上述抗5-羥基吲噪乙酸特異性抗體混合在一起。
[0040] 本發(fā)明的5-羥基吲哚乙酸免疫原特異性強(qiáng)、免疫原性高，制備出的抗5-羥基吲哚 乙酸特異性抗體特異性強(qiáng)、效價高，并且與常見的62種藥物無任何交叉反應(yīng)；含有上述抗 5-羥基吲哚乙酸特異性抗體的均相酶免疫檢測試劑可以方便、快速、準(zhǔn)確地確定尿液等生 物樣品中的5-羥基吲哚乙酸含量，并且可以在全自動生化分析儀上同時測定多個樣品，實(shí) 現(xiàn)5-羥基吲哚乙酸的高通量快速化測定，準(zhǔn)確度高，特異性強(qiáng)，精確度和檢測效率相比之 前都有了較大的提高，同時實(shí)現(xiàn)了檢測過程的全自動化，對檢測人員的要求不高，易于實(shí)現(xiàn) 和推廣使用。
【附圖說明】
[0041] 圖1是5-羥基吲哚乙酸的ELISA檢測反應(yīng)曲線；
[0042] 圖2是5-羥基吲哚乙酸的均相酶免疫反應(yīng)曲線；
[0043] 圖3是5-羥基吲哚乙酸均相酶免疫相關(guān)性分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 實(shí)施例一 5-羥基吲哚乙酸免疫原的合成
[0045] 5-羥基吲噪乙酸免疫原由牛血清白蛋白（BovineSerumAlbumin，BSA)與式（II) 所示的5-羥基吲哚乙酸的
S團(tuán)連接而成，具體步驟如下：
[0046] 1?將牛血清白蛋白200mg溶解于50ml0? 2M，pH8. 5的磷酸緩沖液中；
[0047] 2.將如下化學(xué)品加入到小燒杯中攪拌溶解：200mg5-羥基吲哚乙酸、3. 5ml二甲 基甲酰胺、3. 5ml乙醇、7. 0ml10mM，pH5. 0的磷酸鉀緩沖液、200mg1-乙基-3-(-3-二甲 氨丙基）碳二亞胺、50mgN-羥基硫代琥珀酰亞胺，將這些化學(xué)品在室溫下攪拌溶解反應(yīng) 30min；
[0048] 3.將溶解好的溶液滴加至BSA溶液中，并在2~8°C下攪拌過夜，得到抗原；將合 成好的抗原經(jīng)過透析進(jìn)行純化，得到5-羥基吲哚乙酸免疫原。
[0049] 實(shí)施例二：抗5-羥基吲哚乙酸特異性抗體的制備
[0050] 將實(shí)施例一制備得到的5-羥基吲哚乙酸免疫原采用常規(guī)方法接種實(shí)驗(yàn)動物兔， 加強(qiáng)免疫后取抗血清，具體步驟如下：
[0051] 1.用PBS將上述合成的5-羥基吲噪乙酸免疫原稀釋至1.Omg/ml，得到抗原溶液， 然后用1. 〇ml抗原溶液與等量弗氏完全佐劑混合，對實(shí)驗(yàn)動物兔進(jìn)行注射。
[0052] 2. 2~3周后，再用1. 0ml相同的抗原溶液與等量弗氏不完全佐劑對上述實(shí)驗(yàn)動物 兔注射一次，之后每隔四周注射一次，共計(jì)注射4次。
[0053] 3.對步驟2的實(shí)驗(yàn)動物兔取血，分離純化得到效價為1:30000~1:50000的抗 5-羥基吲哚乙酸特異性抗體。
[0054] 實(shí)施例三：5_羥基吲哚乙酸的ELISA檢驗(yàn)
[0055] 1. 5-羥基吲哚乙酸的ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
[0056] (1)標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0057] 將5-羥基吲哚乙酸粉末（購于Sigma公司）溶解于甲醇溶液，制備成1000ymol/ L的儲存液。用ELISA緩沖液將儲存液依次稀釋為80. 00ymol/L、40. 00ymol/L、 20. 00ymol/L、10. 00ymol/L、5. 00ymol/L和 0. 00ymol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。其中，ELISA緩沖 液含有 50.OmMTris，145mMNaCl和 0? 25% 的BSA。
[0058] (2)利用5-羥基吲哚乙酸的ELISA檢驗(yàn)方法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0059] 用PBS將實(shí)施例二中所制備的抗5-羥基吲哚乙酸特異性抗體稀釋成1:8000的終 濃度溶液，100yL/孔包被在96孔酶聯(lián)板上，4°C放置12-24h;用PBS將上述包被有抗5-羥 基吲哚乙酸抗體的96孔酶聯(lián)板洗滌3次后，加入200yL/孔的0. 5%的BSA溶液，4°C封閉 放置8-16h。然后用PBS洗滌3次，加入20yL/孔的標(biāo)準(zhǔn)品。再加入100yL/孔工作濃度 的HRP-5-羥基吲哚乙酸偶聯(lián)物；室溫下孵育30min后PBS洗板5次；然后每孔加入100yL TMB底物，室溫孵育30min。再每孔加入100yL終止液（2M硫酸）。測定450nm的吸光值。 根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品所對應(yīng)的450nm的吸光值定標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如附圖2所示。
