對(duì)細(xì)菌性黑枯病的廣譜抗性的制作方法
【專利說(shuō)明】對(duì)細(xì)菌性黑枯病的廣譜抗性
[0001] 序列提交
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[0003] 發(fā)明背景
[0004] 本發(fā)明涉及提供對(duì)植物中黃單胞菌廣譜抗病性的合成啟動(dòng)子和合成基因。本發(fā)明 還涉及包含所述合成基因的轉(zhuǎn)基因植物，以及通過(guò)將植物與這類轉(zhuǎn)基因植物雜交獲得的植 物。更具體地，所述合成啟動(dòng)子是合成的XalO啟動(dòng)子，所述合成基因是合成的XalO基因， 其包含合成的XalO啟動(dòng)子。所述抗性是對(duì)細(xì)菌性黑枯病（bacterialblight)的抗性，所 述植物是稻屬植物。
[0005] 本文用于說(shuō)明本發(fā)明背景或提供有關(guān)實(shí)施的補(bǔ)充細(xì)節(jié)的出版物和其他材料被引 入作為參考，為了方便起見在文獻(xiàn)目錄中分別分組。
[0006] 革蘭氏陰性的致植物病細(xì)菌使用III型分泌系統(tǒng)（TTSS)將效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)移入植 物細(xì)胞，在那里它們調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞功能以利于侵入過(guò)程（Alfano和Collmer, 2004;Kay 和Bonas，2009)。大的AvrBs3效應(yīng)家族的成員是獨(dú)特類型的III型效應(yīng)物，由黃單胞菌 屬（Xanthomonas)和青枯菌屬（Ralstoniasolanacearum)的致病變種產(chǎn)生（Bonas等 人，1989 ;Yang和White, 2004 ;Heuer等人，2007)。AvrBs3樣效應(yīng)物，最近也稱為轉(zhuǎn)錄活 化物樣（TAL)效應(yīng)物（Yang等人，2006 ;B〇gdan〇Ve等人，2010)，通常具有III型分泌所需 的N端以及包含核定位信號(hào)（NLS)和酸性活化結(jié)構(gòu)域（AAD)的C端。TAL效應(yīng)物在中間段 不同，其是通常長(zhǎng)度為33-35個(gè)氨基酸（aa)、接近完美的重復(fù)的區(qū)域，結(jié)尾于20個(gè)氨基酸長(zhǎng) 度的截短重復(fù)。在重復(fù)的第12和13位的兩種高變氨基酸，還稱為重復(fù)可變的雙殘基（RVD) (Moscou和Bogdanove, 2009)，有助于重復(fù)多態(tài)性，而TAL效應(yīng)物中具有多態(tài)性RVDs的重復(fù) 的數(shù)量和次序決定了特異活性（Herbers等人，1992 ;Yang等人，2005)。
[0007] 單個(gè)TAL效應(yīng)物活化特定宿主易感性（S)基因的轉(zhuǎn)錄以促進(jìn)疾病進(jìn)展（Yang等 人，2006 ;Kay等人，2007 ;Sugio等人，2007 !Antony等人，2010)。為了抵消疾病促進(jìn) 策略，植物已經(jīng)進(jìn)化出利用TAL效應(yīng)物的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)能力的機(jī)制（Gu等人，2005 ;Romer等 人，2007)。因此，TAL效應(yīng)物的亞組起無(wú)致病力效應(yīng)物的作用，并活化疾病R基因的轉(zhuǎn)錄。 TAL效應(yīng)物結(jié)合S或R基因的啟動(dòng)子中的特定DNA序列（Kay等人，2007 ;Romer等人，2007; Romer等人，2009 ;Antony等人，2010)。來(lái)自TAL效應(yīng)物的中央重復(fù)的每個(gè)RVD特異性識(shí)別 在5'端具有保守T的靶DNA元件的核苷酸（Boch和Bonas, 2010 ;Bogdanove等人，2010)。
[0008] 水稻白葉枯病黃單胞菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzae)是水稻細(xì)菌性黑枯病 的病原體（Nino-Liu等人，2006)。水稻細(xì)菌性黑枯病菌的單獨(dú)株載有11到19個(gè)TAL效 應(yīng)物（White等人，2009)。來(lái)自水稻白葉枯病黃單胞菌的TAL效應(yīng)物靶向水稻基因針對(duì) 細(xì)菌感染的易感性（Yang等人，2006 ;Sugio等人，2007 ;Chen等人，2010)或抗性（Gu等 人，2005)。來(lái)自水稻白葉枯病黃單胞菌？乂09#株的TAL效應(yīng)物PthXol靶向水稻的0s8N3/ Xal3/0sSWEETll(Yang等人，2006;Chen等人，2010)。Xal3 的隱性等位基因（xal3)對(duì) PthXol無(wú)響應(yīng)，含有xal3的植物對(duì)只依賴PthXol作為重要毒性效應(yīng)物的病原體株具有抗 性（Yang等人，2006)。通過(guò)利用TAL效應(yīng)物AvrXa7和PthXo3的病原體株，利用誘導(dǎo)S基 因0s-llN3(N3基因家族的另一成員），可以去除xal3介導(dǎo)的對(duì)水稻細(xì)菌性黑枯病的抗性 (Antony等人，2010)。
