一種人體微生物定性與定量的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種人體微生物定性與定量的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人體微生物是人體疾病診斷的重要依據(jù)，人體微生物精確地定性與定量檢測(cè)是十 分必要的。
[0003] 現(xiàn)有人體微生物定性與定量檢測(cè)技術(shù)包括形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)、忍片檢測(cè)、16S rRNA測(cè)序、 宏基因組測(cè)序和實(shí)時(shí)定量PCR^olymerase化ain Reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）。形態(tài)學(xué)計(jì) 數(shù)檢測(cè)需要對(duì)微生物進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，耗時(shí)長(zhǎng)，不可培養(yǎng)微生物不可檢測(cè)，一次僅能夠檢測(cè)一種 微生物，通量低，在計(jì)數(shù)時(shí)抽樣量有限，且結(jié)果粗糖，無法對(duì)種W下的分類單元進(jìn)行區(qū)分。忍 片檢測(cè)所需的待測(cè)樣品的DNA量大，需要對(duì)微生物進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)及富集處理，檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn) 確，且無法做定量檢測(cè)。16S rRNA測(cè)序無法對(duì)種W下的分類單元進(jìn)行區(qū)分。宏基因組測(cè)序深 度有限，對(duì)于低含量的微生物的定量檢測(cè)準(zhǔn)確度很差。實(shí)時(shí)定量PCR-次只能檢測(cè)一種微生 物，通量低。另外，已有方法共有缺陷是，無法計(jì)算微生物定性與定量的可靠性，使得結(jié)論實(shí) 用性差。W上技術(shù)缺陷導(dǎo)致了人體疾病診斷不及時(shí)、診斷不精確W及誤診等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中微生物定性與定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的問題，本發(fā)明實(shí)施例提供了 一種人體微生物定性與定量的檢測(cè)方法。所述技術(shù)方案如下：
[0005] 本發(fā)明實(shí)施例提供了一種人體微生物定性與定量的檢測(cè)方法，所述方法包括：
[0006] 確定待測(cè)樣品中的目標(biāo)微生物類群、目標(biāo)微生物和非目標(biāo)生物、W及不存在于所 述待測(cè)樣品中的參考微生物，所述待測(cè)樣品為人體組織、體液和排泄物；
[0007] 根據(jù)所述目標(biāo)微生物類群、所述目標(biāo)微生物、所述參考微生物和所述非目標(biāo)生物 的參考基因組序列，獲得所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域、所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域和 所述參考微生物的特征區(qū)域；
[000引制備擴(kuò)增所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的第一多重?cái)U(kuò)增引物、擴(kuò)增所述目標(biāo)微 生物的特征區(qū)域的第二多重?cái)U(kuò)增引物和擴(kuò)增所述參考微生物的特征區(qū)域的第Ξ多重?cái)U(kuò)增 引物，將所述第一多重?cái)U(kuò)增引物、所述第二多重?cái)U(kuò)增引物和所述第Ξ多重?cái)U(kuò)增引物混合得 到混合多重?cái)U(kuò)增引物；
[0009] 向所述待測(cè)樣品中加入所述參考微生物，獲得混合樣品；
[0010] 提取所述混合樣品的核酸；
[0011] 利用所述混合多重?cái)U(kuò)增引物和所述混合樣品的核酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，獲得擴(kuò)增產(chǎn) 物；
[0012] 利用所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得高通量測(cè)序片段；
[0013] 根據(jù)所述高通量測(cè)序片段，對(duì)所述目標(biāo)微生物類群和所述目標(biāo)微生物進(jìn)行定性和 定量分析。
[0014] 具體地，所述目標(biāo)微生物類群的數(shù)目含1個(gè)，且每個(gè)所述目標(biāo)微生物類群包括> 0 種所述目標(biāo)微生物；
[0015] 所述目標(biāo)微生物為細(xì)菌、病毒、真菌、放線菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體和 原生動(dòng)物中的至少一種；
[0016] 所述參考微生物為細(xì)菌、病毒、真菌、放線菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體和 原生動(dòng)物中的至少一種。
[0017] 具體地，所述確定待測(cè)樣品中的非目標(biāo)生物的方法包括:將所述非目標(biāo)生物確定 為除所述目標(biāo)微生物類群之外的所有生物，若能獲得所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域，貝U 所述非目標(biāo)生物指除所述目標(biāo)微生物類群之外的所有生物;若不能獲得所述目標(biāo)微生物類 群的特征區(qū)域，則所述非目標(biāo)生物指所述混合樣品中，除所述目標(biāo)微生物類群之外的其它 生物。
