一種快速測(cè)定復(fù)合微生物菌劑中多粘類(lèi)芽孢桿菌含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種復(fù)合微生物菌劑的檢測(cè)方法，具體設(shè)及一種快速測(cè)定復(fù)合微生物 菌劑中多粘類(lèi)芽抱桿菌含量的方法，屬于微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 微生物肥料俗稱細(xì)菌劑料，簡(jiǎn)稱菌劑，是指一類(lèi)含有活微生物的特定肥料，應(yīng)用于 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，能夠獲得特定的肥料效應(yīng)。施用后通過(guò)菌劑中微生物的生命活動(dòng)，借助其代謝 過(guò)程或代謝產(chǎn)物，W改善植物生長(zhǎng)條件，尤其是營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。為了提高肥效，常在菌劑中混合 幾種活微生物。
[0003]多粘類(lèi)芽抱桿菌、枯草芽抱桿菌及膠凍芽抱桿菌等微生物不僅具有農(nóng)藥的殺菌作 用，而且還能改善±壤環(huán)境，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，具有肥料的作用。為了最大限度的利用復(fù)合微 生物菌劑的功效，目前常將枯草芽抱桿菌、多粘類(lèi)芽抱桿菌及膠凍芽抱桿菌混合制成復(fù)合 菌劑。膠凍樣芽胞桿菌，又稱娃酸鹽細(xì)菌，盡管其對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件要求不高，對(duì)環(huán)境條件適應(yīng)性 強(qiáng)，但通常情況下，添加在復(fù)合菌劑中的膠凍樣芽抱桿菌的量只有枯草芽抱桿菌或多粘類(lèi) 芽抱桿菌量幾十分之一甚至百分之一，因此，將復(fù)合菌劑稀釋到相應(yīng)倍數(shù)測(cè)定枯草芽抱桿 菌和多粘類(lèi)芽抱桿菌含量時(shí)，即便膠凍樣芽抱桿菌能在該培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，但其生長(zhǎng)的菌 量對(duì)枯草芽抱桿菌和多粘類(lèi)芽抱桿菌統(tǒng)計(jì)結(jié)果也不會(huì)造成顯著性影響，故此測(cè)定時(shí)，常不 考慮膠凍樣芽抱桿菌的量；同時(shí)膠凍樣芽抱桿菌的測(cè)定相對(duì)較容易，由于其在選擇性（無(wú) 氮或無(wú)有效憐鐘養(yǎng)分）固體培養(yǎng)基上有其獨(dú)特菌落和細(xì)胞形態(tài)特征，因而不需生化特性檢 測(cè)或基因序列分析也很容易與其他細(xì)菌區(qū)分。但枯草芽抱桿菌與多粘類(lèi)芽抱桿菌所使用的 培養(yǎng)基相同，在常規(guī)的培養(yǎng)條件下，枯草芽抱桿菌生長(zhǎng)速度較快，而多粘類(lèi)芽抱桿菌生長(zhǎng)速 度相對(duì)較慢，培養(yǎng)基中快速長(zhǎng)出的枯草芽抱桿菌覆蓋了多粘類(lèi)芽抱桿菌，從而使得無(wú)法準(zhǔn) 確統(tǒng)計(jì)多粘類(lèi)芽抱桿菌的含量，而且枯草芽抱桿菌的適應(yīng)性較多粘類(lèi)芽抱桿菌更強(qiáng)，通過(guò) 控制培養(yǎng)溫度等簡(jiǎn)單方法難W準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)多粘類(lèi)芽抱桿菌的含量。隨著近年來(lái)此類(lèi)菌劑的生 產(chǎn)和應(yīng)用越來(lái)越廣泛，我們急需建立一種簡(jiǎn)易、快速、能準(zhǔn)確測(cè)定多粘類(lèi)芽抱桿菌含量的方 法。
[0004]氨節(jié)西林鋼（AmpicillinSodium,CAS號(hào)：69-52-3)。化學(xué)結(jié)構(gòu)式： 陽(yáng)0化]
