎn)錄組高度同源的序列 去除；
[0031] 宏基因組學(xué)拼接系統(tǒng)：將短的、多的高通量測(cè)序序列拼接成長的、少的疊連群 (Contig)序列，特別是將短肽拼接為長的蛋白質(zhì)序列進(jìn)而進(jìn)行病毒檢測(cè)是本發(fā)明的一大特 色；
[0032] 序列比對(duì)搜索系統(tǒng)：將高通量測(cè)序序列或疊連群（Contig)序列與病原數(shù)據(jù)庫進(jìn) 行比對(duì)搜索，找出與查詢序列相似或高度同源的數(shù)據(jù)庫條目；
[0033] 物種信息映射系統(tǒng)：根據(jù)序列比對(duì)搜索結(jié)果確定查詢序列的物種來源；
[0034] 物種組成分析系統(tǒng)：根據(jù)物種信息映射的結(jié)果分析樣本中的物種組成；
[0035] 多樣本物種組成高級(jí)分析系統(tǒng)：對(duì)多個(gè)樣本的物種組成進(jìn)行高級(jí)分析如比較相似 性、尋找共同物種組成、尋找差異物種組成、尋找生物標(biāo)記物等。
[0036] 具體地，步驟（3)所述生物信息學(xué)分析包括病原數(shù)據(jù)庫構(gòu)建系統(tǒng)、高通量測(cè)序數(shù) 據(jù)質(zhì)量控制系統(tǒng)、宿主序列去除系統(tǒng)、宏基因組學(xué)拼接系統(tǒng)、序列比對(duì)搜索系統(tǒng)、物種信息 映射系統(tǒng)、物種組成分析系統(tǒng)、多樣本物種組成高級(jí)分析系統(tǒng)共8個(gè)單元組成。這8個(gè)功能 單元各司其職共同構(gòu)成了整個(gè)生物信息學(xué)分析流程。
[0037] 第一，病原數(shù)據(jù)庫構(gòu)建系統(tǒng)從公共生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫中提取病原體（不限于病 毒）和宿主的序列信息、結(jié)構(gòu)信息、進(jìn)化信息，然后將這些信息按照信息種類、物種類別整 理成多個(gè)宿主數(shù)據(jù)庫、病原體數(shù)據(jù)庫和不同組合的綜合庫，以供后續(xù)序列比對(duì)搜索系統(tǒng)使 用。目前參考的公共生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫包括美國生物技術(shù)信息中心NCBI(http://WWW. ncbi.nlm.nih.gov/)、歐洲生物信息學(xué)研究院EBI(http://www.ebi.ac.uk/)、歐洲的基 因組注釋數(shù)據(jù)庫ENSEMBL(http://www.ensembl.org/index.html)、歐洲的蛋白質(zhì)總庫 UNIPROT(http://www.uniprot.org/)、蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫PFAM(http://pfam.xfam.org/)、 RNA家族數(shù)據(jù)庫RFAM(http: //rfam.xfam.org/)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫](http: //www. rcsb.org/pdb