一種硅酸鹽細菌培養(yǎng)基及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種培養(yǎng)基，特別設(shè)及一種用于娃酸鹽細菌增菌培養(yǎng)的廉價培養(yǎng)基。 本發(fā)明屬于微生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鐘是農(nóng)作物生長必需營養(yǎng)元素之一（QiokriHafsi,AhmedDebez,QiedlyAbdelly, 2014,Potassiumdeficiencyinplants:effectsandsignalingcascades[J].ActaPhy siologiaePlantarum, 36(5) : 1055-1070.)，在植物光合作用、碳水化合物的代謝、蛋白質(zhì)合 成等過程均有參與，是促進農(nóng)作物生長及影響其產(chǎn)量與品質(zhì)的一個重要營養(yǎng)元素。（孫德 四，尹健美，陳嘩，曹飛.鐘礦物晶體結(jié)構(gòu)對黑曲霉生長代謝及鐘與娃的溶出影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014, 03:503-513.)但在±壤中有95 %的鐘為礦物鐘的形態(tài)，大部分存在 于鐘長石和云母之中，可供作物吸收利用的速效性鐘不超過全鐘2% (史靜靜，劉靜洋，韓 國民，楊恩東，孫樂妮，唐欣構(gòu).棉花根際解鐘細菌的生理活性和促生效果[J].中國± 壤與肥料，2012, 04:87-90.)，運導(dǎo)致了我國耕地普遍缺鐘，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中對鐘肥的需求量 一直居高不下。作為鐘肥的消耗大國，我國鐘肥消耗量約占全世界的14. 7%，但由于出產(chǎn)量 較小并不能滿足國內(nèi)需求，所W農(nóng)業(yè)供給主要依靠國外進口。
[0003] 據(jù)相關(guān)研究表明娃酸鹽細菌能夠?qū)⒋嬖谟凇廊乐械墓袒療o效鐘轉(zhuǎn)化為速效鐘，若 能大面積推廣應(yīng)用，在解決農(nóng)作物缺鐘現(xiàn)象、降低進口成本、減輕使用化學(xué)肥料對環(huán)境的傷 害等方面將具有巨大的意義。但盡管娃酸鹽細菌在生物肥料制備方面表現(xiàn)出了良好的潛 力，可是由于培養(yǎng)原材料成本過高，其在發(fā)酵生產(chǎn)過程中的價格將會是普通化肥的數(shù)倍，高 昂的價格成為了限制其推廣與應(yīng)用的重要原因。如何尋找一種廉價易得的發(fā)酵原料W降低 生產(chǎn)成本是解決運一問題的關(guān)鍵所在。
[0004] 我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)在近些年來得到較大的發(fā)展，生產(chǎn)向規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化、產(chǎn)業(yè)化和 集約化轉(zhuǎn)變的步伐逐步加快（林源，馬撰，秦富.中國畜禽糞便資源結(jié)構(gòu)分布及發(fā)展 展望[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2012,32:1-5.)。蓬勃發(fā)展的畜禽養(yǎng)殖業(yè)在為人們提供豐富食 品的同時其養(yǎng)殖中產(chǎn)生的糞污也對環(huán)境造成了極大的污染，如不妥善處置會造成±壤、 水質(zhì)及空氣等生態(tài)環(huán)境污染，并對動物及人類健康構(gòu)成威脅（霍書豪，董仁杰，龐昌 樂，張萬欽，崔鳳杰，鄒彬，錢靜亞.畜牧業(yè)糞污減量與資源化利用的實現(xiàn)[J].中國 沼氣，2014, 05:29-32巧1.)。但是糞污雖然是環(huán)境污染物，但其本身卻含有豐富的營養(yǎng) 物質(zhì)（RamasamyRajeshKum曰r,Bon邑JuP曰rk,JaeYoun邑Cho. 2013.Applicationand environmentalrisksoflivestockmanure[J].JournaloftheKoreanSocietyfor AppliedBiologicalQiemistry, 56巧）：497-503.)，可為微生物提供適宜的生長環(huán)境。合 理使用糞污既可作為發(fā)酵溫床生產(chǎn)有益微生物又可通過生物降解解決污染問題，不但使糞 污變廢為寶，實現(xiàn)其剩余價值，還可節(jié)約大量用于治理環(huán)境污染的資源。 陽0化]鑒于此，本發(fā)明雞糞"作為發(fā)酵底物通過響應(yīng)面實驗對娃酸鹽細菌的發(fā)酵條件 進行研究，W期提供一種能夠用于娃酸鹽細菌增菌培養(yǎng)的廉價培養(yǎng)基，從而降低娃酸鹽細 菌的生產(chǎn)成本并提高菌體生產(chǎn)量，為進一步降低微生物菌肥生產(chǎn)價格提供技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠用于娃酸鹽細菌增菌培養(yǎng)的廉價培 養(yǎng)基及其制備方法和用途，該培養(yǎng)基W雞糞作為培養(yǎng)基的碳氮源（發(fā)酵底物），粉碎賴桿作 為菌株吸附劑，在保證娃酸鹽細菌生物量的同時能夠?qū)崿F(xiàn)降低發(fā)酵成本運一目的。
[0007] 為了達到上述目的，本發(fā)明采用了W下技術(shù)手段：
