肝母細(xì)胞樣細(xì)胞的培養(yǎng)方法及其培養(yǎng)物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及肝母細(xì)胞樣細(xì)胞的培養(yǎng)方法及其培養(yǎng)物，其中，該肝母細(xì)胞樣細(xì)胞是 在從誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞：inducedpluripotentstemcells)或胚胎干細(xì)胞巧S 細(xì)胞：embiTonicstemcells)等多能干細(xì)胞（PSC:plu;ripotentstemcells)向肝細(xì)胞分 化誘導(dǎo)的過程中生成。
[0002] 本申請要求通過參照援引于此的日本專利申請?zhí)卦?013-080557號的優(yōu)先權(quán)。
【背景技術(shù)】
[0003] 所謂的多能干細(xì)胞是指具有多分化潛能和自我更新能力的未分化細(xì)胞，并且，已 知多能干細(xì)胞具有組織損傷后的組織修復(fù)能力。因此，多能干細(xì)胞在各種疾病的治療用物 質(zhì)的篩選、再生醫(yī)療領(lǐng)域中很有用，其研究日益活躍。多能干細(xì)胞中的iPS細(xì)胞是通過在成 纖維細(xì)胞等體細(xì)胞中導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子、例如〇CT3/4、SOX2、KLF4、C-MYC等基因，將體細(xì) 胞去分化（dedifferentiate)而制成的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。從理論上來說，具有多分化潛 能性（pluripotency)的細(xì)胞能夠分化誘導(dǎo)為包括肝臟等在內(nèi)的所有組織或器官。
[0004] 作為從多能干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化誘導(dǎo)的方法，主要嘗試了形成細(xì)胞團(tuán)塊（擬 胚體）、在培養(yǎng)基中添加體液因子、或者選擇使用適當(dāng)?shù)募?xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix)、飼養(yǎng)細(xì)胞、基質(zhì)膠等的方法等。但是，有報告稱通過上述方法得到的肝細(xì)胞的藥物 代謝酶活性低（非專利文獻(xiàn)1~3)。在從干細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞分化時，需要從干細(xì)胞起經(jīng) 過中內(nèi)胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞、肝母細(xì)胞的分化工序。在各個分化工序中，在培養(yǎng)體系中使用激 活素（activin)A、堿性成纖維細(xì)胞生長因子化FGF:basicFibroblastGrowthFactor)、 BMP4(bonemo;rphogeneticprotein4:骨形態(tài)發(fā)生蛋白 4)、FGF-4、視黃酸或者DMSO(二甲 基亞諷）等的體液因子或化合物。另外，有報告稱肝臟發(fā)育需要肥X、HNF4a、HNF6、F0XA2 等轉(zhuǎn)錄因子（非專利文獻(xiàn)4)。 陽0化]關(guān)于使用新一代基因治療用載體系統(tǒng)有效地從ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞等干細(xì)胞向肝 細(xì)胞分化誘導(dǎo)時的基因?qū)敕椒ㄒ驯还_（專利文獻(xiàn)4)。專利文獻(xiàn)4中公開了下述內(nèi)容， 良P:通過使用腺病毒載體（adenovirusvector)，在ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞等干細(xì)胞中導(dǎo)入從 例如肥X基因、HNF4a基因、HNF6基因W及S0X17基因中選擇的任意一種或多種基因，能夠 使干細(xì)胞有效地分化誘導(dǎo)為肝細(xì)胞。如上所述，針對有效地從ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞等多能干 細(xì)胞分化誘導(dǎo)為肝細(xì)胞的方法進(jìn)行了各種研究。
[0006] 關(guān)于人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)，公開了一種包被有人層粘連蛋白a5P1 丫 1 (人層粘 連蛋白511)的E8片段或人層粘連蛋白a36 2y2(人層粘連蛋白322)的E8片段的細(xì)胞 培養(yǎng)用基材（專利文獻(xiàn)5)。專利文獻(xiàn)5中公開的是在無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)環(huán)境下，將多能干細(xì) 胞W保持其多分化潛能性的狀態(tài)進(jìn)行培養(yǎng)。但是，在專利文獻(xiàn)5中，雖然已公開了人多能干 細(xì)胞的培養(yǎng)，但不存在任何關(guān)于肝母細(xì)胞樣細(xì)胞等組織干細(xì)胞、分化誘導(dǎo)中間細(xì)胞的培養(yǎng) 細(xì)胞的記載，上述細(xì)胞培養(yǎng)用基材的應(yīng)用僅限于未分化的人多能干細(xì)胞。
[0007]【現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)】 陽00引【專利文獻(xiàn)】
[0009] 專利文獻(xiàn)1:日本公報、特開2002-272480號（日本專利、特許第3635462號公報）
[0010] 專利文獻(xiàn)2:日本公報、特開2003-250566號
[0011] 專利文獻(xiàn)3:日本公報、特開2008-136381號 陽01引專利文獻(xiàn)4:國際公開W02011/052504號小冊子