[0060] 2.待測樣品中5-羥基吲哚乙酸含量的檢測
[0061] (1)制作待測樣品
[0062] 制備方法：將5-羥基吲哚乙酸粉末（購于Sigma公司）溶解于甲醇溶液制成 1000ymol/L的儲存液，并將此儲存液稀釋于空白尿液中，至終濃度分別為0. 00,10. 00， 40. 00,80. 00ymol/L，形成空白、低、中、高濃度的尿液樣本。該空白尿液為不含5-羥基吲 哚乙酸的健康人尿液。
[0063] (2)測試方法
[0064] 利用上述5-羥基吲哚乙酸的ELISA檢驗(yàn)方法，將上述空白、低、中、高濃度的尿液 樣本代替標(biāo)準(zhǔn)品，測試上述空白、低、中、高濃度的尿液樣本在450nm的吸光值。
[0065] (3)測試結(jié)果
[0066] 對照圖1中所示的5-羥基吲哚乙酸的ELISA檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每個樣本中 5-羥基吲哚乙酸含量，并對每個樣本進(jìn)行3個復(fù)孔測定，根據(jù)上述樣本中5-羥基吲哚乙酸 的實(shí)際含量計(jì)算回收率，結(jié)果如表1所示。
[0067] 表1 5-羥基吲哚乙酸的ELISA檢測回收實(shí)驗(yàn)
[0068]
[0069] 由表1中結(jié)果可知：采用本發(fā)明5-羥基吲哚乙酸的ELISA檢測試劑測定不同濃度 樣品中的5-羥基吲哚乙酸回收率都較高，均>90%，說明本發(fā)明所述的抗5-羥基吲哚乙酸 特異性抗體可以用于樣本中5-羥基吲哚乙酸的檢測，并且結(jié)果準(zhǔn)確度高。
[0070] 實(shí)施例四：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物的制備
[0071] 1.葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH)溶液的制備：
[0072] (1)準(zhǔn)確稱取15mg規(guī)格為100KU的G6PDH，室溫溶解于12mL含有72. 6mg(0? 05M) Tris、8mgMgCl2(3. 3mM)和100mgNaCl的溶液中，該溶液pH= 9. 0,本步驟在燒杯C中進(jìn) 行。
[0073] (2)在上述燒杯C中加入225mg還原態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH)，135mg葡 萄糖-6-磷酸（G-6-P)以及0? 75mL卡必醇（Carbitol)。
[0074] (3)在上述燒杯C中再逐滴加入2mL二甲基亞砜（dimethysulfoxide，DMS0)。
[0075] 2. 5-羥基吲哚乙酸的激活：
[0076] (1)在無水狀態(tài)下稱取10mg上述5-羥基吲噪乙酸，溶解于600yLDMF中。
[0077] (2)使上述溶液溫度降到-2~-8 °C。
[0078] (3)加入 3uL三丁胺（tributylamine)。
[0079] (4)加入1. 5uL氯甲酸異丁酯（isobutylchloroformate)〇
[0080] (5) -2 ~-8°C攪拌 30 分鐘。
[0081] 3.G6PDH與5-羥基吲哚乙酸的連接：
[0082](1)將上述激活的5-羥基吲哚乙酸溶液逐滴加入到上述溶解的G6PDH溶液中。
[0083] (2) 2-8°C攪拌過夜。
[0084]4?純化產(chǎn)物：
[0085] 通過G-25凝膠層析柱純化步驟3中的溶液，獲得的最終產(chǎn)物為葡萄糖-6-磷酸脫 氫酶-半抗原偶聯(lián)物，于2-8 °C下儲存。
[0086] 實(shí)施例五：5_羥基吲哚乙酸均相酶免疫檢測試劑的制備
[0087] 1.試劑A的制備：將4. 036g(ll. 25mM)氧化態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)、 L711g(11.25mM)葡萄糖-6-磷酸（G-6-P)置于燒杯D中，用1L55禮411 = 8.0的1^8緩 沖液溶解制成均相酶底物；將上述制備的抗5-羥基吲哚乙酸特異性抗體加到上述均相酶 底物中，抗體與均相酶底物的體積比為1:800。
[0088]2.試劑B的制備：將實(shí)施例四制備的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物加到 120mM、pH= 8. 2的Tris緩沖液中，上述偶聯(lián)物與Tris緩沖液的體積比為1:2000。
[0089] 實(shí)施例六：5_羥基吲哚乙酸均相酶免疫檢驗(yàn)及結(jié)果
[0090]1.獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線：
[0091] (1)設(shè)置邁瑞B(yǎng)S-480全自動生化分析儀反應(yīng)參數(shù)（見表