[0009]PthXo6和PthXo7是來(lái)自PX099A的兩種其他TAL效應(yīng)物，分別靶向兩種轉(zhuǎn)錄因子 基因，水稻的OsTFXl和OsTFIIAyUSugio等人，2007)。OsTFXl編碼bZIP轉(zhuǎn)錄因子，而 OsTFIIAy1的基因產(chǎn)物是轉(zhuǎn)錄因子IIA的小亞基（Sugio等人，2007)。通過(guò)PthXo7誘導(dǎo) 位于染色體1的OsTFIIAy1可以反映出PX099A對(duì)xa5(OsTFIIAy5的等位基因，編碼水稻 的染色體5上的TFIIA小亞基的第二種形式（Sugio等人，2007))介導(dǎo)的抗性的適應(yīng)（Iyer 和McCouch, 2004)。PthXol的DNA靶序列，EBEpthxcil (PthXol的效應(yīng)物結(jié)合元件），已經(jīng)在 0s8N3的啟動(dòng)子中被鑒定出（Antony等人，2010)，而PthXo6和PthXo7的DNA靶序列仍待 在OsTFXl和OsTFIIAy1的啟動(dòng)子中鑒定或驗(yàn)證，盡管已經(jīng)預(yù)測(cè)出假定的靶序列（Boch等 人，2009)。
[0010] 當(dāng)水稻植物攜帶同源R基因Xa7、XalO或Xa27(3種TAL效應(yīng)物）時(shí)，來(lái)自PX086的 AvrXa7 和AvrXalO(Hopkins等人，1992)以及來(lái)自PX099%3AvrXa27(Gu等人，2005)，激活 抗病性。到目前為止，只有Xa27基因已經(jīng)被分離和公開（Gu等人，2005)。如果AvrXa27誘 導(dǎo)型啟動(dòng)子被來(lái)自水稻PRl基因的應(yīng)激誘導(dǎo)型啟動(dòng)子替換，則Xa27被AvrXa27誘導(dǎo)，所述 基因可提供對(duì)水稻白葉枯病黃單胞菌的非特異性抗性（Gu等人，2005Jian和Yin，2009)。 八￥4&27對(duì)乂&27的完整誘導(dǎo)需要〇81?114丫5，其是染色體5上乂 &5的基因產(chǎn)物（611等 人，2009)。在AvrXa27特異性誘導(dǎo)的Xa27的啟動(dòng)子中鑒定出16-到18-bpDNA順式元 件，稱為UPTAwXa27(被TAL效應(yīng)物AvrXa27 或EBEAwXa27上調(diào)）（Boch等人，2009 ;R〇mer 等 人，2009)。
[0011]XalO提供對(duì)水稻白葉枯病黃單胞菌的少量菲律賓品種的窄譜品種特異性抗性 (Yoshimura等人，1995)。R基因從水稻栽培品種Cas209基因滲入（introgressed)易感 的水稻品種IR24(Mew，1982 ;Yoshimura等人，1983)。XalO被精細(xì)作圖位于染色體11長(zhǎng) 臂上的近端標(biāo)記物M491和遠(yuǎn)端標(biāo)記物M419之間的0. 28cM遺傳區(qū)域，并與標(biāo)記物S723和 M604共分離（Gu等人，2008)。最近通過(guò)基于圖譜的克隆和遺傳轉(zhuǎn)化方法克隆出XalO基因 (國(guó)際公開申請(qǐng)?zhí)朩O2012/033462)。在XalO的啟動(dòng)子中鑒定出AvrXalO的功能性靶序 列，EBEA"Xal。（國(guó)際公開申請(qǐng)?zhí)朩O2012/033462)。XalO基因產(chǎn)物，XA10,通過(guò)誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng) (HR)樣細(xì)胞死亡在單子葉植物和雙子葉植物中均起作用（未公開的）。
[0012] 由R基因啟動(dòng)子而不是R基因產(chǎn)物決定TAL效應(yīng)物依賴性R基因?qū)?xì)菌性黑枯 病的抗性特異性（Gu等人，2005)。同時(shí)，TAL效應(yīng)物依賴性R基因針對(duì)細(xì)菌性黑枯病的抗 性譜變化很大，這依賴于水稻白葉枯病黃單胞菌株中無(wú)致病力TAL效應(yīng)物的可用性（Gu等 人，2004 ;Gu等人，2008)。Romer等人（2009)證明，被不同TAL效應(yīng)物靶向的多個(gè)功能不 同的DNA元件當(dāng)合并入一個(gè)啟動(dòng)子時(shí)保留它們的功能和特異性。希望產(chǎn)生針對(duì)水稻細(xì)菌性 黑枯病的廣譜抗性。
[0013] 發(fā)明概述
[0014] 本發(fā)明涉及提供對(duì)植物中黃單胞菌廣譜抗病性的合成啟動(dòng)子和合成基因。本發(fā)明 還涉及包含所述合成基因的轉(zhuǎn)基因植物，以及通過(guò)將植物與這類轉(zhuǎn)基因植物雜交獲得的植 物。更具體地，所述合成啟動(dòng)子是合成的XalO啟動(dòng)子，所述合成基因是合成的XalO基因， 其包含合成的XalO啟動(dòng)子。所述抗性是對(duì)細(xì)菌性黑枯病的抗性，所述植物是稻屬植物。
[0015] 因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種包括水稻XalO啟動(dòng)子的合成啟動(dòng)子，其已 被修飾以包含多個(gè)效應(yīng)物結(jié)合元件（EBE)，每種EBE結(jié)合不同的轉(zhuǎn)錄活化劑樣（TAL)效應(yīng) 物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述合成啟動(dòng)子包含EBEpthxci7序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述合 成啟動(dòng)子包含EBEpthxcil序列。在另外的實(shí)施方案中，所述合成啟動(dòng)子包含EBEawm。序列。在 其他實(shí)施方案中，所述合成啟動(dòng)子包含EBEpthxci6序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述合成啟動(dòng) 子包含EBEAwXa27序列。在另外的實(shí)施方案中，所述合成啟動(dòng)子包含所有這5種EBE序列。在 一個(gè)實(shí)施方案中，所述合成啟動(dòng)子是合成的迷你啟動(dòng)子，其包含所述EBE序列中的1至5種 和具有啟動(dòng)子活性的水稻XalO啟動(dòng)子的最小部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述合成啟動(dòng)子 是合成的全長(zhǎng)XalO，其包含EBE序列中的1至5種。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述合成全長(zhǎng)啟動(dòng) 子包含合成的迷你啟動(dòng)子。在其他的實(shí)施方案中，所述合成啟動(dòng)子是比合成迷你啟動(dòng)子更 大的合成全長(zhǎng)啟動(dòng)子的任意片段，其鄰接于合成迷你啟動(dòng)子的5'端并且具有啟動(dòng)子活性。
[0016] 在一個(gè)實(shí)施方案中，合成的迷你啟動(dòng)子包括SEQIDNO:2所示的序列。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，合成的全長(zhǎng)啟動(dòng)子包括SEQIDNO: 10所示的序列。在其他實(shí)施方案中，合成啟 動(dòng)子包括核苷酸2208-2456和任意數(shù)目的核苷酸，其在合成迷你啟動(dòng)子的5'并與所述合成 迷你啟動(dòng)子鄰接。在一個(gè)實(shí)施方案中，EBEpthxci7序列包括SEQIDNO: 5所示的序列。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，EBEpthxcil序列包括SEQIDNO:6所示的序列。在額外的實(shí)施方案中，EBEA"Xal。 序列包括SEQIDNO: 7所示的序列。在其他實(shí)施方案中，EBEpthxci6序列包括SEQIDNO:8所 示的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，EBEA"Xa27序列包括SEQIDN0:9所示的序列。
[0017] 在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供一種合成的XalO基因，其包括與水稻XalO序列可操作 連接的本發(fā)明的合成啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，水稻XalO序列的起始密碼子與合成啟動(dòng) 子的3'端鄰接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，水稻XalO序列是水稻XalO蛋白的編碼序列。在其 他實(shí)施方案中，XalO序列是編碼水稻XalO蛋白的基因組序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，水稻 XalO序列是編碼序列加包含終止子的3'UTR。在其他實(shí)施方案中，水稻XalO終止子（SEQ IDNO: 15的核苷酸382-759)可以被技術(shù)人員公知的其他終止子取代，諸如NOS終止子、35S 終止子和Xa27終止子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼序列包括SEQIDNO: 13所示的編碼 序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼水稻XalO蛋白的基因組序列包括SEQIDNO: 15所示的 序列，其包括編碼序列（核苷酸1-381)和終止子（核苷酸382-759)。