一種快速遺傳轉(zhuǎn)化苜蓿的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速遺傳轉(zhuǎn)化苜蓿的方法，是一種利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法直接轉(zhuǎn)化苜 蓿萌發(fā)種子，而不需要組織培養(yǎng)過程的新方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 紫花苜蓿（MedicagosativaL.)為多年生豆科牧草，在我國栽培歷史悠久、分布 廣泛。其蛋白質(zhì)含量豐富，營養(yǎng)價值高，干草產(chǎn)量居多種豆科牧草之首，素有"牧草之王"的 美譽。此外，發(fā)達的根系和生物固氮的特性使其對土壤改良、防止水土流失、提高土壤養(yǎng)分 中也起到重要作用。
[0003] 逆境尤其是鹽堿、干旱等是抑制植物生長和降低作物產(chǎn)量的重要的環(huán)境因子，紫 花苜蓿等優(yōu)良栽培作物因長期生長在較優(yōu)裕的條件下，其抗旱耐鹽等遺傳潛力非常有限。 長期以來，抗逆性品種的培育被認(rèn)為進一步提高苜蓿抵御逆境的有效途徑。隨著生物技術(shù) 的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因育種已成為苜蓿新品種培育的重要手段，它大大縮短了育種周期，打破了種 間的界限，促進了不同物種間遺傳物質(zhì)的交換，彌補了常規(guī)育種技術(shù)的一些局限性。自1985 年Vasil在國際草原學(xué)大會上第一次提出了利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將外源的特定基因?qū)肽?草的可行性，為基因工程改良牧草奠定了理論基礎(chǔ)。近年來，苜蓿通過基因轉(zhuǎn)化技術(shù)，在抗 寒性、抗旱性、耐鹽性等研究方面取得了一系列的突破性成就，加速了苜蓿育種進程。
[0004] 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法（Agrobacterium-mediated)是利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)?？汕?入受體細(xì)胞并整合進染色體DNA上的特性，實現(xiàn)了外源基因向植物受體的轉(zhuǎn)化。在眾多基 因轉(zhuǎn)化方法中，該方法以低成本、低拷貝、可轉(zhuǎn)移大片段的DNA等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于植物愈 傷組織、懸浮細(xì)胞、葉盤、莖段、子葉、下胚軸及薄層細(xì)胞等離體材料的轉(zhuǎn)化。
[0005] 在農(nóng)桿菌介導(dǎo)苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化的研究中，除少數(shù)工作外，苜蓿轉(zhuǎn)基因植株的獲得均 依賴于器官、組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)?；蛐褪墙M織培養(yǎng)與遺傳轉(zhuǎn)化能否成功的關(guān)鍵，而目前 只有少數(shù)苜蓿品種可通過組織和細(xì)胞培養(yǎng)再生大量植株。此外，依賴于組織和細(xì)胞培養(yǎng)技 術(shù)的轉(zhuǎn)化周期長。以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化苜蓿為例，葉片經(jīng)農(nóng)桿菌浸染、共培養(yǎng)后，細(xì) 胞經(jīng)脫分化形成抗性愈傷組織，抗性愈傷組織再分化出抗性芽，最后形成完整的抗性植株， 這個過程的最短時間不少于90d。因此，建立不受基因型制約的簡單、快速的苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化 方法和技術(shù)體系具有重要意義。
[0006] 例如在中國發(fā)明專利CN103074363A中，周曉馥等公開了一種利用苜蓿種子進行 基因轉(zhuǎn)化的方法。即以苜蓿種子作為轉(zhuǎn)化受體，在萌發(fā)過程中與含目標(biāo)基因的根癌農(nóng)桿菌 菌液共培養(yǎng)，靠滲透作用使得質(zhì)粒DNA進入植物細(xì)胞中。該苜蓿轉(zhuǎn)化方法避開了經(jīng)組織培 養(yǎng)獲得再生植株的過程，縮短了轉(zhuǎn)化周期。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)化的過程中，植物傷口產(chǎn)生 的糖類和酚類等化學(xué)物質(zhì)使得農(nóng)桿菌產(chǎn)生趨向性，使其附著在傷口誘發(fā)腫瘤，從而實現(xiàn)浸 染傷口并將T-DNA插入到植物基因組中。因此，該專利中受體材料僅靠滲透作用實現(xiàn)外源 DNA的轉(zhuǎn)化，存在轉(zhuǎn)化效率較低等缺點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種直接以苜蓿萌發(fā)種子為轉(zhuǎn)化受體，無需進行組織培養(yǎng)及 植株再生過程的農(nóng)桿菌介導(dǎo)苜蓿的快速遺傳轉(zhuǎn)化苜蓿的方法。
[0008] -種快速遺傳轉(zhuǎn)化苜蓿的方法，其特別之處在于，包括如下步驟：采用苜蓿萌發(fā)種 子為轉(zhuǎn)化受體，以攜帶外源基因的農(nóng)桿菌介導(dǎo)實現(xiàn)，具體步驟包括：（1)無菌苜蓿成熟種子 萌發(fā)；（2)攜帶外源基因的農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及注射式轉(zhuǎn)化；（3)共培養(yǎng)及脫菌；(4)抗性植株 的獲得；（5)轉(zhuǎn)基因植株的獲得。