[0013] 專利文獻(xiàn)5:日本公報、特開2011-78370號
[0014]【非專利文獻(xiàn)】
[0015]非專利文獻(xiàn)1出巧atology. 51，297-305巧010]
[0016] 非專利文獻(xiàn)2 :PLoS One. 6,eM228 巧011]
[0017]非專利文獻(xiàn)3出巧atology. 55,1193-203 [2012]
[0018]非專利文獻(xiàn)4 :化1:ure Reviews Genetics. 3,499-512 [2002]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 本發(fā)明的課題在于提供一種穩(wěn)定地對從多能干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化誘導(dǎo)的過程中 生成的"肝母細(xì)胞樣細(xì)胞"進(jìn)行維持培養(yǎng)的方法。進(jìn)而，本發(fā)明的課題在于提供一種通過上 述培養(yǎng)方法而得到的培養(yǎng)物。
[0020] 為了解決上述課題，本發(fā)明人等不斷認(rèn)真研究后發(fā)現(xiàn)，通過使從多能干細(xì)胞向肝 細(xì)胞分化誘導(dǎo)的過程中生成的肝母細(xì)胞樣細(xì)胞與層粘連蛋白（laminin)接觸，能夠解決上 述課題，從而完成了本發(fā)明。
[0021] 旨P，本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容如下。
[0022] 1. 一種肝母細(xì)胞樣細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括：使從多能干細(xì)胞向肝細(xì) 胞分化誘導(dǎo)的過程中生成的肝母細(xì)胞樣細(xì)胞與層粘連蛋白接觸的工序、和在使所述細(xì)胞與 層粘連蛋白接觸后，將未粘附在層粘連蛋白上的細(xì)胞除去的工序。
[0023] 2.如上述1所述的肝母細(xì)胞樣細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，與從多能干細(xì)胞向 肝細(xì)胞分化誘導(dǎo)的過程中生成的肝母細(xì)胞樣細(xì)胞接觸的所述層粘連蛋白，是層粘連蛋白同 種型中的、由層粘連蛋白a 2 P 1丫1(層粘連蛋白211)、層粘連蛋白a 4 P 1丫1(層粘連蛋白 411) W及層粘連蛋白511構(gòu)成的層粘連蛋白亞型W外的其他層粘連蛋白。
[0024] 3.如上述1所述的肝母細(xì)胞樣細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，與從多能干細(xì)胞向 肝細(xì)胞分化誘導(dǎo)的過程中生成的肝母細(xì)胞樣細(xì)胞接觸的所述層粘連蛋白，是由具有相對于 整合素a66 1的親和性比相對于整合素a36 1的親和性強(qiáng)運(yùn)一性質(zhì)的同種型構(gòu)成的層粘 連蛋白。
[00巧]4.如上述1~3中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，與從多能干細(xì)胞向 肝細(xì)胞分化誘導(dǎo)的過程中生成的肝母細(xì)胞樣細(xì)胞接觸的所述層粘連蛋白是層粘連蛋白 a1P1 丫 1 (層粘連蛋白111)的一部分或全部。
[00%] 5.如上述4所述的肝母細(xì)胞樣細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述層粘連蛋白111 的一部分中至少包含層粘連蛋白111的E8片段。
[0027] 6.如上述1~5中任一項(xiàng)所述的肝母細(xì)胞樣細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述肝 母細(xì)胞樣細(xì)胞是源自誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞和/或提取的胚胎干細(xì)胞的肝母細(xì)胞樣細(xì)胞。
[0028]7.如上述6所述的肝母細(xì)胞樣細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括W下工序，即：
[0029] 1)將源自誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞和/或提取的胚胎干細(xì)胞的肝母細(xì)胞樣細(xì)胞，接種至 包被有層粘連蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)用固相載體上的工序；
[0030] 2)在接種有所述細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)用固相載體上，將未粘附細(xì)胞從所述固相載體除 去的工序；
[0031] 3)將在所述工序2)中粘附在所述固相載體上的細(xì)胞在層粘連蛋白上進(jìn)行培養(yǎng)的 工序。
[0032] 8.如上述7所述的肝母細(xì)胞樣細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，還包括W下工序， 即：
[0033] 4)將通過上述7所述的工序1)~3)培養(yǎng)得到的肝母細(xì)胞樣細(xì)胞，從細(xì)胞培養(yǎng)用 固相載體上分離，并使其懸浮在培養(yǎng)基中的工序；
[0034] W將懸浮的所述細(xì)胞W細(xì)胞數(shù)為2. 5X102個/cm2~1. 25X 105個/cm2、優(yōu)選細(xì)胞 數(shù)為2. 5 X1〇3個/cm 2~2. 5 X10 4個/cm 2、更優(yōu)選細(xì)胞數(shù)為2 X1〇4個/cm 2~2. 5 X10 4個/ cm2的狀態(tài)接種至包被有層粘連蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)用固相載體上的工序；
