增加植物的光合作用及產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種增加植物的光合作用及產(chǎn)量/生長(zhǎng)的方法、以及該方法中使用的 轉(zhuǎn)化植物。
【背景技術(shù)】
[0002] 在產(chǎn)生全球氣候變化及糧食短缺的危機(jī)的現(xiàn)代，發(fā)現(xiàn)使陸地植物的0)2攝入提高 的方法是越來(lái)越重要的課題。作為〇) 2攝入的主要器官的氣孔，為被位于表皮的2個(gè)特殊 細(xì)胞（也被稱(chēng)為保衛(wèi)細(xì)胞）包圍的微細(xì)的孔，主要在陸地植物中在其葉面上被發(fā)現(xiàn)。由于 葉面幾乎不透過(guò)空氣及水，因此，氣孔可提供用于周邊大氣和葉的內(nèi)部之間的C02、O2及水 蒸氣的擴(kuò)散的主要路徑。氣孔打開(kāi)引起的氣體交換的促進(jìn)為植物的光合作用及蒸騰作用中 的最不可缺少的過(guò)程中的一個(gè)（1、2)。近年來(lái)的研究顯示：氣孔蒸騰為水稻中的光合作用 的限制因子（3)、并且蒸騰的減少導(dǎo)致農(nóng)作物（例如小麥）的養(yǎng)分吸收降低（4)。因此，氣 孔打開(kāi)/氣孔蒸騰的增加促進(jìn)光合作用，且由此預(yù)料增加植物生長(zhǎng)。但是，就本發(fā)明的發(fā)明 人所知，關(guān)于植物生長(zhǎng)的增加，未曾報(bào)導(dǎo)操作氣孔開(kāi)度的研究的成功例。所認(rèn)為的理由之一 在于，由于氣孔也起到水閘的作用（5)，因此，難以平衡經(jīng)由該氣孔而失去水蒸氣的同時(shí)攝 入CO2的利弊。
[0003] 光為刺激氣孔開(kāi)口的主要因子之一，另外，各種各樣的機(jī)制是響應(yīng)于各種光波長(zhǎng) 進(jìn)行的氣孔開(kāi)口的基礎(chǔ)（6~8)。認(rèn)為紅光引起經(jīng)由葉肉及保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體中的光合作用 的氣孔打開(kāi)、以及細(xì)胞間隙CO2濃度（Ci)的降低（5、9、10)。但是，關(guān)于相對(duì)于紅光的氣孔 應(yīng)答的詳細(xì)的機(jī)制，則正在議論之中（11、12)。相比之下，藍(lán)光作為信號(hào)起作用，相對(duì)于氣孔 打開(kāi)發(fā)揮最顯著的效果。藍(lán)光受體向光素（photl及phot2)經(jīng)由羧基末端第2位蘇氨酸的 磷酸化和隨后的磷酸化蘇氨酸與14-3-3蛋白質(zhì)的結(jié)合而將細(xì)胞膜H+-ATPase活化（13~ 15)。利用藍(lán)光被活化的細(xì)胞膜H+-ATPase引起細(xì)胞膜的超級(jí)化，由此可以經(jīng)由內(nèi)向整流性 K+通道（細(xì)胞膜K+in通道）進(jìn)行K+的攝入（16~20)。K+的蓄積引起保衛(wèi)細(xì)胞的膨脹及氣 孔打開(kāi)。因此，上述3個(gè)因子（向光素、細(xì)胞膜H+-ATPase及細(xì)胞膜K+in通道）在藍(lán)光引起 的氣孔打開(kāi)中起到重要的作用。除這些因子之外，暗示FLOWERINGLO⑶ST(FT)為氣孔打 開(kāi)的正的調(diào)節(jié)因子（21)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 被植物表皮內(nèi)的一對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞所包圍的氣孔的孔，響應(yīng)于光、〇)2及作為植物激素 的脫落酸（ABA)進(jìn)行應(yīng)答而調(diào)節(jié)植物和大氣之間的氣體交換。光引起的氣孔打開(kāi)通過(guò)至少 3個(gè)主原因子一一藍(lán)光受體向光素、細(xì)胞膜H+-ATPase及細(xì)胞膜K+in通道一一而介導(dǎo)。雖然 氣孔阻力認(rèn)為是植物攝入〇)2的主要限制因子，但幾乎沒(méi)有進(jìn)行以光合作用及植物生長(zhǎng)的 增加為目標(biāo)使氣孔打開(kāi)增大的嘗試。
[0005] 在此，本發(fā)明的發(fā)明人示出：使用保衛(wèi)細(xì)胞啟動(dòng)子、即保衛(wèi)細(xì)胞特異性地高表達(dá)的 基因的啟動(dòng)子（GC1啟動(dòng)子）過(guò)表達(dá)細(xì)胞膜H+-ATPase(AHA2)的擬南芥屬的轉(zhuǎn)化植物顯示光 引起的氣孔打開(kāi)、光合作用及植物成長(zhǎng)（植物的產(chǎn)量）的增大。該轉(zhuǎn)化植物在生長(zhǎng)開(kāi)始第25 天產(chǎn)生比野生型大且增加的數(shù)目的蓮座葉，其濕重及干重約大42~63%。播種后第45天 的轉(zhuǎn)化植物的、包含種子和長(zhǎng)角果及花的全花莖的干重與野生型的全花莖的干重相比約大 36~41%。此外，該轉(zhuǎn)化植物的氣孔響應(yīng)于黑暗條件及脫落酸而正常地關(guān)閉。相比之下， 保衛(wèi)細(xì)胞中的向光素或細(xì)胞膜!(二通道的過(guò)表達(dá)對(duì)這些表現(xiàn)型沒(méi)有影響。這些結(jié)果證明： 氣孔開(kāi)度為光合作用及植物生長(zhǎng)中的限制因子，另外，在保衛(wèi)細(xì)胞中使細(xì)胞膜H+-ATPase過(guò) 表達(dá)引起的氣孔打開(kāi)的操作對(duì)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)是非常有用的。
