一種檢測四溴雙酚a毒性效應的櫛孔扇貝基因芯片的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測四溴雙酚A對櫛孔扇貝毒性效應的基因芯片，用于對四溴雙 酚A所引起的相關基因表達量變化的檢測，屬于基因芯片檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 四溴雙酸A(tetrabisphenolA)是目前世界上產量和使用量最大的一種溴系阻燃 劑，這種阻燃劑可以被作為反應型阻燃劑（超過90%)添加到印刷電路板和作為添加型阻 燃劑混合入塑料合成物中。由于其廣泛使用，并能夠從產品中釋放到環(huán)境中，目前在全球范 圍內的環(huán)境介質中普遍存在。目前，TBBPA在大氣，水體，土壤，生物體內均已被檢出。研究 表明，TBBPA是一種潛在的環(huán)境內分泌干擾物，具有潛在的持久性、細胞毒性、免疫毒性、甲 狀腺素干擾性以及雌激素干擾性，尤其對水生生物產生嚴重毒害作用。由于雙殼貝類在兩 半球分布廣泛，大多營濾食性生活，活動范圍小，能夠大量富集海洋污染物，因而被認為是 非常合適的哨兵物種，并已被廣泛應用于海洋環(huán)境中有毒物質的監(jiān)測工作中。很多用于生 物監(jiān)測的貝類物種又是當?shù)刂匾慕洕愵?，研究貝類體內的累積特征關系到水產品的質 量安全，與人類健康息息相關。因此采用基因芯片技術，研究櫛孔扇貝在四溴雙酚A脅迫下 體內相關基因表達量的變化，為研究該水域地區(qū)四溴雙酚A污染情況提供高效、穩(wěn)定的監(jiān) 測技術。
[0003] 常用檢測四溴雙酚A對櫛孔扇貝毒性效應的方法主要有熒光定量PCR與高通量測 序方法。熒光定量PCR是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記 跟蹤，實時在線監(jiān)控反應過程，并且可由實驗者結合相應的軟件對產物進行分析，計算待測 樣品模板的初始濃度，但相對于高通量測序技術與基因芯片技術，熒光定量PCR檢測規(guī)模 較小，是一種不適合大規(guī)模實驗的檢測的技術。相較于熒光定量PCR技術而言，高通量測序 技術靈敏度較低且所需的儀器價格昂貴，檢測成本高，分析速度慢，無法在短時間內準確檢 測出四溴雙酚A對對櫛孔扇貝毒性效應。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于發(fā)明一種基因芯片用于檢測四溴雙酚A對櫛孔扇貝毒性效應， 是一種具有高靈敏性和特異性的快速檢測方法，以克服現(xiàn)有技術的不足。
[0005] 本發(fā)明的技術方案如下：
[0006] -種檢測四溴雙酚A對櫛孔扇貝毒性效應的基因芯片，其特征在于包括固相載體 和固定在該固相載體上的8種寡核苷酸探針，所述8種寡核苷酸探針取自櫛孔扇貝特定的 8個基因序列，所述的8種寡核苷酸探針是SEQIDNO. 1~8所示的核苷酸序列。
[0007] 所述固相載體選自載玻片、硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜或聚苯乙烯。
[0008] 本發(fā)明還涉及前述檢測檢測四溴雙酚A對櫛孔扇貝毒性效應的基因芯片的使用 方法，包括以下步驟：
[0009] (a)f節(jié)孔扇貝cDNA樣品的制備；
[0010] (b)熒光標記上述cDNA樣品；
[0011] 其特征在于還包括以下步驟：
[0012] (c)將熒光標記后的cDNA樣品與所述基因芯片雜交；
[0013] (d)掃描檢測基因芯片的雜交信號，獲得結果。若有基因差異表達，表示該櫛孔扇 貝可能受到四溴雙酚A脅迫，繼而進行進一步定量檢測。
