一株高產(chǎn)耐酸性高溫α-淀粉酶的菌株及其液體發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一株高產(chǎn)高溫淀粉酶的菌株及其液體發(fā) 酵方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] a-淀粉酶是工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的酶制劑之一，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)常用的淀粉酶一般 為中溫a-淀粉酶和耐高溫a-淀粉酶，其適用抑在6-7之間，大部分存在熱穩(wěn)定性差和 抑范圍窄的缺陷，對(duì)酸性條件下的淀粉深加工工藝存在局限性。
[0003] 淀粉產(chǎn)品深加工一般包括兩個(gè)過程：液化及糖化。首先液化需要在105°c條件下 糊化形成淀粉糊，再經(jīng)淀粉酶液化，之后在50°C-60°C溫度范圍內(nèi)由葡萄糖淀粉酶作用下 糖化；除了作用溫度不同外，在液化和糖化兩個(gè)過程中所需的兩種酶：a-淀粉酶和糖化酶 的作用抑也有顯著差異。耐酸性高溫a-淀粉酶可W省去淀粉糊化到液化的冷卻過程，減 少大量的能源消耗，提高液化速度，方便從液化到糖化過程的抑調(diào)節(jié)，簡(jiǎn)化工序，降低生產(chǎn) 成本。
[0004] 耐酸性高溫a-淀粉酶是在酸性和高溫條件下將淀粉水解的酶類，其在酸性和高 溫條件下具有良好的酶學(xué)穩(wěn)定性，可廣泛應(yīng)用于食品加工、釀酒、紡織等多個(gè)行業(yè)。 陽(yáng)0化]中國(guó)專利CN102363761A公開了一種產(chǎn)耐高溫a-淀粉酶菌種的優(yōu)化方法，采用 地衣芽抱桿菌10181從菌種活化、菌種擴(kuò)培到發(fā)酵提取整個(gè)過程進(jìn)行優(yōu)化，該菌種所產(chǎn)的 耐高溫a-淀粉酶其酶活一般在2500u/ml，耐受溫度為95°C;中國(guó)專利CN101838635A公 開了一種耐高溫淀粉酶的制備方法，將地衣芽抱桿菌進(jìn)行菌種復(fù)壯培養(yǎng)、種子培養(yǎng)，經(jīng)液體 深層發(fā)酵而成的耐高溫a-淀粉酶其酶活力高達(dá)20000-22000u/ml，耐受溫度高達(dá)Iior; 中國(guó)專利CN100415879C公開了耐酸耐高溫的a-淀粉酶及其制備方法，用重組DNA技術(shù)定 點(diǎn)突變前體a-淀粉酶，從微生物特別是地衣芽抱桿菌中分離前體a-淀粉酶基因，對(duì)其 L134及S320的氨基酸殘基進(jìn)行突變，并在大腸桿菌、枯草芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌等細(xì)菌 中高效表達(dá)a-淀粉酶突變體，較適宜在枯草芽抱桿菌中表達(dá)，使耐酸pH4. 0-4. 5、且高溫 70-90°C的a-淀粉酶得W高效表達(dá)，a-淀粉酶突變體具有良好的酸穩(wěn)定性，更適于工業(yè) 化應(yīng)用，為耐酸性、耐高溫a-淀粉酶的工業(yè)化大生產(chǎn)提供了一條可行途徑。
[0006] 如上所述，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，會(huì)有更多的分離菌、誘變菌、基因工程菌及其組 合會(huì)應(yīng)用到耐高溫a-淀粉酶的生產(chǎn)中來，W滿足日益增長(zhǎng)的工業(yè)化生產(chǎn)需求。
[0007] 為了降低生產(chǎn)成本、拓展作用條件及范圍，滿足市場(chǎng)需求，需要開發(fā)或者優(yōu)化出一 株產(chǎn)酶活力高、生產(chǎn)穩(wěn)定性好、適應(yīng)強(qiáng)的生產(chǎn)菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0008] 本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)耐酸性高溫a-淀粉酶的菌株及其液體發(fā)酵方法。 陽(yáng)009] 本發(fā)明提供的高產(chǎn)耐酸性高溫a-淀粉酶的菌株具體為地衣芽抱桿菌度acillus Iicheni化rmis)突變株M6-X3。該菌株已于2015年5月7日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中屯、，地址位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，（郵編100101)， 保藏編號(hào)為CGMCCNO. 10785。
[0010] 所述地衣芽抱桿菌突變株CGMCCNO. 10785采用地衣芽抱桿菌B307進(jìn)行常壓室溫 等離子體（ART巧誘變選育獲得。地衣芽抱桿菌B307的液體發(fā)酵酶活最高為1600〇11/111以突 變株M6-X3的液體發(fā)酵酶活力可達(dá)到2686〇11/111以經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化，平均發(fā)酵液酶活力可達(dá) 到 42470u/mL。