[0006]SP，本發(fā)明包含以下發(fā)明。
[0007] [1] 一種轉(zhuǎn)基因植物，其過(guò)表達(dá)AHA2基因。
[0008] [2]根據(jù)[1]所述的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物利用保衛(wèi)細(xì)胞特異性地高表達(dá) 的基因的啟動(dòng)子、優(yōu)選GCl啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)AHA2基因。
[0009] [3]根據(jù)[1]所述的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物為雙子葉植物。
[0010] [4]根據(jù)[3]所述的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物屬于十字花科。
[0011] [5]根據(jù)[4]所述的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物屬于擬南芥屬或蕓苔屬。
[0012] [6]根據(jù)[4]所述的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物選自由擬南芥（Arabidopsis thaliana)、甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)、油菜花(Brassicarapavar. nippo-oleifera)、甘藍(lán)（Brassicaoleraceavar.capitata)、西蘭花(brassicaoleracea var.italica)、花挪菜（Brassicaoleraceavar.botrytis)及大白菜（Brassicarapa var.pekinensis)構(gòu)成的組。
[0013] [7]根據(jù)[1]所述的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物為單子葉植物。
[0014] [8]根據(jù)[7]所述的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物屬于禾本科。
[0015] [9]根據(jù)[8]所述的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物屬于稻屬、玉蜀黍?qū)佟⒏收釋倩?尚梁屬。
[0016] [10]根據(jù)[8]所述的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物選自由高粱（Sorghum bicolor)、稻（Oryzasativa)、非洲稻（Oryzaglaberrima)、甘鹿（Saccharum officinarum)、玉米（Zeamays)、大麥（Hordeumvulgare)及小麥（Triticumaestivum)構(gòu) 成的組。
[0017] [11] -種增加植物的產(chǎn)量的方法，包括在該植物中導(dǎo)入用于過(guò)表達(dá)AHA2基因的 基因修飾。
[0018] [12] -種增加植物中的光合作用的方法，包括在該植物中導(dǎo)入用于使AHA2基因 過(guò)表達(dá)的基因修飾。
[0019] [13]根據(jù)[11]或[12]所述的方法，其中，AHA2基因處于保衛(wèi)細(xì)胞特異性地高表 達(dá)的基因的啟動(dòng)子、優(yōu)選GCl啟動(dòng)子的控制下。
[0020] [14]根據(jù)[11]或[12]所述的方法，其中，所述植物為雙子葉植物。
[0021] [15]根據(jù)[14]所述的方法，其中，所述植物屬于十字花科。
[0022] [16]根據(jù)[15]所述的方法，其中，所述植物屬于擬南芥屬或蕓苔屬。
[0023] [17]根據(jù)[15]所述的方法，其中，所述植物選自由擬南芥（Arabidopsis thaliana)、甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)、油菜花(Brassicarapavar. nippo-oleifera)、甘藍(lán)（Brassicaoleraceavar.capitata)、西蘭花(brassicaoleracea var.italica)、花挪菜（Brassicaoleraceavar.botrytis)及大白菜（Brassicarapa var.pekinensis)構(gòu)成的組。