[0009] 進一步的，包括如下步驟：
[0010] (1)無菌苜蓿成熟種子萌發(fā)：
[0011] 取苜蓿飽滿、成熟種子，經(jīng)消毒滅菌后置于MS固體培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)，光照時間 為光16h/暗8h，培養(yǎng)溫度為24±2°C，培養(yǎng)時間為72-96h;待苜蓿種子萌發(fā)后，即可作為轉(zhuǎn) 化受體材料待用；
[0012] (2)攜帶外源基因的農(nóng)桿菌培養(yǎng)及注射式轉(zhuǎn)化：
[0013] 挑取含有質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落接種于含50mg?L^an和20mg?LiRif的LB液體 培養(yǎng)基中，置入搖床，28°C，220rpm振蕩暗培養(yǎng)至菌液濃度達到0D600為0. 8-1. 0, 3000rpm 離心lOmin，收集菌體；加入50mlMS液體培養(yǎng)基重懸浮，用于轉(zhuǎn)化；將步驟（1)獲得的轉(zhuǎn)化 受體材料轉(zhuǎn)至鋪設(shè)無菌濾紙的無菌玻璃培養(yǎng)皿中，利用無菌微型注射器吸取攜帶外源基因 的農(nóng)桿菌菌液向子葉基部刺入并推進菌液即完成浸染；
[0014] (3)共培養(yǎng)及脫菌：
[0015] 取步驟（2)得到的注射攜帶外源基因農(nóng)桿菌的苜蓿萌發(fā)種子，置于鋪設(shè)無菌濾紙 的MS培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)2d，溫度為24±2°C;共培養(yǎng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化后的萌發(fā)種子轉(zhuǎn)至無菌 三角瓶中，用無菌水清洗后，再用無菌濾紙吸干子葉及胚軸、胚根上的水分；
[0016] (4)抗性植株的獲得：
[0017] 將得到的苜蓿萌發(fā)種子置于篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-30d，獲得抗性植株；其中篩選 培養(yǎng)基為含有〇? 〇5mg?LiNAAJOmg?LiKaruSOOmg?Ltef的1/2MS固體培養(yǎng)基；光照條 件為光照16h/黑暗8h，培養(yǎng)溫度為24±2°C;
[0018] (5)轉(zhuǎn)基因植株的獲得：
[0019] 當(dāng)步驟⑷得到的抗性植株葉片長至7-8片，根長為5-8cm時，剪切枝條扦插至步 驟（4)中的篩選培養(yǎng)基中，待植株生根，剪切葉片經(jīng)PCR和RT-PCR檢測，攜帶選擇標(biāo)記基因 及外源基因的整合和表達為轉(zhuǎn)基因植株。
[0020] 步驟（1)中苜蓿種子萌發(fā)程度為：種子萌發(fā)至胚已突破種皮，出現(xiàn)肉眼可見的胚 根與子葉，子葉顏色為黃色至黃綠色，子葉基部至胚根頂端長度為〇. 6-1.Ocm。
[0021] 步驟（2)中農(nóng)桿菌為含有選擇標(biāo)記基因NPTII以及目的基因的根癌農(nóng)桿菌菌株。
[0022] 步驟（2)中農(nóng)桿菌菌液濃度為0D_0. 8-1. 0,注射部位為沿子葉基部至胚根方向 約1-2_處；所使用的無菌微型注射器規(guī)格為lml，針頭規(guī)格為4. 5號。
[0023] 步驟（3)中用無菌水清洗具體是指使用含500mg?Ltef的無菌水對轉(zhuǎn)化受體清 洗2_3次。
[0024]本發(fā)明方法的操作相對簡單、無需昂貴的儀器及工具；利用萌發(fā)種子作為受體，不 受基因型的限制，取材方便，避開了嚴(yán)格的組織培養(yǎng)過程；此外本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法浸染時間 短、轉(zhuǎn)化周期也大大縮短，與其他的農(nóng)桿菌介導(dǎo)苜蓿轉(zhuǎn)化方法相比，具有顯著的優(yōu)勢，可在 苜蓿基因工程育種中推廣與應(yīng)用。
【附圖說明】
[0025] 附圖1為質(zhì)粒pCambia2300-HaBADH的物理圖譜；
[0026] 附圖2為轉(zhuǎn)化受體的苜蓿種子萌發(fā)中后期形態(tài)圖；
[0027] 附圖3為轉(zhuǎn)化受體浸染后共培養(yǎng)圖；
[0028] 附圖4為篩選培養(yǎng)圖（篩選培養(yǎng)5d，圖中綠色植株為經(jīng)選擇壓力篩選后的抗性植 株）；
[0029] 附圖5為篩選培養(yǎng)圖（篩選培養(yǎng)后10d，圖中綠色植株為經(jīng)選擇壓力篩選后的抗性 植株）；
[0030] 附圖6為苜蓿轉(zhuǎn)基因植株標(biāo)記基因NPTII的PCR檢測圖，其中，M為2000bpDNA ladderMaker; 1-20為部分轉(zhuǎn)基因植株；P為陽性質(zhì)粒pCambia2300-HaBADH;N為未轉(zhuǎn)化植 株；
[0031] 附圖7為苜蓿轉(zhuǎn)基因植株目的基因HaBADH的PCR檢測圖，其中，M為2000bpDNA ladderMaker;P為陽性質(zhì)粒pCambia2300_HaBADH;N為未轉(zhuǎn)化植株；1_15為部分陽性株 系；
[0032] 附圖8為苜蓿轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)參基因六(^111的1^0?檢測圖，其中^為200(^口0嫩 ladderMaker; 1-4為部分陽性植株；N為陰性對照；
[0033] 附圖9為轉(zhuǎn)基因植株目的基因HaBADH的RT-PCR檢測圖，其中，M為2000bpDNA ladderMaker;P為陽性質(zhì)粒pCambia2300-HaBADH(顯示為1500bp條帶）；N為未轉(zhuǎn)