通過過量表達(dá)原人參二醇合成酶基因提高人參發(fā)根中人參皂苷含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人參原人參二醇合成酶基因D12H，植物過量 表達(dá)載體PBI21-D12H，一種通過過量表達(dá)人參基因D12H使人參發(fā)根中人參皂苷含量提高 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人參是藥用植物，具有補(bǔ)脾益肺，安神明目等多種功效。人參中的主要生理活性物 質(zhì)為人參皂苷，人參皂苷為人參的次生代謝物質(zhì)，具有廣泛的藥理活性，對(duì)多種疾病有顯著 的療效，人參皂苷具有很高的藥用價(jià)值。但是，人參皂苷的主要來源是從植物體中提取，現(xiàn) 在野生的人參非常稀少，人工栽培的人參生長周期長，人參培育過程遭到病蟲的危害也較 多，影響了人參培育的品質(zhì)，自然生長的人參中人參皂苷的含量較低，這些因素都限制了人 參皂苷的開發(fā)與利用。近些年來國內(nèi)外的學(xué)者通過組織培養(yǎng)、生物轉(zhuǎn)化、微生物合成等方法 進(jìn)行人參皂苷合成研究，均取得了一定的研究成果?；蚬こ痰燃夹g(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，對(duì)進(jìn)行 人參品種改良和人參的種質(zhì)資源創(chuàng)新具有重要意義。上世紀(jì)八十年代，首次成功誘導(dǎo)人參 產(chǎn)生發(fā)根，獲得的人參發(fā)根，生長穩(wěn)定，生長速度快，為基因工程改良人參品質(zhì)以提高人參 皂苷含量奠定了基礎(chǔ)。近幾年對(duì)人參皂苷的合成途徑不斷進(jìn)行研究，成功的確定和克隆出 人參皂苷合成過程中的關(guān)鍵酶基因，人們利用代謝工程和基因工程手段對(duì)這些關(guān)鍵酶基因 進(jìn)行處理，調(diào)控人參皂苷合成途徑，以獲得的更多的人參皂苷。
[0003]目前，已經(jīng)確認(rèn)的多種人參單體皂苷，其中三萜類皂苷為主要成分。研究表明，人 參皂苷的共同前體為2,3_氧化角鯊烯，其通過多種酶的共同作用生成種類眾多的單體皂 苷。其生物合成路線為甲羥戊酸（MVA)途徑生成的IPP及其異構(gòu)化的DMAPP在牛兒基焦磷 酸合成酶（GPS)作用下首先形成牛兒基焦磷酸（GPP)，接著利用法尼基焦磷酸合成酶（FPS) 轉(zhuǎn)化成法尼基焦磷酸（FPP)，又在鯊烯合成酶（SS)等的作用下合成鯊烯，然后經(jīng)鯊烯環(huán)氧 酶（SE)催化轉(zhuǎn)變?yōu)?, 3-氧化鯊烯。2, 3-氧化角鯊烯流向三條不同的代謝途徑，其一是在 達(dá)瑪烯二醇合成酶、原人參二醇合成酶的作用下生成達(dá)瑪烷型皂苷；其二是在0 _香樹素 合成酶的作用下生成齊墩果烷型皂苷；另一條在環(huán)阿喬醇合成酶的作用下合成植物甾醇。 在眾多人參皂苷中只有一種齊墩果烷型皂苷-R〇,其他人參單體皂苷均為達(dá)瑪烷型皂苷，因 此，達(dá)瑪烷型人參皂苷合成酶基因?yàn)殛P(guān)鍵酶基因，其表達(dá)水平?jīng)Q定人參皂苷的含量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明首先克隆人參原人參二醇合成酶（或稱達(dá)瑪烯二醇12-羥化酶， Dammarenediol-12-hydroxylase，D12H)基因D12H，構(gòu)建人參基因D12H過量表達(dá)載體，對(duì)人 參進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)出人參發(fā)根，通過對(duì)人參發(fā)根中人參皂苷含量的分析，證明過量表達(dá) 人參原人參二醇合成酶基因D12H可提高人參中主要人參三萜類皂苷的含量。
[0005] 本發(fā)明利用植物雙元表達(dá)載體pBI121質(zhì)粒，該表達(dá)載體有強(qiáng)啟動(dòng)子CaMV35S，該 啟動(dòng)子由TATA盒、CAAT盒、倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列和增強(qiáng)子核心序列四部分組成。
[0006] 構(gòu)建人參基因D12H植物過量表達(dá)載體pBI121-D12H重組質(zhì)粒。
[0007] 將重組質(zhì)粒pBI121-D12H轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌A4,獲得工程菌A4-pBI121-D12H。
[0008] 利用植物過量表達(dá)工程菌A4-pBI121-D12H侵染人參根片，誘導(dǎo)出過量表達(dá)D12H 且人參皂苷產(chǎn)量提高的人參發(fā)根系Pg-pBI121-D12H，從而實(shí)現(xiàn)通過過量表達(dá)人參皂苷合成 關(guān)鍵酶基因從而提高人參皂苷含量的目的。
【附圖說明】
[0009] 圖1是人參基因D12HPCR擴(kuò)增后電泳圖。
[0010] 圖2是重組質(zhì)粒pBI121-D12H的菌落PCR鑒定電泳圖。
[0011] 圖3是重組質(zhì)粒PBI121-D12H雙酶切鑒定電泳圖。
[0012] 圖4是過量表達(dá)工程菌A4-pBI121-D12H菌落PCR電泳圖。其中：
[0013] 1 :A4-pBI121-D12H;2 :陰性對(duì)照組。
[0014] 圖5是誘導(dǎo)成功的人參發(fā)根Pg-pBI121-D12H。
[0015]圖 6 是人參發(fā)根Pg-pBI121-D12H的鑒定圖。其中：1 :Pg-pBI121-D12H的NPTII 擴(kuò)增；2 :pBI121的NPTII擴(kuò)增。
[0016] 圖7是人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖。 圖8是對(duì)照組人參發(fā)根與過量表達(dá)組人參發(fā)根Pg-pBI121-D12H人參皂苷含量對(duì)比圖。 其中：a:對(duì)照組；b:過量表達(dá)組Pg-pBI121-D12H。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0018] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0019] 下述實(shí)施例中所用的各種試劑盒、酶均購于寶生物工程（大連）有限公司，PBI121 植物雙元表達(dá)載體，大腸桿菌JM109購于北京鼎國生物制品有限公司。
