生物除磷功能菌的篩菌用培養(yǎng)基及強(qiáng)化除磷的篩菌方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明具體設(shè)及生物除憐功能菌的篩菌用培養(yǎng)基及強(qiáng)化除憐的篩菌方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物除憐系統(tǒng)中的功能菌在厭氧一好氧交替的環(huán)境中生存。厭氧階段，聚憐菌 分解體內(nèi)的聚憐顆粒釋放能量和憐酸鹽，用來(lái)吸收底物形成聚-beta-徑基-鏈燒酸醋 (PHAs)，而聚糖菌則分解體內(nèi)的糖原釋放能量來(lái)吸收底物形成PHAs;好氧階段，聚憐菌消 耗體內(nèi)的PHAs作為能量來(lái)源生長(zhǎng)和吸收憐酸鹽，而聚糖菌則消耗體內(nèi)PHAs來(lái)生長(zhǎng)和合成 糖原。在W上過(guò)程中，厭氧階段的底物充足與否直接影響到聚憐菌和聚糖菌的體內(nèi)PHAs儲(chǔ) 備是否充分；好氧階段的底物如果過(guò)多，聚憐菌和聚糖菌不消耗體內(nèi)PHAs,從而導(dǎo)致除憐 率降低和糖原合成不足。運(yùn)用傳統(tǒng)篩菌方法篩選生物除憐功能菌時(shí)，忽視了W上運(yùn)行環(huán)境 對(duì)菌體生長(zhǎng)和功能的影響。
[0003]目前篩選生物除憐微生物的方法都是將從反應(yīng)器中取出的污泥置于傳統(tǒng)培養(yǎng)基 巧曰牛肉膏蛋白腺培養(yǎng)基）中于室溫?fù)u瓶培養(yǎng)增殖，將增殖后的菌液稀釋后，涂布于固體傳 統(tǒng)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，W上方法存在W下問(wèn)題： 1.針對(duì)性不強(qiáng)。傳統(tǒng)篩菌方法是一種"廣撒網(wǎng)式"的篩菌方法，沒(méi)有考慮到功能菌是在 厭氧一好氧交替變化的生存環(huán)境下出現(xiàn)生理功能的，也就是說(shuō)沒(méi)有針對(duì)功能菌厭氧好氧交 替變化下的生理特性進(jìn)行篩選。
[0004] 2.雜菌滋生。由于傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)基適和所有細(xì)菌生存，且其中成分與生物除憐 系統(tǒng)的功能菌出現(xiàn)生理功能巧日聚憐菌出現(xiàn)除憐效果）的生長(zhǎng)環(huán)境不同，勢(shì)必導(dǎo)致一些非聚 憐菌大量繁殖，使得培養(yǎng)液中的聚憐菌比例下降。
[0005] 3.培養(yǎng)基不合適。生物除憐微生物是在厭氧一好氧交替變化的生存環(huán)境下出現(xiàn)生 理功能，即聚憐菌厭氧釋?xiě)z好氧吸憐，聚糖菌厭氧分解糖原好氧合成糖原。在運(yùn)兩個(gè)不同的 時(shí)期，功能菌所需的底物和憐元素含量是不同的，而傳統(tǒng)培養(yǎng)基沒(méi)有考慮到運(yùn)一點(diǎn)。
[0006] 4.工作量大。經(jīng)過(guò)了富集培養(yǎng)之后需要將菌液稀釋后涂布平板，挑取單菌落進(jìn)行 更進(jìn)一步的分離純化。由于W上=條，經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)基篩選出來(lái)的菌液中雜菌比例增大，因 此需要挑取更多的菌落確?？蒞分離到功能菌株，運(yùn)就增加了分菌的工作量，W后進(jìn)一步 驗(yàn)證運(yùn)些菌是否為生物除憐功能菌時(shí)的工作量會(huì)更大。因此需要更合適的培養(yǎng)基和篩選方 法來(lái)分離培養(yǎng)W及加強(qiáng)生物除憐功能菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種生物除憐功能菌的篩菌用培養(yǎng)基及強(qiáng) 化除憐的篩菌方法，所述篩選用培養(yǎng)基按照篩菌的順序分為厭氧相篩選用培養(yǎng)基，好氧相 篩選用培養(yǎng)基，固態(tài)分菌用培養(yǎng)基和液態(tài)分菌用培養(yǎng)基，其中厭氧相篩選用培養(yǎng)基和好氧 相篩選用培養(yǎng)基分別模擬厭氧階段和好氧階段的生長(zhǎng)環(huán)境，更適于功能菌的生長(zhǎng)，從而進(jìn) 一步將雜菌淘汰掉，固態(tài)分菌用培養(yǎng)基和液態(tài)分菌用培養(yǎng)基可強(qiáng)化功能菌的生長(zhǎng)；所述篩 菌方法充分考慮了運(yùn)行環(huán)境和底物環(huán)境對(duì)功能菌的影響，在厭氧-好氧富集過(guò)程模擬反應(yīng) 器運(yùn)行厭氧-好氧環(huán)境交替，使雜菌逐漸被淘汰，而使功能菌繼續(xù)生存。