綠盲蝽唾液蛋白pg12的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域及植物病蟲(chóng)害防治領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及綠盲賠唾液蛋 白PG12的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 盲賠橡化eteropteraiMiridae)是一類(lèi)重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，它的寄主植物范圍廣 泛，已報(bào)道有50余科200多種，包括棉花、要、葡萄、樓桃、蘋(píng)果、茶樹(shù)等多種重要作物。在 取食過(guò)程中，若蟲(chóng)和成蟲(chóng)W針狀口器刺吸棉株柔嫩組織中的汁液，并從唾液腺分泌含有唾 液酶的唾液進(jìn)行體外預(yù)消化。另外在盲賠橡唾液中還存在造成棉花出現(xiàn)病理特征的致病 蛋白，所W在盲賠橡危害棉花頂尖，致棉花頂芽干枯死亡，成為無(wú)頭棉；危害棉花頂尖，致棉 花形成許多不定芽，成為多頭棉，表現(xiàn)枝葉叢生；危害棉花葉片后，侵害部位變黑，后形成孔 洞，葉片長(zhǎng)大后，孔洞也隨之變大，成為很多破洞，稱之為破葉瘋；幼蕾受到危害后由黃變 黑，形似養(yǎng)麥粒，2-3天后脫落，中型蕾被害后巷葉張開(kāi)，不久脫落；幼鈴受到危害后，輕者 呈現(xiàn)褐色水浸斑，重者滿布黑點(diǎn)僵化脫落。
[0003] 盲賠不同于喊蟲(chóng)、粉風(fēng)等汁液取食者，它主要取食植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，屬 細(xì)胞取食者。送類(lèi)昆蟲(chóng)取食時(shí)，先將口針插入植物細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間，然后通過(guò)口針的劇烈活 動(dòng)撕碎植物細(xì)胞，同時(shí)分泌唾液，將食物源變成泥漿狀物質(zhì)后，再進(jìn)行吸食。在分泌的唾液 中含有大量唾液酶，其中多聚半乳糖醒酸酶和蛋白酶是主要組成成分。
[0004]Strong和Kruitwagen(1968)曾報(bào)道在草盲賠的唾液中存在多聚半乳糖醒酸酶 (polygalac化ronase,PG)活性，并推測(cè)有二到H種具有內(nèi)切、夕['切和水解活性的PGs蛋白 存在，后來(lái)研究者證明草盲賠的唾液中至少存在5種PGs蛋白。內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶隨 機(jī)降解細(xì)胞壁的多聚a-1，4-半乳糖醒酸為低聚半乳糖醒酸，外切多聚半乳糖醒酸酶從 末端降解細(xì)胞壁的多聚a-1，4-半乳糖醒酸產(chǎn)生單糖，還有一些PGs同時(shí)具有內(nèi)切和外 切酶活性。到目前為止，在四紋盲賠（Poecilocapsuslinea化S)和美國(guó)牧草盲賠（Lygus Lineolaris)唾液中也發(fā)現(xiàn)具有外切活性的PGs。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)唾液中的PGs蛋白由 一個(gè)高度變異的基因家族控制，它編碼一系列的PGs來(lái)應(yīng)對(duì)植物體內(nèi)的PGs抑制劑，通過(guò)改 變PGs蛋白的數(shù)量和種類(lèi)來(lái)降解植物細(xì)胞壁的膠質(zhì)。通過(guò)構(gòu)建雄性草盲賠若蟲(chóng)的cDNA文 庫(kù)，獲得276個(gè)ESTs序列，其中包括3種多聚半乳糖醒酸酶基因片段，通過(guò)cDNA末端快速 擴(kuò)增（RAC巧技術(shù)獲得送H個(gè)基因的全長(zhǎng)序列。
[0005] 病理反應(yīng)是一種普遍存在的現(xiàn)象，推測(cè)引起病理反應(yīng)的致病蛋白種類(lèi)有多 種類(lèi)型。早在1970年就在草盲賠的唾液中發(fā)現(xiàn)多聚半乳糖醒酸酶的活性，Ecale和 Backus(1995)的研究表明，可能是草盲賠的機(jī)械損傷導(dǎo)致植物抗性反應(yīng)，草盲賠的唾液可 W放大送種反應(yīng)。草盲賠唾液中的多聚半乳糖醒酸酶能使棉花和紫花首猜的花朵不正常發(fā) 育，提取草盲賠唾液蛋白并分離得到具有多聚半乳糖醒酸酶活性的部分，將其注射到植物 幼花基部，會(huì)像草盲賠取食植物幼花一樣，阻礙花朵發(fā)育。后來(lái)使用黑曲霉（Aspergillus niger)體外表達(dá)重組多聚半乳糖醒酸酶蛋白證明，多聚半乳糖醒酸酶的水解活性導(dǎo)致了首 猜病理性反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供綠盲賠唾液蛋白PG12的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明中涉及的PG12蛋白是由綠盲賠（Apolyguslucorum)唾液腺分泌的一種具 有多聚半乳糖醒酸酶活性的蛋白。PG12蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，或該序列 經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[000引 PG12蛋白的編碼基因，具體可為如下①~⑨中任一所述的基因；