[0011] 地衣芽抱桿菌突變株CGMCCNO. 10785為革蘭氏陽(yáng)性菌，兼性好氧，生長(zhǎng)溫度為 25°C-50°C，細(xì)胞形態(tài)呈桿狀，單生，牛肉膏蛋白腺培養(yǎng)基上菌落呈白色，圓形，表面粗糖，不 透明。明膠液化、淀粉水解和VP試驗(yàn)均為陽(yáng)性。
[0012] 地衣芽抱桿菌B307液體發(fā)酵周期長(zhǎng)，菌體濃度低，為得到一株高產(chǎn)耐酸性高溫 a-淀粉酶的菌株，對(duì)其進(jìn)行多輪常壓室溫等離子體誘變，直到選育出一株代謝旺盛，生長(zhǎng) 繁殖速度快，適宜高密度培養(yǎng)，高產(chǎn)耐酸性高溫a-淀粉酶的菌株。
[0013] 地衣芽抱桿菌CGMCCNO. 10785液體發(fā)酵產(chǎn)耐酸性高溫a-淀粉酶的方法，包括如 下步驟：
[0014] 種子培養(yǎng)：pH在6. 0-6. 5,培養(yǎng)溫度34°C-40°C，培養(yǎng)時(shí)間11-16小時(shí)；
[0015]種子培養(yǎng)基組成：麥芽糊精3-4%，酵母粉0. 2-0. 3 %，氯化巧0. 2-0. 3 %，硫酸錠 0. 8-1. 0%，蛋白腺 0. 5-0. 6%，憐酸氨二鋼 0. 4-0. 5%，P冊(cè).0-6. 5。
[0016] 液體發(fā)酵：
[0017] 接種量3-5 %接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為：p冊(cè).0-6. 5,培養(yǎng)溫度35-40°C，罐 壓0. 07MPa，溶氧在30 % -40 %，轉(zhuǎn)速200-80化pm，發(fā)酵期間抑高于6. 5開始補(bǔ)料，補(bǔ)料控 制抑在6. 0-6. 5,菌體自溶嚴(yán)重時(shí)發(fā)酵結(jié)束，培養(yǎng)周期130-160小時(shí)。
[0018] 發(fā)酵培養(yǎng)基組成：木馨淀粉6-8%，豆餅粉6-7%，玉米漿1-3%，憐酸氨二錠 0. 1-0. 3%，氯化巧 0. 5-1. 0%，P冊(cè).0-6. 5。
[0019] 補(bǔ)料培養(yǎng)基組成：麥芽糖30-40%，憐酸二氨鋼0. 5-1. 0%，氯化巧0. 5-1. 0%，pH 在 5. 0-5. 5。
[0020] 有益效果：
[0021] 本發(fā)明通過對(duì)原始菌株進(jìn)行常壓室溫等離子體誘變，再經(jīng)發(fā)酵工藝優(yōu)化和發(fā)酵培 養(yǎng)基優(yōu)化，建立了液體發(fā)酵生產(chǎn)耐酸性高溫a-淀粉酶的方法，發(fā)酵酶活力在3. 8萬-4. 2 萬u/ml。生產(chǎn)的耐酸性高溫a-淀粉酶的最適抑為4.0-5.0，最適溫度反應(yīng)為96-100°(：， 在95°C的條件保溫化，剩余酶活力為95%，具有穩(wěn)定的耐酸和耐高溫特性，可廣泛用于淀 粉加工、啤酒釀造、酒精、發(fā)酵及紡織等多個(gè)行業(yè)。
【附圖說明】： 陽(yáng)02引圖1不同抑下的相對(duì)酶
[0023] 圖2不同溫度下的相對(duì)酶活
[0024] 圖3 95 °C保溫處理的相對(duì)酶活
【具體實(shí)施方式】：
[00巧]W下通過具體實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明，具體實(shí)施案例僅為舉例說明，不作 為對(duì)本發(fā)明實(shí)施范圍的限定。
[0026] 實(shí)施例1菌株的選育
[0027] 1.菌懸液的制備
[002引 吸取地衣芽抱桿菌B307種子液IOmL于離屯、管，800化pm離屯、5min，棄上清，菌體 WIOmL生理鹽水清洗。相同條件離屯、2次，沉淀的菌體W2mL無菌水重懸即為菌懸液，菌 懸液濃度在107個(gè)/mL。
[0029] 2.常壓室溫等離子體誘變
[0030] 吸取10yL菌懸液于載片上，用綴子將載片放于常壓室溫等離子體系統(tǒng)操作室旋 轉(zhuǎn)臺(tái)上，緩慢調(diào)節(jié)升降臺(tái)旋鈕（參考升降臺(tái)標(biāo)尺）將載片與發(fā)生器間距約為2mm，誘變照射 時(shí)間選擇30s、35s、40s。誘變完成后，將載片移至分裝有1血生理鹽水的EP管中，用縱滿振 蕩器搖勻后進(jìn)行適當(dāng)稀釋。取100yL涂布于淀粉篩選板上，30°C培養(yǎng)36h，長(zhǎng)出單菌落后挑 取菌落肥值（肥值=水解圈直徑/菌落直徑）高的菌株，分別是M6-X3、M6-22、M6-37。
[0031] 3.誘變菌株的搖瓶篩選
[0032] 將篩選的3株誘變菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，搖瓶配方為：葡萄糖3%，酵母粉1. 5%，玉 米漿3. 5 %，氯化巧0. 12 %，氯化鋼1. 5 %，憐酸二氨鋼1. 2 %，碳酸巧3 %。培養(yǎng)溫度35 °C， 培養(yǎng)時(shí)間120h，轉(zhuǎn)速2(K)巧m。3株誘變菌株搖瓶實(shí)驗(yàn)的酶活力如下：