[0018] 具體地，所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域?yàn)樗瞿繕?biāo)微生物類群內(nèi)的微生物的參 考基因組上的核酸序列;所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的兩側(cè)的序列在所述參考基因組 中為單一序列;所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的兩側(cè)的序列在所述目標(biāo)微生物類群內(nèi)不 同微生物間保守;所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的區(qū)分度> 3;
[0019] 所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域與所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域同源;所述目標(biāo)微 生物的特征區(qū)域的m2值含2，其中，m2值為所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域與所述目標(biāo)微生物類 群內(nèi)除所述目標(biāo)微生物外的其它所述微生物間的差異堿基數(shù)的最小值；
[0020] 所述參考微生物的特征區(qū)域?yàn)樗鰠⒖嘉⑸锏膮⒖蓟蚪M上的核酸序列;所述 參考微生物的特征區(qū)域的兩側(cè)的序列在所述參考微生物的參考基因組中為單一序列;所述 參考微生物的特征區(qū)域的兩側(cè)的序列在除所述參考微生物外的其它生物中不具有同源性。
[0021] 進(jìn)一步地，所述區(qū)分度是指由同一所述混合多重?cái)U(kuò)增引物擴(kuò)增的任一所述目標(biāo)微 生物類群的特征區(qū)域與任一非特征區(qū)域間的差異堿基數(shù)的最小值，其中，所述非特征區(qū)域 是所述混合多重?cái)U(kuò)增引物W所述混合樣品的核酸為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物，且所述非特征區(qū)域不 為所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域，若無所述非特征區(qū)域，則所述區(qū)分度= 3XLl/4,其中， L1為所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的核酸序列長(zhǎng)度。
[0022] 具體地，在提取所述混合樣品的核酸時(shí)，若所述待測(cè)樣品中核酸的含量過低，則在 提取所述混合樣品的核酸的過程中，加入所述混合多重?cái)U(kuò)增引物不能擴(kuò)增的外源核酸。
[0023] 具體地，所述目標(biāo)微生物類群和所述目標(biāo)微生物的定性分析方法如下：
[0024] 將所述高通量測(cè)序片段與每種所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域進(jìn)行比對(duì)，當(dāng)差異 堿基數(shù)含nl時(shí)，則比對(duì)成功，相應(yīng)的所述高通量測(cè)序片段為所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū) 域，其中，nl為所述目標(biāo)微生物類群的特征測(cè)序片段的最大容錯(cuò)堿基數(shù);若比對(duì)成功的所述 目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域含1種時(shí)，則判斷所述高通量測(cè)序片段為所述目標(biāo)微生物類群 的特征測(cè)序片段；
[0025] 將所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域與每種同源的所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域進(jìn) 行比對(duì)，在所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域中提取差異堿基組成所述目標(biāo)微生物的標(biāo)準(zhǔn)基因 型;在所述目標(biāo)微生物類群的特征測(cè)序片段上，提取所述目標(biāo)微生物的標(biāo)準(zhǔn)基因型所對(duì)應(yīng) 的堿基，組成所述目標(biāo)微生物的測(cè)試基因型；若所述目標(biāo)微生物的測(cè)試基因型與所述目標(biāo) 微生物的標(biāo)準(zhǔn)基因型的差異堿基數(shù)含n2,其中，n2為所述目標(biāo)微生物的特征測(cè)序片段的最 大容錯(cuò)堿基數(shù)，則所述目標(biāo)微生物的測(cè)試基因型所在的所述高通量測(cè)序片段為所述目標(biāo)微 生物的特征測(cè)序片段；
[0026] 將所述參考微生物作為僅包含一個(gè)所述目標(biāo)微生物的所述目標(biāo)微生物類群，計(jì)算 獲得的所述目標(biāo)微生物的特征測(cè)序片段，即為所述參考微生物的特征測(cè)序片段；
[0027] 若所述目標(biāo)微生物類群的特征測(cè)序片段存在的概率P5含巧，則判斷所述待測(cè)樣品 中存在所述目標(biāo)微生物類群，其中，α5為概率保障;若所述目標(biāo)微生物類群的特征測(cè)序片段 存在的概率Ρ5<α5，則判斷所述待測(cè)樣品中不存在所述目標(biāo)微生物類群；
