一種食用菌菌絲快速pcr方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于快速PCR領(lǐng)域，特別設(shè)及一種食用菌菌絲快速PCR方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)簡稱PCR反應(yīng)，是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，在分子 生物學(xué)中有廣泛的應(yīng)用。
[0003] 通常PCR反應(yīng)之前首先需要提取基因組DNA作為擴(kuò)增模板，食用菌菌絲基因組DNA 提取方法常用CTAB法，需要的菌絲量大，耗時。盡管近年來不斷有公司開發(fā)出快速PCR試 劑盒，但主要針對植物和動物樣品，用于食用菌菌絲直接擴(kuò)增時，經(jīng)常出現(xiàn)擴(kuò)增不出特異性 條帶或?qū)φ找矓U(kuò)出條帶等問題，無法應(yīng)用于食用菌菌絲快速PCR擴(kuò)增。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種食用菌菌絲快速PCR方法，該方法所需菌 絲量少，無需耗時進(jìn)行基因組DNA提取，具有操作簡便，檢測時間短，準(zhǔn)確性高，穩(wěn)定性和重 復(fù)性好的優(yōu)點；可W利用少量菌絲進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得所需的目的DNA片段，縮短試驗進(jìn)程， 適用于大批量樣品的PCR擴(kuò)增。
[0005] 本發(fā)明的一種食用菌菌絲快速PCR方法，包括：
[0006] (1)用移液器吸取裂解液置于PCR管中，用滅菌牙簽挑取預(yù)先培養(yǎng)的食用菌菌絲 置于裂解液中離屯、，振蕩，再離屯、；
[0007] (2)W上述得到的菌絲裂解液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：12. 5yL擴(kuò)增 混合液，待擴(kuò)增基因特異性引物對各0. 5yL菌絲裂解液0. 5yL(1地2〇 11yL;PCR反應(yīng)條 件：95°C5min;95°C30s，（引物Tm值-5)°C30s，72°Clmin，35 個循環(huán)；72°ClOmin;
[0008] (3)取上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與加樣緩沖液混勻，點樣于瓊脂糖凝膠上，于緩沖液中電 泳，電泳結(jié)束后，用邸染色，然后拍照，即可。
[0009] 所述步驟（1)中的裂解液占PCR管體積的1/10。
[0010] 所述步驟（3)中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與加樣緩沖液的體積比為5:1。
[0011] 所述步驟（3)中的瓊脂糖凝膠濃度為1. 5%。
[0012] 所述步驟（3)中的電泳電壓為5V/cm。
[0013] 本發(fā)明不需要提取食用菌基因組DM,篩選獲得裂解液簡單快速處理少量菌絲樣 品作為模板，利用篩選獲得的PCR擴(kuò)增試劑盒即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得所需的目的DNA 片段。
[0014] 有益效果
[0015] 本發(fā)明所需菌絲量少，無需耗時進(jìn)行基因組DNA提取，具有操作簡便，檢測時間 短，準(zhǔn)確性高，穩(wěn)定性和重復(fù)性好的優(yōu)點；可W利用少量菌絲進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得所需的目 的DNA片段，縮短試驗進(jìn)程，適用于大批量樣品的PCR擴(kuò)增。
【附圖說明】
[0016] 圖1為草茹菌株交配型基因特異條帶擴(kuò)增圖；其中，M為Marker;1為草茹菌株 V23 ;2為對照。
[0017] 圖2為香茹菌株微管蛋白基因特異條帶擴(kuò)增圖；其中，M為Marker;1為香茹菌株 135 ; 2為對照。
【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，運些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可W對本發(fā)明作各種改動或修改，運些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0019] 實施例1
[0020] (1)菌絲培養(yǎng)：
[0021] 草茹菌株V23接種PDA試管，適宜溫度培養(yǎng)。
[0022] (2)PCR反應(yīng)模板制備：
[0023] 移液器吸取50yL裂解液置于0. 5血PCR管中，用滅菌竹制牙簽挑取少量菌絲置 于裂解液中，短暫離屯、，混勻器上振蕩1分鐘，短暫離屯、，W該裂解液為模板。
[0024] (3)PCR反應(yīng)體系及條件
[0025] 擴(kuò)增反應(yīng)體系（25化）：12.5擴(kuò)增混合液，待擴(kuò)增基因特異性引物對各0.5化，菌 絲裂解液 0. 5yLd地2〇 11yL。PCR反應(yīng)條件：95°C5min;95°C30second，55°C30second， 72°Clmin，35 個循環(huán)；72°ClOmin。
[0026] (4)電泳檢測