本發(fā)明的技術(shù)方案 為： 生物除憐功能菌的篩菌用培養(yǎng)基按照篩菌過(guò)程的使用順序依次為厭氧相篩選用 培養(yǎng)基、好氧相篩選用培養(yǎng)基，固態(tài)分菌用培養(yǎng)基和液態(tài)分菌用培養(yǎng)基，其中每升厭 氧相篩選用培養(yǎng)基是由0. 6~0. SgC&COOKiO. 2~0. 4邑邸3邸2〇)0胞，330~350mgNH4Cl， 490~510mgNa2S〇4,41~43mgCaCl2 ? 2H2〇,390~410mgMgCl2 ? 6H2〇，；34~36mg化2EDTA ? 6電0， 0.5~1.5mL微量元素液，2~4mL維生素液和余量的蒸饋水組成；每升好氧相篩選用培 養(yǎng)基是由90~llOmgN址2P04，158~160mg化2冊(cè)〇4,490~510mg化2S04,390~"OmgN&Cl， 48~SOmgCaClz .2&0,440~460mgMgCl2.6&0,：34~36mgNa2邸TA .6&0,1. 2~1. 4血微量元素液， 3. 4~3. 6血維生素液和余量的蒸饋水組成；每升固態(tài)分菌用培養(yǎng)基是由0. 6~0. SgC&COOK， 0. 2~0. AgCHsCHzCOONa，158~160mgNa2HP〇4,90~llOrngNaHsPO*，330~350mgNH4Cl， 41~43mgCaCl2 ? 2電0,390~"OmgMgClz ?細(xì)2〇,490~510mgNa2S〇4,34~36mg化2抓TA ? 6電0， 0. 9~1. 1血微量元素液，2. 9~3. 1血維生素液，14~16g瓊脂和余量的蒸饋水組成；每升 液態(tài)分菌用培養(yǎng)基是由 0.6~0.SgC&COOKiO.2~0.AgC&C&COONa，158~leOmgNazHPO" 90~1lOmg化H2PO4,330~350mgNH4Cl，41~43mgCaCl2?2也0,390~"OmgMgClz? 6H2O， 490~510mgNa2S〇4,：34~36mgNa2邸TA ? 6&0,0. 9~1.ImL微量元素液，2. 9~3. ImL維生素液和余 量的蒸饋水組成。
[000引所述微量元素液的成分和濃度為：化I0. 5g/l，F(xiàn)e2(S04)3 6. 5g/l，化化? 2&0 0. 07g/l，aiClz0. 17g/l，MnS04 ? &0 0. 3g/l，NazMcA? 2&0 0. 18g/l，CoS04 ? 7&0 0. 53 邑/1，&8030. 45g/L。
[0009] 所述維生素液的成分和濃度為：維生素B1 150mg/l，維生素B2 150mg/l，維生素 B6 300mg/U維生素B12 3g/l，泛酸巧150mg/l，煙酸150mg/L葉酸60mg/U對(duì)氨基苯 甲酸 150mg/L。
[0010] 采用上述厭氧相篩選用培養(yǎng)基、好氧相篩選用培養(yǎng)基，固態(tài)分菌用培養(yǎng)基和液態(tài) 分菌用培養(yǎng)基，強(qiáng)化除憐的篩菌方法，按照W下工藝步驟進(jìn)行： (1) 按照所述厭氧相篩選用培養(yǎng)基、好氧相篩選用培養(yǎng)基、固態(tài)分菌用培養(yǎng)基和液態(tài)分 菌用培養(yǎng)基的成分及濃度配置四種培養(yǎng)基，備用； (2) 取生物除憐反應(yīng)器中好氧結(jié)束的污泥離屯、聚集，棄去上清液后將聚集物用無(wú)菌水 沖洗3~4次； (3) 將厭氧相篩選用培養(yǎng)基置于血清瓶中，吹入氮?dú)庵裂鯕馀疟M，加入步驟（2)的污泥 聚集物，室溫下靜置12~1化； (4) 將步驟（3)的厭氧血清瓶中的上清液倒出，殘留物攬拌混勻后離屯、聚集； (5) 將好氧相篩選用培養(yǎng)基置于=角瓶中，加入步驟（4)的聚集物，采用透氣濾膜封口， 室溫下?lián)u床搖12~1化，得到菌懸液； (6) 將步驟（5)的菌懸液重復(fù)實(shí)施步驟（2)~ (5)7~8次，最終得到的菌懸液于 