[0028] 若所述目標(biāo)微生物的特征測(cè)序片段存在的概率Ρ6 > α6，則判斷所述待測(cè)樣品中存 在所述目標(biāo)微生物，其中，06為概率保障;若所述目標(biāo)微生物的特征測(cè)序片段存在的概率Ρ6 如6，則判斷所述待測(cè)樣品中不存在所述目標(biāo)微生物；
[0029] nl使得Ρ1含α1且Ρ3含α3,其中，Ρ1為一條不是所述目標(biāo)微生物類群的特征測(cè)序片 段的所述高通量測(cè)序片段被誤判為所述目標(biāo)微生物類群的特征測(cè)序片段而產(chǎn)生的假陽性 的概率;Ρ3為一條所述目標(biāo)微生物類群的特征測(cè)序片段被誤判為不是所述目標(biāo)微生物類群 的特征測(cè)序片段而產(chǎn)生的假陰性的概率;α1和03為判斷闊值；
[0030] η2使得Ρ2如2且Ρ4如4,其中，Ρ2為一條不是所述目標(biāo)微生物的特征測(cè)序片段的 所述高通量測(cè)序片段被誤判為所述目標(biāo)微生物的特征測(cè)序片段而產(chǎn)生的假陽性的概率;Ρ4 為一條所述目標(biāo)微生物的特征測(cè)序片段被誤判為不是所述目標(biāo)微生物的特征測(cè)序片段而 產(chǎn)生的假陰性的概率;02和α4為判斷闊值；
[0031] P5 = 1-BIN0M.DIST(S1，S1，P1，F(xiàn)ALW)，P6 = 1-BIN0M.DIST(S3，S3，P2，F(xiàn)ALSE)，S1 為所有的所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的所述目標(biāo)微生物類群的特征測(cè)序片段的數(shù)量 的中位數(shù);S3為所有的所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域的所述目標(biāo)微生物的特征測(cè)序片段的數(shù) 量的中位數(shù)，F(xiàn)ALSE為參數(shù)值;BIN0M. DIST函數(shù)返回一元二項(xiàng)式分布的概率。
[0032] 進(jìn)一步地，所述目標(biāo)微生物類群和所述目標(biāo)微生物的定量分析方法如下：
[0033] 所述目標(biāo)微生物類群的量Ml =Mr X S1/S2，所述目標(biāo)微生物類群的量的置信區(qū)間 為[Ml 1，M12]，其中，Mr為加入所述待測(cè)樣品中的所述參考微生物的量;S2為所有的所述參 考微生物的特征區(qū)域的所述參考微生物的特征測(cè)序片段的數(shù)量的中位數(shù);Mil和M12分別為 Ml值的置信區(qū)間的下限與上限；
[0034] 所述目標(biāo)微生物的量M2 = M1XS3パ1，所述目標(biāo)微生物的量的置信區(qū)間為[M21， M22]，M21和M22分別為M2值的置信區(qū)間的下限與上限；
[0035] Ml 1 =M1 X (1-S4/S1) ,M12=M1 X (1+S5/S1) ,M21 =M2 X (1-S6/S3) ,M22=M2 X (1+ S7/S3);其中，S4為假陽性的所述目標(biāo)微生物類群的特征測(cè)序片段的數(shù)量且S4 = CRITBIN0M (115，口1，〇9)，其中，115為計(jì)算51的所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的所述多重?cái)U(kuò)增引物所 擴(kuò)增的所述非特征區(qū)域的所述高通量測(cè)序片段的數(shù)量;S5為假陰性的所述目標(biāo)微生物類群 的特征測(cè)序片段的數(shù)量且S5 = CRITBIN0M(Sl，P3，a9)，其中，α9為概率保障；S6為假陽性的 所述目標(biāo)微生物的特征測(cè)序片段的數(shù)量且S6 = CRITBINOM(Sl，P2，al〇)，S7為假陰性的所述 目標(biāo)微生物的特征測(cè)序片段的數(shù)量且57 = 〇?口81側(cè)1(53，？4,〇10)，其中，〇10為概率保障； CR 口 BIN0M函數(shù)返回使累積二項(xiàng)式分布大于等于臨界值的最小值。
[0036] 進(jìn)一步地，Pl = BIN0M.DIST(nl，ml，l-E，?UE)，P2 = BIN0M.DIST(n2，m2，l-E, T 抓 E)，P3 = l-BIN0M.DIST(nl，Ll，E，TR肥），P4=l-BIN0M.DIST(n2，L2，E，TR肥），其中，ml為 所述區(qū)分度;所述m2為所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域與所述目標(biāo)微生物類群的其它所述微生 物間差異堿基的最小值;L1為所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的長(zhǎng)度;L2為所述目標(biāo)微生 物的標(biāo)準(zhǔn)基因型的長(zhǎng)度;E為堿基錯(cuò)誤率。
[0037] 本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是:本發(fā)明提供的方法不需要對(duì)微 生物進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)與增殖，耗時(shí)短，可同時(shí)檢測(cè)多種微生物，通量高，計(jì)數(shù)時(shí)抽樣量大，檢測(cè)結(jié) 果精細(xì)，能夠?qū)Ψ诸悊卧M(jìn)行區(qū)分，無需大量的DNA并避免了富集培養(yǎng)，檢測(cè)結(jié)構(gòu)無噪音且 準(zhǔn)確，對(duì)于低含量微生物的定量準(zhǔn)確度高，且對(duì)于微生物定性和定量的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、分辨 率高、靈敏度高、有概率保障，檢測(cè)過程簡(jiǎn)單、快速且流程規(guī)范。本發(fā)明提供的方法有助于