[0024] [18]根據(jù)[11]或[12]所述的方法，其中，所述植物為單子葉植物。
[0025] [19]根據(jù)[18]所述的方法，其中，所述植物屬于禾本科。
[0026] [20]根據(jù)[19]所述的方法，其中，所述植物屬于稻屬、玉蜀黍?qū)佟⒏收釋倩蚋吡?屬。
[0027][21]根據(jù)[19]所述的方法，其中，所述植物選自由高粱（Sorghumbicolor)、稻 (Oryzasativa)、非洲稻（Oryzaglaberrima)、甘鹿（Saccharumofficinarum)、玉米（Zea mays)、大麥（Hordeumvulgare)及小麥（Triticumaestivum)構(gòu)成的組。
[0028] 本說(shuō)明書(shū)通過(guò)參照而引入作為本申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/777, 655 號(hào)的說(shuō)明書(shū)、專(zhuān)利權(quán)利要求書(shū)及附圖中所記載的內(nèi)容。
[0029] 附圖簡(jiǎn)述
[0030] 圖1顯示利用了GCl啟動(dòng)子的AHA2的過(guò)表達(dá)（GC1::AHA2)促進(jìn)氣孔打開(kāi)。GCl:: AHA#1及GCl::AHA#2是指分別獨(dú)立地得到的轉(zhuǎn)化植物。（A)為擬南芥屬植物的表皮中的 保衛(wèi)細(xì)胞H+-ATPase的免疫組織化學(xué)檢測(cè)的典型的熒光圖像（關(guān)于免疫組織化學(xué)條件的 詳細(xì)，請(qǐng)參照材料及方法的項(xiàng)）。（B)為野生型（WT)及GCl: :AHA2中的AHA2及TUB2的 RT-PCR分析。將TUB2(TUBULINBETACHAIN2)作為對(duì)照基因使用。（C)為2. 5小時(shí)的黑暗 下、2. 5小時(shí)的光照射（50ymolm2S1的紅光及10ymolm2S1的藍(lán)光）下或2. 5小時(shí)的光 照射下且20yMABA的存在下的氣孔開(kāi)度。（D)為照射藍(lán)光30分鐘的表皮中的典型的氣 孔。光條件與（C)相同。（E)為黑暗下或30分鐘的光處理后的氣孔開(kāi)度。光條件設(shè)為與 (C)相同。（C)及（E)的氣孔開(kāi)度為與25個(gè)氣孔有關(guān)的測(cè)定值的平均值；誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn) 誤差（SEM)。氣孔開(kāi)度的差異使用學(xué)生t-檢驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)CwP< 0. 001)。（F)為從播種后 第4周的WT及AHA2-轉(zhuǎn)化植物切斷的蓮座葉的濕重的變化的動(dòng)態(tài)。葉的相對(duì)重量作為相 對(duì)于初期重量（從植物體切斷之后的各蓮座葉的重量）的比例表示。數(shù)據(jù)為10片葉的平 均值；誤差棒表不標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD)。
[0031] 圖2顯示AHA2-轉(zhuǎn)化植物的氣體交換特性。野生型（WT)及AHA2轉(zhuǎn)化植物中的 (A)氣孔導(dǎo)度的光應(yīng)答以及（B)0)2同化速度。用380yLL1的CO2進(jìn)行測(cè)定；葉溫及葉室 的相對(duì)濕度分別維持在24°C及40~50%。（C)為野生型及AHA2-轉(zhuǎn)化植物中的CO2同化 速度和細(xì)胞間隙CO2濃度的關(guān)系。在約750ymolm2S1的白光下進(jìn)行測(cè)定。葉溫及葉室內(nèi) 的相對(duì)濕度分別維持在24°C及40~50%。數(shù)據(jù)為與3個(gè)不同的植物體有關(guān)的測(cè)定值的平 均值；誤差棒表示SD，另外，比記號(hào)小的情況沒(méi)有表示。白的四角為野生型植物；深藍(lán)色的 圓及淺藍(lán)色的三角為AHA2-轉(zhuǎn)化植物。
[0032] 圖3顯示AHA2-轉(zhuǎn)化植物的表現(xiàn)型的特征。（A)及⑶為在強(qiáng)光條件（200ymol m2S 4下生長(zhǎng)了 25天的野生型及AHA2-轉(zhuǎn)化植物的表現(xiàn)型。（C)為在強(qiáng)光條件下生長(zhǎng)的野 生型AHA2-轉(zhuǎn)化植物的蓮座葉及幼葉。（D)為播種后第25天的植物體的相對(duì)的地上部的 濕重及干重。（E)為在強(qiáng)光條件下生長(zhǎng)了 50天的野生型及AHA2-轉(zhuǎn)化植物的表現(xiàn)型。（F) 為播種后第45天的植物的相對(duì)干莖重。濕重及干重為6個(gè)體以上的植物體的測(cè)定值的平 均值；誤差棒表示SEM。對(duì)差異通過(guò)學(xué)生t-檢驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)CnP< 0. 05、，< 0. 005、 < 0? 001)〇
[0033] 圖4顯示使用了GC