一種從雞軟骨中提取純凈Ⅱ型膠原的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從雞軟骨中提取純凈II型膠原的方法，屬于生物醫(yī)學(xué)材料的制備領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]II型膠原是構(gòu)成軟骨和玻璃體的主要成分，對(duì)軟骨細(xì)胞的發(fā)生、分化、迀移具有誘導(dǎo)作用，有利于關(guān)節(jié)軟骨的再生、維持關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)結(jié)構(gòu)和抗張力強(qiáng)度。II型膠原特有的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成，使其在生物醫(yī)學(xué)材料、組織工程、包裝材料、化妝品及保健食品等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，特別是針對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的防治具有很好的免疫調(diào)節(jié)功效。國(guó)內(nèi)外長(zhǎng)期的研究表明，II型膠原是軟骨組織工程中重要的支架材料，在軟骨組織修復(fù)、重建方面起著至關(guān)重要的作用(Chih-Sheng Ko, Ju1-Pin Huang, et al.Type II collagen-chondroitinsulfate-hyaluronan scaffold cross-linked by genipin for cartilage tissueengineering.B1science and B1engineering, 2009, 107 (2): 177-182)。類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性、全身性、系統(tǒng)性的自身免疫性疾病，II型膠原是在臨床治療RA研究過(guò)程中開(kāi)發(fā)出的一種免疫耐受制劑(徐建華，徐盛前，王芬等，雞II型膠原雙盲隨機(jī)對(duì)照治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究，中國(guó)藥物與臨床，2006，6 (6):433-437 ;Wei Zhao1Wei Wei, etal.Chicken type II collagen induced immune tolerance of mesenteric lymph nodelymphocytes by enhancing beta2_adrenergic receptor desensitizat1n in rats withcollagen-1nduced arthritis, Internat1nal Immunopharmacology, 2011, 11:12-18)，丨臨床顯示，口服II型膠原蛋白能改善類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎并減輕其疼痛，從而有效改善關(guān)節(jié)病及骨質(zhì)疏松癥。
[0003]軟骨是一個(gè)基本組織，但至今我們還沒(méi)有可行的方法制造人工替換軟骨，3D打印技術(shù)有望制造人造軟骨，II型膠原蛋白作為軟骨組織的主要成分，其優(yōu)良生理生化特性必將成為3D打印材料的首選(Kajsa Markstedt, Athanas1s Mantas, etal.3D B1printing Human Chondrocytes with Nanocellulose-Alginate B1ink forCartilage Tissue Engineering Applicat1ns, 2015，16:1489-1496)。雞軟骨主要成分有蛋白多糖、膠原蛋白、無(wú)機(jī)成分等，其中膠原的類(lèi)型包括II型、IX型、X型、XI型。II型膠原是由三條相同的aj II )鏈組成的均相三聚體，αι( II )鏈的相對(duì)分子量約為130kD(曹慧，許時(shí)嬰，雞關(guān)節(jié)軟骨II型膠原的制備，2007，28(04): 148-152)，屬于膠原家族中的成纖維膠原。IX型膠原是一種纖維相關(guān)膠原，由aJIX)、Q2(IX), Q3(IX)三條不同a鏈構(gòu)成的異相三聚體，Ci1(IX)鏈?zhǔn)呛?20個(gè)氨基酸殘基的多肽分子，其相對(duì)分子量約為 90kD (George Vas1s, Ichiro Nishimura, et al.cartilage type IXcollagen-proteoglycan contains a large amino-terminal globular domain encodedby multiple exons, 1988，263 (5): 2324-2329)，a 2 (IX)和 a 3 (IX)相對(duì) Q1(K)鏈的長(zhǎng)度和相對(duì)分子量都要小。X型膠原是由三條相同的a i ( X )鏈組成的均相三聚體，a i ( X )鏈的相對(duì)分子量約為 45kD (Alvin P.L.Kwan, Christine E.Cummings, et al.macromolecularorganizat1n of chicken type X collagen in vitro, 1991，114(3):597-604)，X型膠原是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)膠原，起十分重要的穩(wěn)定作用。XI型膠原是由3條不同α鏈構(gòu)成的αι(ΧΙ)、Q2(XI), Q3(XI)異相三聚體，Ci1(XI)鏈?zhǔn)怯?806個(gè)氨基酸殘基組成的多肽分子，其相對(duì)分子量為181.07kD，而Q2(XI)鏈和Q3(XI)鏈比a i ( XI)鏈少幾十個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子量也較小。