[0027] 取上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5iiL，與1yL加樣緩沖液混勻，點樣于1. 5%的瓊脂糖凝膠 上，于0. 5XTBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用邸染色，然后在凝膠成像儀上 拍照。
[002引利用該方法，采用草茹V23菌株交配型基因的特異性引物對 (F:GTGGTTGGGATGGAAGGTTGTGA，R:CTGTGAGGGTTTGTGGTGGGATA)，裂解液快速處理少量草茹 V23菌株菌絲后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，草茹V23菌株能擴(kuò)增出一條特異性條帶，對照不能擴(kuò)增 出條帶，如圖1所示。
[0029] 實施例2
[0030] (1)菌絲培養(yǎng)： 陽03U 香茹菌株135接種PDA試管，適宜溫度培養(yǎng)。
[0032] (2)PCR反應(yīng)模板制備：
[0033] 移液器吸取50yL裂解液置于0. 5血PCR管中，用滅菌竹制牙簽挑取少量菌絲置 于裂解液中，短暫離屯、，混勻器上振蕩1分鐘，短暫離屯、，W該裂解液為模板。
[0034] (3)PCR反應(yīng)體系及條件
[0035] 擴(kuò)增反應(yīng)體系（25化）：12.5化擴(kuò)增混合液，待擴(kuò)增基因特異性引物對各 0. 5yL，菌絲裂解液 0. 5yL，d地2〇llyL。PCR反應(yīng)條件：95°C5min;95°C30second， 50°C30second，72°Clmin，35 個循環(huán)；72°ClOmin。
[0036] (4)電泳檢測
[0037] 取上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5iiL，與1yL加樣緩沖液混勻，點樣于1. 5 %的瓊脂糖凝膠 上，于0. 5XTBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用邸染色，然后在凝膠成像儀上 拍照。 陽03引利用該方法，采用香茹微管蛋白基因特異性引物對燈UB1F:GAAGGTTAGCCGCAGCAT，TUB1R:CTCAAGGGCAGCCAAGTC)，裂解液快速處理少量香茹菌株135菌絲后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反 應(yīng)，香茹菌絲能擴(kuò)增出特異性條帶，對照不能擴(kuò)增出條帶，如圖2所示。
【主權(quán)項】
1. 一種食用菌菌絲快速PCR方法，包括： (1) 用移液器吸取裂解液置于PCR管中，用滅菌牙簽挑取預(yù)先培養(yǎng)的食用菌菌絲置于 裂解液中離心，振蕩，再離心； (2) 以上述得到的菌絲裂解液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：12.5yL擴(kuò)增混合 液，待擴(kuò)增基因特異性引物對各〇. 5yL，菌絲裂解液0. 5yL，CldH2O11yL;PCR反應(yīng)條件： 95°C5min;95°C30s，（引物Tm值-5)°C30s，72°Clmin，35 個循環(huán)；72°CIOmin; (3) 取上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與加樣緩沖液混勻，點樣于瓊脂糖凝膠上，于緩沖液中電泳， 電泳結(jié)束后，用EB染色，然后拍照，即可。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種食用菌菌絲快速PCR方法，其特征在于：所述步驟（1)中 的裂解液占PCR管體積的1/10。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種食用菌菌絲快速PCR方法，其特征在于：所述步驟（3)中 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與加樣緩沖液的體積比為5:1。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種食用菌菌絲快速PCR方法，其特征在于：所述步驟（3)中 的瓊脂糖凝膠濃度為1. 5%。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種食用菌菌絲快速PCR方法，其特征在于：所述步驟（3)中 的電泳電壓為5V/cm。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種食用菌菌絲快速PCR方法，包括：(1)制備PCR反應(yīng)模板；(2)PCR反應(yīng)；(3)電泳檢測。本發(fā)明所需菌絲量少，無需耗時進(jìn)行基因組DNA提取，具有操作簡便，檢測時間短，準(zhǔn)確性高，穩(wěn)定性和重復(fù)性好的優(yōu)點；可以利用少量菌絲進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得所需的目的DNA片段，縮短試驗進(jìn)程，適用于大批量樣品的PCR擴(kuò)增。
【IPC分類】C12Q1/68, C12R1/645, C12Q1/04
【公開號】CN105200139
【申請?zhí)枴緾N201510641076
【發(fā)明人】汪虹, 陳明杰, 趙妍, 馮愛萍, 辛苗苗
【申請人】上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年9月30日