[0008] 本發(fā)明提供的一種娃酸鹽細菌培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基通過W下步驟制備 得到：
[0009] (1)稱取雞糞W及粉碎賴桿于容器中混合均勻，其中雞糞與粉碎賴桿的重量比為 1-3:1 ；
[0010] 似使用淀粉調(diào)節(jié)步驟（1)混合物的碳氮比為19-31:l，WFe(0H)3為抑調(diào)理劑， Fe(OH)3的添加量為 0-2.0% (w/w);
[0011] (3)調(diào)節(jié)步驟（2)混合物的含水量為50-70% (w/w); 陽 01引（4)120。(：滅菌2〇-3〇111111，即得。
[0013] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述雞糞與粉碎賴桿的重量比為2:1。
[0014] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，調(diào)節(jié)步驟（2)混合物的含水量為60% (w/w)。
[0015] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，使用淀粉調(diào)節(jié)混合物碳氮比為19:1。
[0016] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，F(xiàn)e(OH)S的添加量為0.5% (w/w)。
[0017] 進一步的，本發(fā)明還提出了W上任一項所述的培養(yǎng)基在培養(yǎng)娃酸鹽細菌中的應(yīng) 用。
[0018] 更進一步的，本發(fā)明提出了一種培養(yǎng)娃酸鹽細菌的方法，包括將娃酸鹽細菌種子 液接種于W上任一項所述的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為8-2她，培養(yǎng)溫度為20-40°C。
[0019] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的娃酸鹽細菌為PlantibacterSP.WZW03,保藏在中國 典型培養(yǎng)物保藏中屯、，地址在武漢大學(xué)，其微生物保藏號是CCTCCN0.M2014569,保藏日期 為2014年11月18日。
[0020] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述培養(yǎng)時間為20. 3化，培養(yǎng)溫度為29. 87°C。
[0021] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基中雞糞與粉碎賴桿的重量比為2:1，使用淀粉調(diào) 節(jié)混合物碳氮比為19:l，F(xiàn)e(0H)3的添加量為0. 5% (w/w)，調(diào)節(jié)混合物的含水量為60% (w/ W)O
[0022] 娃酸鹽細菌PlantibacterSP.WZW03為本發(fā)明人從植物根系±壤中分離出一株 娃酸鹽細菌，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其具有較強的解鐘能力，可分泌嗎I噪乙酸，施用后能明顯增加西瓜 幼苗的地下部干重、須根數(shù)、根系長度等，且定植能力良好，對促進根系生長、優(yōu)化根系結(jié)構(gòu) 都有明顯的作用。（該菌株已記載在申請?zhí)枮?01410798227. 5,發(fā)明名稱為"分離獲得的 放線菌屬細菌WZW03菌株及其在緩解西瓜連作障礙方面的應(yīng)用"的專利申請中。）但盡管 WZW03在生物肥料制備方面表現(xiàn)出了良好的潛力，可是由于培養(yǎng)原材料成本過高，其在發(fā)酵 生產(chǎn)過程中的價格將會是普通化肥的數(shù)倍，高昂的價格成為了限制其推廣與應(yīng)用的重要原 因。而本發(fā)明的提出為該菌的培養(yǎng)提供了一種廉價易得的發(fā)酵原料，極大的降低了生產(chǎn)成 本。
[0023] 本發(fā)明人W從植物的根際±壤中獲得的具有植物促生功能的菌株娃酸鹽細菌 PlantibacterSP.WZW03 (簡稱"WZW03")為待優(yōu)化菌株，培養(yǎng)基采用低值發(fā)酵法，W20g雞 糞作為培養(yǎng)基的碳氮源，IOg粉碎賴桿作為菌株吸附劑，于250mlS角瓶中混合均勻，使用 淀粉調(diào)節(jié)碳氮比為25:1，W化(OH)3為抑調(diào)理劑，添加量為1. 0% (w/w)，最后調(diào)節(jié)混合物 含水量到60% (w/w)，12(TC滅菌20-30min。而后將種子液按2% (v/v)的接種量接種于 培養(yǎng)基中，并W此培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)，研究雞糞培養(yǎng)基的碳氮比，培養(yǎng)時間，培養(yǎng)溫度，抑調(diào)理 劑添加量四種因素對生物數(shù)量的影響。