在其他實(shí)施方案中， 編碼水稻XalO蛋白的基因組序列包括SEQIDNO: 16所示的序列，其包括編碼序列（核苷 酸1-381)、終止子（核苷酸382-759)和進(jìn)一步包括3'UTR(核苷酸760-1193)。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，編碼水稻XalO蛋白的基因組序列包括SEQIDN0:17所示的序列，其包括編碼 序列（核苷酸1-381)、終止子（核苷酸382-759)和進(jìn)一步包括3'UTR(核苷酸760-2215)。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，水稻XalO序列包括SEQIDNO: 17的核苷酸1-759所示的序列加 SEQIDNO: 17中終止子3'的任意數(shù)目的核苷酸（它們鄰接于終止子）。在一個(gè)實(shí)施方案 中，合成XalO基因的序列如SEQIDNO: 11所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，合成XalO基因的 序列如SEQIDNO: 12所示。
[0018] 在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供一種包括此處所述的合成XalO基因的載體。本發(fā)明還 提供一種包括所述載體的植物細(xì)胞，以及包括所述植物細(xì)胞的具有對(duì)細(xì)菌性黑枯病廣譜抗 性的轉(zhuǎn)基因植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物細(xì)胞是水稻細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所 述轉(zhuǎn)基因植物是轉(zhuǎn)基因水稻植物。
[0019] 在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供一種制備具有對(duì)細(xì)菌性黑枯病廣譜抗性的轉(zhuǎn)基因植物 的方法。根據(jù)本發(fā)明，所述方法包括用此處描述的合成XalO基因或此處描述的包括合成 XalO基因的載體轉(zhuǎn)染一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞，并從所述一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基 因植物。根據(jù)本發(fā)明，所述合成XalO基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。將合成XalO基因或載體 轉(zhuǎn)染一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞有時(shí)在本文中也稱為利用合成XalO基因或載體轉(zhuǎn)化一個(gè)或多個(gè) 植物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞是一個(gè)或多個(gè)水稻細(xì)胞。
[0020] 在第五個(gè)方面，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因植物，其具有穩(wěn)定摻入其基因組的此處描 述的合成XalO基因的至少一個(gè)拷貝。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因植物包含合成XalO基 因的兩個(gè)拷貝。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因植物包含合成XalO基因的三個(gè)拷貝。在 額外的實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因植物包含合成XalO基因的四個(gè)拷貝。在其他實(shí)施方案中， 所述轉(zhuǎn)基因植物包含合成XalO基因的五個(gè)拷貝。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因植物包 含合成XalO基因的六個(gè)拷貝。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物是水稻植物。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，所述轉(zhuǎn)基因水稻植物在本文中被稱為L(zhǎng)2植物或L2系。本發(fā)明還提供一種植物，其包 含穩(wěn)定摻入其基因組的此處描述的合成XalO基因，這來(lái)源于將此處描述的轉(zhuǎn)基因植物或 其子代與第二種植物雜交并