[0014] 本申請就四溴雙酚A對雙殼貝類的毒性效應經過多年研究之后，在原有的毒理學 研究的基礎上，開發(fā)出的新型的基于毒理學研究技術的基因芯片及檢測方法，該方法與熒 光定量PCR與高通量測序方法相比，穩(wěn)定性更高，檢測速度更快，檢測規(guī)模更大，檢測靈敏 度及特異性更高，檢測成本更低，具有明顯的先進性。
[0015] 本發(fā)明建立了用于檢測櫛孔扇貝在在四溴雙酚A脅迫下毒性效應的的基因芯片 及其制造和使用方法。利用生物監(jiān)測技術，為監(jiān)測環(huán)境中四溴雙酚A殘留提供了一種快速 高效的檢測手段。
[0016] 本發(fā)明中所提供的基因芯片及檢測方法經初步應用于櫛孔扇貝，由于該方法采用 的是多基因芯片技術，具有高效、快速、準確、穩(wěn)定等優(yōu)點，可以快速、精確、特異性的檢測其 在不同濃度四溴雙酚A的脅迫下相關基因表達量的變化。
【具體實施方式】
[0017] 以下通過實施例進一步說明本發(fā)明
[0018] 一、主要儀器：
[0019] 表1?主要儀器：
[0020]
[0021] 二、主要試劑：
[0022] 表2?主要試劑：
[0023]
[0024] 三、本發(fā)明基因芯片的制備方法的具體步驟如下：
[0025] 1、設計檢測的特異性探針：在GenBank和已知轉錄組文庫中分別選取特定的8個 基因序列，利用生物信息學軟件Primer Express 2.0設計特異性探針；
[0026] 2、將上述設計完成的探針經合成后按設計好的陣列布局固定于固相載體尼龍膜 上即構成本發(fā)明的基因芯片。
[0027] 四、利用上述基因芯片檢測四溴雙酚A對櫛孔扇貝毒性效應的方法，包括以下步 驟：
[0028] (a)櫛孔扇貝cDNA樣品的制備，具體如下：
[0029] 1、樣本Total RNA的提取和質檢
[0030]采用合適的方法，比如 Trizol (Invitrogen, Gaithersburg, MD, USA)提取組織塊 或細胞樣品中的總RNA，并進一步進行純化和定量分析。
[0031] 2、Total RNA 合成 cDNA
[0032] 1)反轉錄合成 First Strand cDNA
[0033] 在0. 2mL無核酸酶的離心管中依次加入以下試劑：
[0034]取 Total RNA 100_500ng，調整體積到 4yL。
[0035] 若使用晶芯?基因表達譜系列芯片，加入晶芯?基因表達譜外參（Cat. No. 360030) 1 u L，否則加入 1 u L Nuclease-free Water。
[0036] 配制反轉錄Master Mix (下列表3所示為單個反應體系用量），輕輕混勻，短暫離 心放在冰浴上。取5yL Master Mix分別轉移至含有Total RNA樣品的0.2mL離心管中。
[0037]表 3.反轉錄 Master Mix :
[0038]
[0039] 輕輕混勻溶液，瞬時離心后42°C反應2小時。反應結束后離心并冰浴。
[0040] 2)合成Second Strand cDNA
[0041] 配制Second Strand Master Mix (表4)，輕輕混勾，短暫離心后冰浴。在上述反應 結束后的每個樣品管中加入20 yL Second Strand Master Mix。
[0042]表4.Second Strand Master Mix :
[0043]
[0044] 輕柔混勻，16°C反應1小時，65°C 10min。
[0045] 反應結束后將反應管置于冰上繼續(xù)合成反應，或者迅速凍存于_20°C。
[0046] 3、體外轉錄合成cRNA
[0047] cRNA 合成
[0048] 配制體外轉錄Master Mix (下列表5所示為單個反應體系用量），輕輕混勻，短暫 離心將溶液收集于管底，向上述反應結束的每個樣品管中加入30 y L Master Mix。
[0049]表5?體外轉錄Master Mix :
[0050]
[0051] 輕柔混