采用響應(yīng)面分析法對培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化，W單因 素實驗最佳水平區(qū)間作為基點對四種因素進行響應(yīng)面實驗設(shè)計，根據(jù)Box-Behnken的中屯、 組合設(shè)計原理，設(shè)定培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、碳氮比、抑調(diào)理劑四個因素作為自變量，W微生物 生長數(shù)量作為響應(yīng)值，進行四因素立水平響應(yīng)面分析實驗，并通過Design-Exp&rt軟件對 試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，確定雞糞培養(yǎng)基最優(yōu)配方。研究結(jié)果顯示，經(jīng)過單因素和響應(yīng)面試 驗后，最終確定培養(yǎng)基最終優(yōu)化結(jié)果為：培養(yǎng)時間20. 3化、培養(yǎng)溫度29. 87°C、碳氮比19:1、 Fe(OH)S添加量0.5% (w/w)。W此優(yōu)化條件進行發(fā)酵后，活菌數(shù)最大產(chǎn)量為1.47X109c化/ ml,經(jīng)驗證基本符合響應(yīng)面預(yù)測值。由陳育如等人研究結(jié)果可知（陳育如，楊啟銀.解鐘娃 酸鹽細菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的研究[J].南京師大學(xué)報（自然科學(xué)版），2001,03:88-92.)， 其優(yōu)化后的娃酸鹽細菌培養(yǎng)基最大活菌產(chǎn)量為1. 06XIO9C化/ml,相比而言，本發(fā)明培養(yǎng)基 在活菌產(chǎn)量上提升了 33. 96%，具有較好的生物產(chǎn)量。為檢驗廉價培養(yǎng)基的優(yōu)勢性，本發(fā)明 對娃酸鹽細菌在本發(fā)明的廉價培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基上的生長情況進行比較，結(jié)果顯示，菌 株于優(yōu)化后的廉價培養(yǎng)基上培養(yǎng)2化后，其活菌數(shù)達到最大值1. 47XIO9C化/ml,普通培養(yǎng) 基培養(yǎng)3化后達到最大活菌數(shù)達到6XIO7C化/ml,培養(yǎng)時間縮短12h，生物量提升了 24. 5 倍，按照市場價格計算，每生產(chǎn)1. 47Xl〇iic化，普通培養(yǎng)基花費為0. 1323元，而廉價培養(yǎng)基 只需0. 0145元，成本降低了 9. 12倍，大大節(jié)約了生產(chǎn)投入。
[0024] 綜上所述，本發(fā)明提供了一種用于娃酸鹽細菌培養(yǎng)的廉價培養(yǎng)基，同時利用響應(yīng) 面法對廉價培養(yǎng)基的組成及對PlantibacterSP.WZW03菌株的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，確定最 優(yōu)配方組成為培養(yǎng)時間20. 3化、培養(yǎng)溫度29. 87°C、碳氮比19:UFe(OH)3添加量0. 5% (w/ W)，經(jīng)驗證后其最大生物產(chǎn)量為1. 47XIO9C化/ml，相較于WZW03菌株的普通培養(yǎng)基，本發(fā)明 的廉價培養(yǎng)基能明顯提高菌體產(chǎn)量，縮短發(fā)酵周期，大幅降低生產(chǎn)成本，為生物菌肥產(chǎn)業(yè)化 應(yīng)用提供重要參考數(shù)據(jù)。
【附圖說明】 陽0巧]圖1為單因素優(yōu)化區(qū)間；
[0026] 圖2為響應(yīng)面立體分析圖；
[0027] 圖3為不同培養(yǎng)基生物量比較圖。
【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實施例和附圖來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著 描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技 術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可W對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形 式進行修改或替換，但運些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0029] 實施例I用于娃酸鹽細菌培養(yǎng)的廉價培養(yǎng)基的優(yōu)化及應(yīng)用
[0030] 1材料與方法
[0031] 1. 1 菌種 W巧從植物的根際±壤中獲得具有植物促生功能的娃酸鹽細菌=Plantibacter SP.WZW03 (簡稱"WZW03 ")，該菌株保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，地址在武漢大學(xué)，其微 生物保藏號是CCTCCNO.M2014569,保藏日期為2014年11月18日，該菌株已記載在申請 號為201410798227. 5,發(fā)明名稱為"分離獲得的放線菌屬細菌WZW03菌株及其在緩解西瓜 連作障礙方面的應(yīng)用"的專利申請中，由齊齊哈爾大學(xué)篩選并保藏。
[0033] 1. 2培養(yǎng)基 W34]LB液體培養(yǎng)基：蛋白腺10.OOg,酵母膏5.OOg,化Cl8.OOg,蒸饋水定容至 1000.OOml。
[0035] 細菌平板培養(yǎng)基：薦糖 0. 50g，CaC〇3 0.IOg,胞2冊〇4 0. 50g，F(xiàn)eCls0. 05g，M拆〇4 0. 50g，鐘長