[0009] ①其核巧酸序列如SeqIDNo.2所示；
[0010] ②在嚴(yán)格條件下與①所示序列雜交且編碼與多聚半乳糖醒酸酶合成相關(guān)的蛋白 的DNA序列；
[0011] ⑨與①或②所示序列具有90%W上（優(yōu)選95%W上）的同源性，且編碼與多聚半 乳糖醒酸酶的合成相關(guān)的蛋白的DNA序列。
[0012] 所述嚴(yán)格條件為在含0. 1%SDS的0. 1XSS陽(yáng)或含0. 1%SDS的0. 1XSSC溶液中， 在65 °C下雜交，并用該溶液洗膜。
[0013] 其中，SeqIDNo. 2所示序列第34-1089bp為編碼區(qū)，編碼SeqIDNo. 1所示的蛋 白。
[0014] 本發(fā)明提供綠盲賠唾液蛋白PG12在降解果膠中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明還提供綠盲賠唾液蛋白PG12在降解植物細(xì)胞壁中的應(yīng)用。
[0016] 前述應(yīng)用中，綠盲賠唾液蛋白PG12的制備方法包括W下步驟：
[0017] 1)綠盲賠唾液蛋白PG12基因的克??；分離綠盲賠唾液腺，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA第一鏈，WcDNA第一鏈為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1056bp;回收 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD-TEasy載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌畑5a，提取酶切鑒 定正確的陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序；
[0018] 2)重組表達(dá)載體的構(gòu)建：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物插入pPICZaB載體的EcoRI位點(diǎn)，獲得 重組表達(dá)載體pPICZaB-PG12-His;
[0019] 3)酵母轉(zhuǎn)化及？612的誘導(dǎo)表達(dá)；將9?1〔2(18斗612-化3轉(zhuǎn)化入畢赤酵母乂-33中， 挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中加入甲醇誘導(dǎo)表達(dá)PG12蛋白，培養(yǎng)結(jié)束后，離必收集上 清，用帶His標(biāo)簽蛋白純化柱進(jìn)行PG12蛋白的純化。
[0020] 其中，步驟1)中所述引物為：
[0021] F;5' -GAAGCTGCAGGAATTGCCGATATCAATAACCTGGA-3';
[0022] R;5' -CGGCTGGGCCACGTGACAGTCAACTTTGAGCCCGT-3'。
[0023] 本發(fā)明還提供含有綠盲賠唾液蛋白PG12的編碼基因的載體、宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因細(xì) 胞系和工程菌。
[0024] 本發(fā)明進(jìn)一步提供綠盲賠唾液蛋白PG12或其編碼基因在植物抗綠盲賠唾液腺鑒 定技術(shù)中的應(yīng)用。所述植物包括但不限于棉花等。
[00巧]本發(fā)明提供由綠盲賠唾液腺分泌的一種具有多聚半乳糖醒酸酶活性的蛋白PG12 的應(yīng)用。利用真核表達(dá)系統(tǒng)（例如酵母細(xì)胞）誘導(dǎo)表達(dá)的PG12蛋白可降解果膠、植物細(xì)胞 壁，解決了難于從綠盲賠體內(nèi)直接分離獲得PG12蛋白的問(wèn)題。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例4中PG12蛋白活性測(cè)定結(jié)果；其中，1為陰性對(duì)照，2為純化 后的PG12蛋白。
[0027] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例4中PG12蛋白生物測(cè)定結(jié)果；其中，1為注射4h后的葉片，2 為注射3d后脫落幼鈴，3為注射3d后脫落幼蕾，4為注射后3d的葉片。
【具體實(shí)施方式】
[0028] W下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:a1油oratorymanual, 2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。
[0029] 實(shí)施例1多聚半乳糖醒酸酶編碼基因的克隆
[0030] 選取采集自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)棉田的綠盲賠唾液腺，提取總 RNA,總RNA的提取按Promega公司的RNAgentsTotalRNAIsolationSystemkit進(jìn)行。 取5g總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈，反應(yīng)體系如下：
[00引]總RNAlOyU5yg)、Oligo(dT) (20ymol/L)l. 5yL