[0004]國(guó)內(nèi)外提取II型膠原的主要來(lái)源是牛、豬等，本發(fā)明考慮我國(guó)是禽類(lèi)養(yǎng)殖大國(guó)，最近幾年禽類(lèi)國(guó)內(nèi)產(chǎn)量供大于求，充裕的滿(mǎn)足了本國(guó)人民的需求，這也就允許大規(guī)模生產(chǎn)有豐富的來(lái)源(張帥，朱增勇，中國(guó)畜產(chǎn)品貿(mào)易及國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)價(jià)格比較分析，中國(guó)畜牧業(yè)，2015，I, 38-40)。
[0005]目前國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道了多種提取膠原的方法，但是由于II型膠原提取方法復(fù)雜，大多提取產(chǎn)物都是混合物或粗提物。曹慧等在《食品科學(xué)》2007年第28卷第4期上發(fā)表的“雞關(guān)節(jié)軟骨II型膠原的制備” 一文中，采用的離子交換色譜法和水洗法都無(wú)法除去IX型、X型、XI型膠原，因此制備得到的膠原類(lèi)型不單一；授權(quán)號(hào)為CN102154425B的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利“非變性II型膠原蛋白生產(chǎn)方法”采用了中性條件下鹽析，鹽析后得到的是不同類(lèi)型膠原，去離子水洗滌能純化膠原蛋白，但無(wú)法除去II型膠原中的其他類(lèi)型膠原，因此所得II型膠原中同樣含有其他類(lèi)型膠原。綜合相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，各提取方法實(shí)際上所得到的II型膠原還含有其他類(lèi)型的膠原，如K型、X型、XI型，沒(méi)有達(dá)到真正的純度，正因?yàn)镮I型膠原、IX型、X型、XI型分子量大小相差較大，運(yùn)用聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳方法可以定性分析II型膠原中是否含有IX型膠原、X型膠原、XI型膠原。本發(fā)明采用不同鹽濃度分級(jí)提取，分步去除IX型、X型、XI型膠原，提取出純凈的II型膠原具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足而提供一種從雞軟骨中提取純凈II型膠原的方法，其特點(diǎn)是該方法制備出的II型膠原純度高、生物活性高、理化性能穩(wěn)定，同時(shí)本方法操作簡(jiǎn)單，有利規(guī)?；a(chǎn)。
[0007]本發(fā)明的目的由以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)，其中所述原料份數(shù)除特殊說(shuō)明外，均為重量份數(shù)。
[0008]從雞軟骨中提取純凈II型膠原的方法包括以下步驟:
[0009]I)軟骨的預(yù)處理
[0010]將新鮮的雞軟骨表面剔除其他非軟骨成分，取100-200份，用生理鹽水洗滌，加入脫脂液浸泡，每隔10_15h更換一次，24-60h后倒掉，用冷水清洗3-5次，再將軟骨浸泡于冷水中過(guò)夜，取出搗碎，得到軟骨漿液；
[0011]2)雜蛋白的去除
[0012]去除可溶性蛋白:配制4mol/L NaCl-0.05mol/L Tris-HCl混合溶液HI, pH為7.5，在步驟I)中得到的軟骨漿液里加入上述配制的混合溶液H1，料液比為1:5-25，攪拌12-36h，離心處理，留下沉淀，冷水反復(fù)清洗3-5次，得到沉淀物；
[0013]去除不溶性蛋白:配制4mol/L鹽酸胍-0.05mol/L Tris - HCl混合溶液H2，pH為7.5，在上述沉淀物中加入配好的混合溶液H2，料液比為1:10-40，混勻攪拌，12_36h后離心取出固體物質(zhì)，冷水反復(fù)清洗3-5次，得到固體物質(zhì)；
[0014]3)胃蛋白酶酶解
[0015]配制稀醋酸溶液，在步驟2)中得到的固體物質(zhì)里加入適量稀醋酸溶液，料液比為I: 5-20，混合均勻后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為l_2wt%胃蛋白酶，攪拌24-72h，離心取上清液，沉淀反復(fù)酶解，直至無(wú)沉淀，得到上清液；
[0016]4) II型膠原的提取、純化
[0017]去除IX型膠原:將步驟3)中得到的上清液用2mol/L醋酸調(diào)節(jié)pH至2.5-3.5，加入固體NaCl至最終濃度為3-4.2mol/L，攪拌l_2h，靜置過(guò)夜，離心處理，得到沉淀SI ;
[0018]去除X型膠原:沉淀SI溶于稀醋酸，調(diào)節(jié)pH至2.5-3.5，加入固體NaCl至最終濃度為1.2-2.0mol/L，攪拌l_2h，靜置過(guò)夜，離心處理，得到沉淀S2 ;
[0019]去除XI型膠原:沉淀S2溶于稀醋酸，調(diào)節(jié)pH至2.5-3.5，加入固體NaCl至最終濃度為0.8-1.0mol/L，攪拌l_2h，靜置過(guò)夜，離心處理，得到沉淀S3 ;
[0020]沉淀S3溶于稀醋酸，調(diào)節(jié)pH至2.5-3.5，加入固體NaCl至最終濃度為
0.8-1.0mol/L,重復(fù)此操作2-5次，即得II型膠原提取液；將得到的II型膠原提取液灌入透析袋，用l-5mmol/L醋酸充分透析，得純凈的II型膠原；
[0021]5)以上步驟中除特殊說(shuō)明外，均在溫度15°C以下進(jìn)行。
[0022]所述雞軟骨為雞胸軟骨、雞關(guān)節(jié)軟骨。
[0023]所述脫脂劑為氯仿和甲醇，所述氯仿和甲醇的體積比為1: