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      肝母細胞樣細胞的培養(yǎng)方法及其培養(yǎng)物的制作方法_6

      文檔序號:9438180閱讀:來源:國知局
      的狀態(tài)將皿C接種至包被有各種層粘連蛋白的培養(yǎng)皿的各個孔中,并在十五分鐘后 更換培養(yǎng)基(繼代次數(shù):零次,天數(shù):9天)。之后,每天更換培養(yǎng)基并培養(yǎng)六天~屯天,制備 細胞數(shù)為7. 5X104個/cm2的細胞懸浮液,使用包被有LN111的培養(yǎng)皿或者包被有LN111E8 的培養(yǎng)皿進行繼代。通過流式細胞術(shù)分析,對反復(fù)進行了八次(P8)上述繼代操作時的AFP 陽性率(% )進行了確認。由其結(jié)果可知,在利用LN111和LN111E8中的任意一種進行包被 處理時,AFP的表達均得W維持(參照圖24)。進而,通過流式細胞術(shù)分析,對反復(fù)進行了八 次(P8)繼代培養(yǎng)時的AFPW外的其他標記物仰133、化CAM、ALB、CK7及CK19)也進行了 確認。由其結(jié)果可知,所有標記物的表達均得W維持(參照圖25)。 陽173] 由W上可知,利用LN111或LN111E8包被后的培養(yǎng)物,即使在經(jīng)過八次繼代后也表 達各種標記物,并且皿C的特性得W維持。
      [0174](實施例11)肝母細胞樣細胞各種整合素的表達
      [01巧]針對W人ES細胞(H9)為原始材料且在參考例2中制成的、分化誘導(dǎo)處理第九天 的皿C和NHBC,通過與實施例1相同的方法,并利用實時巧光定量RT-PCR法對各種整合素 基因的表達進行了確認。各種實時巧光定量RT-PCR測定用的引物集和試劑使用市售品,并 將GAPDH作為看家基因進行了測定。由其結(jié)果可知,皿C中的整合素a6的表達比NHBC高 約16倍,而NHBC中的整合素P3的表達比NBC高約20倍(圖26)。 陽176](工業(yè)上的可利用性)
      [0177] 通常情況下,在從人ES細胞或iPS細胞等多能干細胞分化誘導(dǎo)為肝細胞時,需要 20天左右的培養(yǎng)時間?,F(xiàn)有技術(shù)下,很難對源自iPS細胞和/或ES細胞的肝母細胞樣細胞 進行培養(yǎng)、維持、增殖。
      [0178] 如W上詳細敘述,通過使用層粘連蛋白的本發(fā)明的方法,首次實現(xiàn)了肝母細胞樣 細胞的培養(yǎng)、維持、增殖。
      [0179] 利用本發(fā)明的方法培養(yǎng)出的培養(yǎng)物(肝母細胞樣細胞)能夠進行繼代培養(yǎng)。在細 胞的繼代中,通常很難對分化誘導(dǎo)中間細胞進行增殖培養(yǎng)。在本發(fā)明中,繼代培養(yǎng)的次數(shù)并 無特別限定,即使反復(fù)進行至少一次W上、例如=次W上、十次W上、十五次W上,也能夠維 持作為肝母細胞樣細胞的特征,并且也能夠維持分化誘導(dǎo)能力。 陽180] 在通過上述方法得到的培養(yǎng)肝母細胞樣細胞中,AFP、ALB、CK7及CK19呈陽性。另 夕F,即使反復(fù)進行多次繼代,也能夠觀察到整合素a6和整合素6 1的表達。對于反復(fù)進行 繼代后的培養(yǎng)肝母細胞樣細胞,能夠觀察到pan-h巧atoblast標記物CK8、CK18、EpCAMW及 CD133、和/或肝母細胞化巧atoblast)標記物AFP、ALB、CYP3A7W及I-CAM等。 陽181] 另外,通過對培養(yǎng)肝母細胞樣細胞進一步進行分化誘導(dǎo)處理,能夠誘導(dǎo)出表達成 熟肝細胞的標記物CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19或aAT的細胞、或者表達膽管上皮細胞的標記 物S0X9或IVcollagen的細胞,由此可知,培養(yǎng)肝母細胞樣細胞能夠分化誘導(dǎo)為成熟肝細 胞或膽管上皮細胞等。另外,通過移植利用上述培養(yǎng)方法得到的實質(zhì)上純粹的培養(yǎng)物,即使 在體內(nèi)(invivo)也能夠分化誘導(dǎo)為肝細胞等。由此,能夠?qū)⒗蒙鲜雠囵B(yǎng)方法得到的培 養(yǎng)物、或者將培養(yǎng)物誘導(dǎo)為成熟肝細胞或膽管上皮細胞后的物質(zhì)作為移植用組合物而使用 于肝細胞和/或膽管上皮細胞的再生中。 陽182] 通過將肝母細胞樣細胞加W維持,能夠在短時間內(nèi)制成所希望的成熟細胞、例如 成熟肝細胞或膽管上皮細胞,從而能夠在所希望的時間內(nèi)獲得所希望數(shù)量的細胞。如此得 到的肝細胞或膽管上皮細胞能夠被用作肝細胞和/或膽管上皮細胞再生用的細胞治療用 材料。進而,通過在肝細胞中添加藥物候選化合物,并對肝毒性標記物的表達變化進行分 析,從而能夠事先預(yù)測藥物候選化合物在生物體內(nèi)的毒性。由此,能夠早期篩除因為毒性問 題而應(yīng)被排除的藥物候選化合物,從而有望加快藥物研發(fā)的速度。
      【主權(quán)項】
      1. 一種肝母細胞樣細胞的培養(yǎng)方法,其特征在于,包括: 使從多能干細胞向肝細胞分化誘導(dǎo)的過程中生成的肝母細胞樣細胞與層粘連蛋白接 觸的工序,和 在使所述細胞與層粘連蛋白接觸后,將未粘附在層粘連蛋白上的細胞除去的工序。2. 如權(quán)利要求1所述的肝母細胞樣細胞的培養(yǎng)方法,其特征在于, 與從多能干細胞向肝細胞分化誘導(dǎo)的過程中生成的肝母細胞樣細胞接觸的所述層粘 連蛋白,是層粘連蛋白同種型中的、由層粘連蛋白a20Iy1、層粘連蛋白a40Iy1以及 層粘連蛋白a50IY1構(gòu)成的層粘連蛋白亞型以外的其他層粘連蛋白。3. 如權(quán)利要求1所述的肝母細胞樣細胞的培養(yǎng)方法,其特征在于, 與從多能干細胞向肝細胞分化誘導(dǎo)的過程中生成的肝母細胞樣細胞接觸的所述層粘 連蛋白,是由具有相對于整合素a60 1的親和性比相對于整合素a30 1的親和性強這一 性質(zhì)的同種型構(gòu)成的層粘連蛋白。4. 如權(quán)利要求1~3中任一項所述的肝母細胞樣細胞的培養(yǎng)方法,其特征在于, 與從多能干細胞向肝細胞分化誘導(dǎo)的過程中生成的肝母細胞樣細胞接觸的所述層粘 連蛋白是層粘連蛋白aI0Iy1的一部分或全部。5. 如權(quán)利要求4所述的肝母細胞樣細胞的培養(yǎng)方法,其特征在于, 所述層粘連蛋白a1 0Iy1的一部分中至少包含層粘連蛋白a1 0Iy1的E8片段。6. 如權(quán)利要求1~5中任一項所述的肝母細胞樣細胞的培養(yǎng)方法,其特征在于, 所述肝母細胞樣細胞是源自誘導(dǎo)性多能干細胞和/或提取的胚胎干細胞的肝母細胞 樣細胞。7. 