[0006]化學(xué)式而化8噸化〇45。氨節(jié)西林鋼屬于青霉素類(lèi)抗生素，可W用于肌內(nèi)注射或者 靜脈注射，主要用W治療敏感細(xì)菌所致的上、下呼吸道感染、胃腸道感染、尿路感染、皮膚、 軟組織感染、腦膜炎、敗血癥、屯、內(nèi)膜炎等。目前還沒(méi)有氨節(jié)西林鋼抑制枯草芽抱桿菌或多 粘類(lèi)芽抱桿菌的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種快速測(cè)定復(fù)合微生物菌劑中多粘類(lèi)芽抱桿菌含量的方 法，W簡(jiǎn)化操作，獲得更為準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了W下技術(shù) 方案：
[0008] 一種快速測(cè)定復(fù)合微生物菌劑中多粘類(lèi)芽抱桿菌含量的方法，所述復(fù)合微生物 菌劑的活性成分為枯草芽抱桿菌、多粘類(lèi)芽抱桿菌和膠凍樣芽抱桿菌，該方法包括W下步 驟：
[0009] 1)在微生物培養(yǎng)基中加入氨節(jié)西林鋼，使其濃度達(dá)到0. 05~0. 3 y g/mU混勻后 制成平板；
[0010] 2)將待測(cè)復(fù)合微生物菌劑在含重量百分比為0. 05~0. 5%Tween-80的生理鹽水 中溶解后，置于磁力攬拌器上，在室溫下攬拌20~40min，轉(zhuǎn)速為100~20化pm，然后再將 該溶液置于超聲水浴鍋中，超聲20~40min，制得待測(cè)樣品溶液；
[0011] 3)將待測(cè)樣品溶液均勻涂布在步驟（1)制得的平板上，涂布完成后，將其放入 32°C恒溫培養(yǎng)箱中，24~4化后統(tǒng)計(jì)各平板菌落數(shù)并計(jì)算含量。 陽(yáng)〇1引優(yōu)選地，所述氨節(jié)西林鋼的濃度為0.1yg/mL。
[0013] 所述微生物培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。
[0014] 優(yōu)選地，步驟。中，將待測(cè)復(fù)合微生物菌劑在含重量百分比為0.1 %Tween-80的 生理鹽水中溶解后，置于磁力攬拌器上，在室溫下攬拌30min，轉(zhuǎn)速為15化pm，然后再將該 溶液置于超聲水浴鍋中，超聲30min，制得待測(cè)樣品溶液。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：
[0016] 本發(fā)明通過(guò)向培養(yǎng)基中加入一定濃度的氨節(jié)西林鋼，抑制枯草芽抱桿菌的生長(zhǎng)， 但不抑制多粘類(lèi)芽抱桿菌的生長(zhǎng)，從而避免了快速長(zhǎng)出的枯草芽抱桿菌對(duì)多粘類(lèi)芽抱桿菌 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的影響。該方法通過(guò)計(jì)數(shù)菌落的數(shù)量并換算成活芽抱含量，可W快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確 地測(cè)定復(fù)合微生物菌劑中多粘類(lèi)芽抱桿菌的含量。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例中測(cè)定方法流程圖。
[0018] 圖2是不同濃度氨節(jié)西林鋼對(duì)枯草芽抱桿菌和多粘類(lèi)芽抱桿菌的抑菌圈試驗(yàn)化1 為枯草芽抱桿菌、K3為多粘類(lèi)芽抱桿菌）。
[0019] 圖3是多粘類(lèi)芽抱桿菌在含不同濃度氨節(jié)西林鋼平板上生長(zhǎng)情況照片。
[0020]圖4是枯草芽抱桿菌、多粘類(lèi)芽抱桿菌和膠凍樣芽抱桿菌的混合菌在含不同濃度 氨節(jié)西林鋼平板上生長(zhǎng)情況照片。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述：
[0022] 實(shí)施例：采用圖1所示方法流程，分別對(duì)枯草芽抱桿菌顆粒菌劑、多粘類(lèi)芽抱桿菌 液體菌劑、枯草芽抱桿菌+多粘類(lèi)芽抱桿菌+膠凍樣芽抱桿菌復(fù)合顆粒菌劑、枯草芽抱桿菌 +多粘類(lèi)芽抱桿菌+膠凍樣芽抱桿菌復(fù)合液體菌劑的含量進(jìn)行測(cè)定，依次作為實(shí)施例1~ 4。
[0023] 測(cè)定步驟如下：