[0020] 實(shí)施例1 :構(gòu)建人參基因D12H植物過量表達(dá)載體pBI121-D12H
[0021] (1)D12H基因引物設(shè)計(jì)與合成
[0022] 根據(jù)GenBank已登錄的原人參二醇合成酶基因（JN604536)的序列，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)人參基因D12H上下游引物，并在上下游引物5'端分別添加酶切位點(diǎn) BamHI和SacI，上下游引物如下：
[0023]D12H-BamHI-F:5' -CGGGATCCATGGCAGCAGCAATGGTG-3'
[0024]D12H-SacI-R:5，-CGAGCTCTTAATTGTGGGGATGTAGAT-3 '
[0025]引物由武漢金開瑞生物有限公司合成。
[0026] (2)D12H基因的擴(kuò)增
[0027] 以人參發(fā)根（吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院生物工程系實(shí)驗(yàn)室保存）為原材料， 按照RNA提取試劑盒的操作說明提取人參的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。 以〇0嫩為模板，以01211-831111114,01211-53(31-1?為引物擴(kuò)增人參01211基因。？0?擴(kuò)增反應(yīng) 體系（25y1 體系）：模板RT-PCR產(chǎn)物 1y1 ;10XBuffer2. 5y1;dNTPMix1y1 ;上游引 物 1y1 ;下游引物 1y1;TaqDNA聚合酶 0? 2y1 ;ddH20 18. 3y1。
[0028]PCR儀擴(kuò)增程序設(shè)定是：l)94°C，8min;2)94°C，30s;3)60°C，30s;4)72°C，lmin; 5) 72°C，8min;6) 4°C，保存。循環(huán)從2)到4)，循環(huán)數(shù)32個(gè)。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行瓊 脂糖凝膠電泳檢測，獲得了 1461bp的人參D12H基因片段，如圖1所示在1461bp左右有特 異性目的條帶與人參D12H基因的長度相同，說明成功的擴(kuò)增了人參D12H基因。人參基因 D12H的堿基序列（1461bp)參見序列表。
[0029] (3)人參過量表達(dá)載體pBI121-D12H重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0030] 使用pBI121質(zhì)粒構(gòu)建人參D12H基因的過量表達(dá)載體。pBI121是雙元植物表達(dá)載 體，片段長度為14kb。含有組成型啟動(dòng)子CaMV35S，啟動(dòng)子下游有可用于插入基因片段的 多克隆位點(diǎn)?？剐赃x擇標(biāo)記基因?yàn)樾旅顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶基因NPTII，表現(xiàn)為卡那霉素抗性，可 對(duì)重組質(zhì)粒、組織或植株進(jìn)行抗性篩選。
[0031] 提取pBI121質(zhì)粒進(jìn)行過量表達(dá)載體的構(gòu)建，對(duì)人參D12H基因克隆時(shí)已經(jīng)在目的 片段兩端添加了酶切位點(diǎn)BamHI和SacI，pBI121質(zhì)粒中也存在同樣的酶切位點(diǎn)。對(duì)目的 基因片段和PBI121質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。質(zhì)粒酶切反應(yīng)體系：20y1體系，pBI121質(zhì)粒5y1 ; BamHI(15U/yl)lyl;SacI(15U/yl)lyl;0.5XKBufferlyl;ddH20 12yl。目的基 因D12H酶切反應(yīng)體系：20yl體系，D12H基因lyl;BamHI(15U/yl)lyl;SacI(15U/ yl)lyl;0.5XKBufferlyl;ddH20 16yl。酶切反應(yīng)條件：溫度，37°C;時(shí)間，3h。充分 酶切后，進(jìn)行1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用切膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。
[0032] 在T4DNA連接酶的作用下對(duì)經(jīng)過雙酶切后切膠回收的pBI121質(zhì)粒和雙酶切后的 D12H基因進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系：20y1體系，D12H酶切產(chǎn)物12y1 ;pBI121酶切產(chǎn)物 1y1 ;10XDNALigaseBuffer2y1 ;T4DNALigase1y1 ;ddH20 4y1。反應(yīng)條件：16。(：連 接過夜。本連接體系中所選擇的酶切后的質(zhì)粒與目的基因摩爾比為10 :1。
[0033] 將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)方法如下：取出 在-70°C保存的JM109感受態(tài)細(xì)胞，放在冰浴中使其融化；取100y1感受態(tài)細(xì)胞，加入上 述連接產(chǎn)物，放置于1. 5ml離心管中，冰浴30min;將離心管放在42°C水浴鍋中，熱激90s， 迅速冰浴5min;向離心管中加入800y1無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，混勾。置于培養(yǎng)箱中 37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)2h。培養(yǎng)結(jié)束后，8000rpm離心lmi