如權(quán)利要求6所述的肝母細胞樣細胞的培養(yǎng)方法,其特征在于,包括以下工序,BP: 1) 將源自誘導(dǎo)性多能干細胞和/或提取的胚胎干細胞的肝母細胞樣細胞,接種至包被 有層粘連蛋白的細胞培養(yǎng)用固相載體上的工序; 2) 在接種有所述細胞的細胞培養(yǎng)用固相載體上,將未粘附細胞從所述固相載體除去的 工序; 3) 將在所述工序2)中粘附在所述固相載體上的細胞在層粘連蛋白上進行培養(yǎng)的工 序。8. 如權(quán)利要求7所述的肝母細胞樣細胞的培養(yǎng)方法,其特征在于,還包括以下工序, 即: 4) 將通過權(quán)利要求7所述的工序1)~3)培養(yǎng)得到的肝母細胞樣細胞,從細胞培養(yǎng)用 固相載體上分離,并使其懸浮在培養(yǎng)基中的工序; 5) 將懸浮的所述細胞,以細胞數(shù)為2. 5XIO2個/cm2~1. 25X10 5個/cm2、優(yōu)選細胞數(shù) 為 2. 5XIO3個/cm2~2. 5X10 4個/cm2、更優(yōu)選細胞數(shù)為 2XIO4個/cm2~2. 5X10 4個/cm2 的狀態(tài)接種至包被有層粘連蛋白的細胞培養(yǎng)用固相載體上的工序; 6) 將在所述工序5)中粘附在所述固相載體上的細胞在層粘連蛋白上進行培養(yǎng)的工 序。9. 如權(quán)利要求8所述的肝母細胞樣細胞的培養(yǎng)方法,其特征在于, 將權(quán)利要求8所述的工序4)~6)反復(fù)進行至少一次以上。10. 如權(quán)利要求7~9中任一項所述的肝母細胞樣細胞的培養(yǎng)方法,其特征在于, 在權(quán)利要求7的工序1)所述的將細胞接種至包被有層粘連蛋白的細胞培養(yǎng)用固相載 體上的工序之前,將源自誘導(dǎo)性多能干細胞和/或提取的胚胎干細胞的肝母細胞樣細胞分 散成單細胞,并且將分散后的肝母細胞樣細胞接種至工序1)的包被有層粘連蛋白的細胞 培養(yǎng)用固相載體上。11. 一種肝母細胞樣細胞的實質(zhì)上純粹的培養(yǎng)物,其特征在于, 所述肝母細胞樣細胞是相對于層粘連蛋白同種型中的層粘連蛋白a1 0Iy1的粘附 能力比相對于層粘連蛋白a20Iy1、層粘連蛋白a40Iy1以及層粘連蛋白a50Iy1的 粘附能力強的細胞。12. -種肝母細胞樣細胞的實質(zhì)上純粹的培養(yǎng)物,其特征在于, 細胞表達從ALB、CK19、CK7、CYP3A7中選擇的任意一種或一種以上的肝母細胞標記物, 并且表達整合素a6和整合素P1。13. -種肝母細胞樣細胞的實質(zhì)上純粹的培養(yǎng)物,其是能夠在細胞表面上表達整合素 的肝母細胞樣細胞培養(yǎng)物,其中,所述肝母細胞樣細胞是相比整合素a3P1而優(yōu)先表達整 合素a60 1的細胞。14. 一種實質(zhì)上純粹的培養(yǎng)物,其特征在于, 通過權(quán)利要求1~10中任一項所述的肝母細胞樣細胞的培養(yǎng)方法而獲得。15. -種肝細胞和/或膽管上皮細胞再生用的移植用組合物,其特征在于,所述移植用 組合物作為活性組分而含有權(quán)利要求11~14中任一項所述的培養(yǎng)物。16. -種肝母細胞樣細胞培養(yǎng)用基材,其特征在于, 包含被層粘連蛋白a1 0IY1的一部分或全部包被的細胞培養(yǎng)用固相載體。17. 如權(quán)利要求16所述的肝母細胞樣細胞培養(yǎng)用基材,其特征在于, 所述層粘連蛋白a1 0Iy1的一部分中至少包含層粘連蛋白a1 0Iy1的E8片段。18. -種從肝母細胞樣細胞向成熟肝細胞和/或膽管上皮細胞分化誘導(dǎo)的分化誘導(dǎo)預(yù) 處理方法,其特征在于,包括: 使從多能干細胞向肝細胞分化誘導(dǎo)的過程中生成的肝母細胞樣細胞與層粘連蛋白接 觸的工序,和 在使所述細胞與層粘連蛋白接觸后,將未粘附在所述層粘連蛋白上的細胞除去的工 序。