[0024] 1)取PDA培養(yǎng)基，裝入500血的立角瓶?jī)?nèi)，高壓蒸汽滅菌后，待冷卻至55~65°C 后加入氨節(jié)西林鋼，使其濃度分別達(dá)到0. 1yg/mL、0. 2yg/mL、0. 3yg/mL、0. 4yg/mL、 0. 5yg/mU混勻后制成PDA平板。
[00巧]。在無(wú)菌操作條件下，將樣品攬拌均勻，準(zhǔn)確稱取10.0 g樣品，加入90血含0.1% (重量百分比）Tween-80的的滅菌生理鹽水中，充分溶解后，置于磁力攬拌器上攬拌30min， 然后再將該溶液置于超聲水浴鍋中，超聲30min，得到稀釋10倍的樣品溶液，標(biāo)記為0號(hào)，然 后依次進(jìn)行10倍梯度稀釋，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)樣品。
[00%] 3)將上述各梯度稀釋液分別吸取100y以用L形玻棒均勻涂布在步驟（1)所得平 板上，32°C恒溫培養(yǎng)箱中2地，選擇適宜的稀釋度，菌落數(shù)在30~300的平板為有效計(jì)數(shù)平 板。
[0027] 4)計(jì)算加入不同濃度氨節(jié)西林鋼后的活芽抱含量為N=一xtxlQ,式中N是活芽 m 抱數(shù)，單位為C化/g;c是同一稀釋倍數(shù)的多個(gè)有效計(jì)數(shù)平板上的平均菌落數(shù)；m是稱取的菌 劑樣品質(zhì)量，單位為g;t是統(tǒng)計(jì)平板對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)。 陽(yáng)0測(cè)結(jié)果比較：
[0029] 將0yg/mL含量的氨節(jié)西林鋼P(yáng)DA平板作為各實(shí)施例的對(duì)照組，對(duì)各實(shí)施例中含 不同濃度氨節(jié)西林鋼的PDA平板的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果如表1所示。
[0030] 從表1可W看出，實(shí)施例1義用本發(fā)明的方法，在含較低濃度氨節(jié)西林鋼的PDA 平板上未能檢測(cè)出活芽抱，說(shuō)明氨節(jié)西林鋼對(duì)枯草芽抱桿菌有很好的抑制作用。運(yùn)一結(jié)論 我們從圖2所示的抑菌圈試驗(yàn)中也能看出：即在含0. 1yg/血氨節(jié)西林鋼的平板上，K1所 表示的枯草芽抱桿菌都有抑菌圈出現(xiàn)，而K3所表示的多粘類(lèi)芽抱桿菌則在較低氨節(jié)西林 鋼濃度下沒(méi)有抑菌圈出現(xiàn)或是抑菌圈不明顯，只有在較高濃度下，才出現(xiàn)了明顯的抑菌圈； 實(shí)施例2采用本發(fā)明的方法均能檢測(cè)出活芽抱，但隨著氨節(jié)西林鋼含量的增大，活芽抱數(shù) 有所減少，說(shuō)明選擇適當(dāng)含量的氨節(jié)西林鋼對(duì)本發(fā)明的檢測(cè)結(jié)果至關(guān)重要。運(yùn)一結(jié)論在 圖3中也能看出：即在圖示的3個(gè)氨節(jié)西林鋼濃度梯度下，都有多粘類(lèi)芽抱桿菌的生長(zhǎng)，且 0. 1 y g/mL-0. 2 y g/mL濃度下，其生長(zhǎng)菌量與空白對(duì)照平板上生長(zhǎng)的菌量幾乎沒(méi)有差異，當(dāng) 濃度升到0. 5 y g/mL時(shí)，多粘類(lèi)芽抱桿菌生長(zhǎng)的量出現(xiàn)了明顯減少；實(shí)施例3和實(shí)施例4測(cè) 定結(jié)果顯示：在含低濃度氨節(jié)西林鋼的PDA平板上，檢測(cè)出的活芽抱數(shù)與添加在復(fù)合菌劑 中的多粘類(lèi)芽抱桿菌含量相當(dāng)，而在不含氨節(jié)西林鋼的對(duì)照組PDA平板上，檢測(cè)出的活芽 抱數(shù)與添加在復(fù)合菌劑中的枯草芽抱桿菌含量相當(dāng)，運(yùn)說(shuō)明適當(dāng)含量的氨節(jié)西林鋼同樣對(duì) 復(fù)合微生物菌劑中的枯草芽抱桿菌有抑制作用，而對(duì)多粘類(lèi)芽抱桿菌沒(méi)有影響。同樣，運(yùn)一 結(jié)論在圖4中也能看出：即復(fù)合菌劑在不加氨節(jié)西林鋼的平板上生長(zhǎng)的菌的菌落形態(tài)及菌 量都與枯草芽抱桿菌一樣，而在含不同濃度氨節(jié)西林鋼的平板上生長(zhǎng)的菌的菌落形態(tài)與不 加氨節(jié)西林鋼的平板上生長(zhǎng)的菌的菌落形態(tài)則完全不同，再結(jié)合生長(zhǎng)的菌量，不難看出該 菌應(yīng)為多粘類(lèi)芽抱桿菌。