4000~420化/min離屯、聚集，棄去上清液； (7) 將步驟（6)的聚集物與無(wú)菌水混勻得到菌懸液，將菌懸液濃度稀釋10 6~10 8倍，涂 布于固態(tài)分菌用培養(yǎng)基平板，室溫下培養(yǎng)24~4化； (8) 挑取步驟（7)的單菌落接種到液態(tài)分菌用培養(yǎng)基中室溫下?lián)u床培養(yǎng)20~28h; (9) 將步驟（8)中得到的菌懸液進(jìn)行鏡檢，觀察菌株形態(tài)：菌株形態(tài)不一致時(shí)將菌懸液 離屯、聚集后重復(fù)實(shí)施步驟（7) ~ (9) 4~6次獲得除憐功能菌的純菌株；菌株形態(tài)一致時(shí)，直 接進(jìn)行下一步； (10) 將步驟（9)中獲得的除憐功能菌的純菌株菌懸液倒入10ml離屯、管中離屯、得到聚 集的菌體； (11) 對(duì)步驟（10)的除憐功能菌的純菌株進(jìn)行除憐能力的檢測(cè)，確定篩選的純菌株除憐 功能加強(qiáng)。
[0011] 將步驟（2)的污泥聚集物在厭氧血清瓶中放置12~1化，可W將一些專性好氧菌篩 掉，確保留在污泥中的都是與生物除憐有關(guān)的功能菌；將步驟（4)的污泥聚集物置于好氧 S角瓶中搖12~1化，由于所用培養(yǎng)基無(wú)底物，所W-些沒(méi)有在厭氧階段聚集PHA的好氧菌 就不會(huì)生長(zhǎng)，能夠吸收憐的還是一些功能菌，而厭氧和好氧都持續(xù)12hW上，運(yùn)種極限狀態(tài) 也是為了達(dá)到徹底篩除雜菌的目的。
[0012] 檢測(cè)篩選的純菌株除憐能力的方法為：①按照所述厭氧相篩選用培養(yǎng)基、好氧相 篩選用培養(yǎng)基、固態(tài)分菌用培養(yǎng)基和液態(tài)分菌用培養(yǎng)基的成分及濃度配置=種培養(yǎng)基，備 用；②取1ml純菌液置于裝有60ml液態(tài)分菌用培養(yǎng)基的S角瓶中，置于18~20°C搖床 中培養(yǎng)24~4化；③將S角瓶中的菌液分批倒入滅過(guò)菌的15ml離屯、管中，于4000~420化/ min離屯、10~15min，棄去上清液，收集菌體；④向15ml離屯、管中注入10ml厭氧篩選用 培養(yǎng)基混勻，吹入純氮?dú)?~3min，梓緊瓶蓋，置于18~20 °C搖床中培養(yǎng)2~化；⑥將離 屯、管于4000~420化/min離屯、10~15min，棄去上清液，收集菌體；⑧向離屯、管中注入好氧 篩選用培養(yǎng)基10ml，曝氣2~3小時(shí)；⑦重復(fù)實(shí)施步驟③~⑧6~8次進(jìn)行菌株的馴化；⑨ 將馴化的菌液于4000~42(K)r/min離屯、10~15min，收集菌體，棄去上清液；⑨離屯、管中 注入10ml厭氧篩選用培養(yǎng)基混勻，吹入純氮?dú)?~3min，梓緊瓶蓋，置于18~20 °C搖床 中培養(yǎng)2~化；⑩將離屯、管離屯、，使菌體沉淀，測(cè)量上清液中的憐含量，之后棄去上清液； 皎向離屯、管中注入檢測(cè)用培養(yǎng)基6ml混勻，曝氣2小時(shí)，分別在20分鐘、40分鐘、60分鐘、 90分鐘、120分鐘取樣0. 6ml，置于1. 5ml離屯、管中，于4000~4200r/min離屯、5~8min，棄去 沉淀，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的上清液中的憐濃度；?菌濁測(cè)定：將步驟(Q)中取樣之后的剩余菌 液3ml離屯、，棄去上清液，加入蒸饋水稀釋到30ml，測(cè)菌濁（0D600值)。
[0013] 所述步驟>強(qiáng)的檢測(cè)用培養(yǎng)基的成分及濃度為：NaH2P〇438mg/l，胞2冊(cè)〇469 mg/l，Na2S〇4500mg/l，NH4CI4OOmg/l，CaClz? 2&0 49mg/l，MgClz. 6&0 450mg/l， 胞2邸TA?6H2O35mg/L微量元素液11111/1，維生素液3ml/L。
[0014] 0D600值是使用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600時(shí)測(cè)得的數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)是菌濁的表征數(shù)值， 進(jìn)行處理之后可換算成菌懸液中的菌體濃度。
[0015] 步驟⑨上清液中的憐含量和步驟II不同時(shí)間段的液體憐濃度，使用鋼酸錠分光