19. 如權(quán)利要求18所述的從肝母細胞樣細胞向成熟肝細胞和/或膽管上皮細胞分化誘 導(dǎo)的分化誘導(dǎo)預(yù)處理方法,其特征在于, 與從多能干細胞向肝細胞分化誘導(dǎo)的過程中生成的肝母細胞樣細胞接觸的所述層粘 連蛋白,是層粘連蛋白同種型中的、由層粘連蛋白a20Iy1、層粘連蛋白a40Iy1以及 層粘連蛋白a50IY1構(gòu)成的層粘連蛋白亞型以外的其他層粘連蛋白。20. 如權(quán)利要求18所述的從肝母細胞樣細胞向成熟肝細胞和/或膽管上皮細胞分化誘 導(dǎo)的分化誘導(dǎo)預(yù)處理方法,其特征在于, 與從多能干細胞向肝細胞分化誘導(dǎo)的過程中生成的肝母細胞樣細胞接觸的所述層粘 連蛋白,是由具有相對于整合素a60 1的親和性比相對于整合素a30 1的親和性強這一 性質(zhì)的同種型構(gòu)成的層粘連蛋白。21. 如權(quán)利要求18所述的從肝母細胞樣細胞向成熟肝細胞和/或膽管上皮細胞分化誘 導(dǎo)的分化誘導(dǎo)預(yù)處理方法,其特征在于, 與從多能干細胞向肝細胞分化誘導(dǎo)的過程中生成的肝母細胞樣細胞接觸的所述層粘 連蛋白是層粘連蛋白aI0Iy1的一部分或全部。22.如權(quán)利要求21所述的從肝母細胞樣細胞向成熟肝細胞和/或膽管上皮細胞分化誘 導(dǎo)的分化誘導(dǎo)預(yù)處理方法,其特征在于, 所述層粘連蛋白a1 0Iy1的一部分中至少包含層粘連蛋白a1 0Iy1的E8片段。
      【專利摘要】本發(fā)明提供穩(wěn)定地對從多能干細胞向肝細胞分化誘導(dǎo)的過程中生成的“肝母細胞樣細胞”進行維持培養(yǎng)的方法;進而,本發(fā)明提供通過上述培養(yǎng)方法得到的培養(yǎng)物;通過使肝母細胞樣細胞與層粘連蛋白接觸,能夠穩(wěn)定地對肝母細胞樣細胞進行維持培養(yǎng);通過使用層粘連蛋白的本發(fā)明的方法,首次實現(xiàn)了肝母細胞樣細胞的培養(yǎng)、維持、增殖;通過將肝母細胞樣細胞加以維持,能夠在短時間內(nèi)制成所希望的成熟細胞、例如成熟肝細胞或膽管上皮細胞,并且能夠在所希望的時間內(nèi)獲得所希望的成熟細胞;而且,所得到的培養(yǎng)肝母細胞樣細胞能夠分化誘導(dǎo)為成熟肝細胞或膽管上皮細胞等;由此,本發(fā)明的實質(zhì)上純粹的培養(yǎng)物能夠被用作肝細胞和/或膽管上皮細胞再生用的移植用組合物。
      【IPC分類】A61L27/00, C12N5/0789, C12N5/10, C12N5/071, C12N15/09
      【公開號】CN105189738
      【申請?zhí)枴緾N201480018961
      【發(fā)明人】水口裕之, 川端健二, 高山和雄, 關(guān)口清俊
      【申請人】國立研究開發(fā)法人醫(yī)藥基盤·健康·營養(yǎng)研究所, 國立大學(xué)法人大阪大學(xué)
      【公開日】2015年12月23日
      【申請日】2014年4月8日
      【公告號】CA2908225A1, EP2985340A1, US20160046904, WO2014168157A1
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