[0031]綜合表1及圖2-4的結(jié)果，采用本發(fā)明的方法測(cè)定復(fù)合微生物菌劑中多粘類(lèi)芽抱 桿菌含量不僅操作簡(jiǎn)單，而且快速、準(zhǔn)確，是一個(gè)較理想的檢測(cè)方法。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速測(cè)定復(fù)合微生物菌劑中多粘類(lèi)芽孢桿菌含量的方法，所述復(fù)合微生物菌劑 的活性成分為枯草芽孢桿菌、多粘類(lèi)芽孢桿菌和膠凍樣芽孢桿菌，其特征在于包括以下步 驟： 1) 在微生物培養(yǎng)基中加入氨芐西林鈉，使其濃度達(dá)到0. 05~0. 3yg/mL，混勻后制成 平板； 2) 將待測(cè)復(fù)合微生物菌劑在含重量百分比為0. 05~0. 5%Tween-80的生理鹽水中溶 解后，置于磁力攪拌器上，在室溫下攪拌20~40min，轉(zhuǎn)速為100~200rpm，然后再將該溶 液置于超聲水浴鍋中，超聲20~40min，制得待測(cè)樣品溶液； 3) 將待測(cè)樣品溶液均勻涂布在步驟（1)制得的平板上，涂布完成后，將其放入32°C恒 溫培養(yǎng)箱中，24~48h后統(tǒng)計(jì)各平板菌落數(shù)并計(jì)算含量。2. 如權(quán)利要求1所述快速測(cè)定復(fù)合微生物菌劑中多粘類(lèi)芽孢桿菌含量的方法，其特征 在于：步驟1)中，在微生物培養(yǎng)基中加入氨芐西林鈉，使其濃度達(dá)到0.Iyg/mL，混勻后制 成平板。3. 如權(quán)利要求1所述快速測(cè)定復(fù)合微生物菌劑中多粘類(lèi)芽孢桿菌含量的方法，其特征 在于：所述微生物培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。4. 如權(quán)利要求1所述快速測(cè)定復(fù)合微生物菌劑中多粘類(lèi)芽孢桿菌含量的方法，其特征 在于：步驟2)中，將待測(cè)復(fù)合微生物菌劑在含重量百分比為0. 1%Tween-80的生理鹽水中 溶解后，置于磁力攪拌器上，在室溫下攪拌30min，轉(zhuǎn)速為150rpm，然后再將該溶液置于超 聲水浴鍋中，超聲30min，制得待測(cè)樣品溶液。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種快速測(cè)定復(fù)合微生物菌劑中多粘類(lèi)芽孢桿菌含量的方法，所述復(fù)合微生物菌劑的活性成分為枯草芽孢桿菌、多粘類(lèi)芽孢桿菌和膠凍樣芽孢桿菌，本發(fā)明通過(guò)向培養(yǎng)基中加入一定濃度的氨芐西林鈉，抑制枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)，但不抑制多粘類(lèi)芽孢桿菌的生長(zhǎng)，從而避免了快速長(zhǎng)出的枯草芽孢桿菌對(duì)多粘類(lèi)芽孢桿菌統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的影響。該方法可以快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地測(cè)定復(fù)合微生物菌劑中多粘類(lèi)芽孢桿菌的含量。
【IPC分類(lèi)】C12R1/12, C12Q1/06
【公開(kāi)號(hào)】CN105200116
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510622375
【發(fā)明人】潘渝, 周莉, 袁善奎, 萬(wàn)俊, 馬朋, 鄒維, 唐緯坤, 劉荷梅, 胡承勇, 孫剛忠
【申請(qǐng)人】武漢科諾生物科技股份有限公司
【公開(kāi)日】2015年12月30日
【申請(qǐng)日】2015年9月25日