[0035] 6)將在所述工序5)中粘附在所述固相載體上的細(xì)胞在層粘連蛋白上進(jìn)行培養(yǎng)的 工序。
[0036] 9.如上述8所述的肝母細(xì)胞樣細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，將上述8所述的工序 4)~6)反復(fù)進(jìn)行至少一次W上。
[0037] 10.如上述7~9中任一項(xiàng)所述的肝母細(xì)胞樣細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，在上 述7的工序1)所述的將細(xì)胞接種至包被有層粘連蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)用固相載體上的工序之 前，將源自誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞和/或提取的胚胎干細(xì)胞的肝母細(xì)胞樣細(xì)胞分散為單細(xì)胞， 并且將分散后的肝母細(xì)胞樣細(xì)胞接種至工序1)的包被有層粘連蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)用固相載 體上。
[0038] 11. 一種肝母細(xì)胞樣細(xì)胞的實(shí)質(zhì)上純粹的培養(yǎng)物，其特征在于，所述肝母細(xì)胞樣細(xì) 胞是相對于層粘連蛋白同種型中的層粘連蛋白111的粘附能力比相對于層粘連蛋白211、 層粘連蛋白411W及層粘連蛋白511的粘附能力強(qiáng)的細(xì)胞。
[0039] 12. -種肝母細(xì)胞樣細(xì)胞的實(shí)質(zhì)上純粹的培養(yǎng)物，其特征在于，細(xì)胞表達(dá)從ALB、 CK19、CK7、CYP3A7中選擇的任意一種或一種W上的肝母細(xì)胞標(biāo)記物，并且表達(dá)整合素a6 和整合素0 1。
[0040] 13.-種肝母細(xì)胞樣細(xì)胞的實(shí)質(zhì)上純粹的培養(yǎng)物，其是能夠在細(xì)胞表面上表達(dá)整 合素的肝母細(xì)胞樣細(xì)胞培養(yǎng)物，其中，所述肝母細(xì)胞樣細(xì)胞是相比整合素a 36 1而優(yōu)先表 達(dá)整合素a66 1的細(xì)胞。
[0041]14.一種實(shí)質(zhì)上純粹的培養(yǎng)物，其特征在于，通過上述1~10中任一項(xiàng)所述的肝母 細(xì)胞樣細(xì)胞的培養(yǎng)方法而獲得。
[0042]15.-種肝細(xì)胞和/或膽管上皮細(xì)胞再生用的移植用組合物，其特征在于，所述移 植用組合物作為活性組分而含有上述11~14中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)物。
[0043]16.-種肝母細(xì)胞樣細(xì)胞培養(yǎng)用基材，其特征在于，包含包被有層粘連蛋白111的 一部分或全部的細(xì)胞培養(yǎng)用固相載體。
[0044]17.如上述16所述的肝母細(xì)胞樣細(xì)胞培養(yǎng)用基材，其特征在于，所述層粘連蛋白 111的一部分中至少包含層粘連蛋白111的E8片段。
[0045] 18. -種從肝母細(xì)胞樣細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞和/或膽管上皮細(xì)胞分化誘導(dǎo)的分化誘 導(dǎo)預(yù)處理方法，其特征在于，包括：使從多能干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化誘導(dǎo)的過程中生成的肝母 細(xì)胞樣細(xì)胞與層粘連蛋白接觸的工序、和在使所述細(xì)胞與層粘連蛋白接觸后，將未粘附在 所述層粘連蛋白上的細(xì)胞除去的工序。
[0046] 19.如上述18所述的從肝母細(xì)胞樣細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞和/或膽管上皮細(xì)胞分化誘 導(dǎo)的分化誘導(dǎo)預(yù)處理方法，其特征在于，與從多能干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化誘導(dǎo)的過程中生成 的肝母細(xì)胞樣細(xì)胞接觸的所述層粘連蛋白，是層粘連蛋白同種型中的、由層粘連蛋白211、 層粘連蛋白411W及層粘連蛋白511構(gòu)成的層粘連蛋白亞型W外的其他層粘連蛋白。
[0047] 20.如上述18所述的從肝母細(xì)胞樣細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞和/或膽管上皮細(xì)胞分化誘 導(dǎo)的分化誘導(dǎo)預(yù)處理方法，其特征在于，與從多能干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化誘導(dǎo)的過程中生成 的肝母細(xì)胞樣細(xì)胞接觸的所述層粘連蛋白，是由具有相對于整合素a66 1的親和性比相 對于整合素a36 1的親和性強(qiáng)運(yùn)一性質(zhì)的同種型構(gòu)成的層粘連蛋白。
[0048] 21.如上述18所述的從肝母細(xì)胞樣細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞和/或膽管上皮細(xì)胞分化誘 導(dǎo)的分化誘導(dǎo)預(yù)處理方法，其特征在于，與從多能干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化誘導(dǎo)的過程中生成 的肝母細(xì)胞樣細(xì)胞接觸的所述層粘連蛋白是層粘連蛋白111的一部分或全部。
[0049] 22.如上述21所述的從肝母細(xì)胞樣細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞和/或膽管上皮細(xì)胞分化誘 導(dǎo)的分化誘導(dǎo)預(yù)處理方法，其特征在于，