一種肽適體及其作為稻瘟菌鈣調(diào)蛋白拮抗劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體地說，設(shè)及W葡萄球菌核酸酶為基本骨架的膚 適體及其在水稻稻攝病防治中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 稻攝病、白葉枯病和紋枯病被列為水稻=大主要病害。稻攝病是由稻攝霉 (Magnaporthegrisea)引起的水稻真菌性病害，分布范圍十分廣泛，90年代W來，我國稻 攝病的年發(fā)生面積均在5700萬畝W上，年損失稻谷達(dá)數(shù)億公斤。稻攝菌侵染過程依賴多種 信號通路參與調(diào)控，其中Ca2+信號通路在稻攝菌的生長發(fā)育、抱子萌發(fā)、侵染結(jié)構(gòu)形成和致 病性方面也具有重要作用。巧調(diào)蛋白（Calmo化lin，CaM)是Ca2+信號通路中的重要組成部 分，尤其與稻攝菌抱子萌發(fā)和附著胞形成密切相關(guān)。
[0003] 巧調(diào)蛋白括抗劑是W巧調(diào)蛋白為祀點的藥物，對研究巧調(diào)蛋白在稻攝菌致病性方 面的功能具有重要意義。但是，目前市場上巧調(diào)蛋白括抗劑均專一性不強(qiáng)，且無任何稻攝菌 巧調(diào)蛋白括抗劑的研究報道，使得巧調(diào)蛋白括抗劑不僅于稻攝菌巧調(diào)蛋白，還會影響其他 的通路蛋白，無法實現(xiàn)單一變量的實驗策略。
[0004] 膚適體（P巧tideaptamer，P巧aptemers)是人工合成的隨機(jī)氨基酸文庫中篩選 出的可特異性、高親和力結(jié)合祀標(biāo)的短膚。其主要結(jié)構(gòu)包括一段無生物活性的支架蛋白 (scafToldprotein)W及兩端固定在支架蛋白上的可變膚段。膚適體文庫的設(shè)計原理是 將大量人工合成的隨機(jī)膚序列，插入、整合于蛋白支架之上構(gòu)成膚庫，利用隨機(jī)區(qū)域的信號 基序（signalmotif)與祀蛋白之間的相互作用，篩選得到針對祀蛋白的高親和力、高特異 性的膚適體。本實驗室擁有庫容量約為1. 5-2.OXIO7的膚適體文庫：膚庫為可編碼16個 隨機(jī)氨基酸的寡核巧酸文庫，W改造的葡萄球菌核酸酶S化Se(Staphylococcalnuclease, SN)為腳手架蛋白，借助兩端限制性酶切位點，成功將隨機(jī)片段插入至挪ase中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種能夠作為稻攝菌巧調(diào)蛋白括抗劑的膚適體及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供的膚適體，其為SNP-D4,W葡萄球菌核酸酶為基本骨架，具有：
[0007] 1)沈QIDNo. 1所示的氨基酸序列；或
[0008] 2)SEQIDNo. 1所示氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸。
[0009] 本發(fā)明提供了編碼上述膚適體的基因，其具有：
[0010] DSEQIDNo. 2所示的核巧酸序列；或
[0011] 2)SEQIDNo. 1所示核巧酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或幾個核巧酸；或
[0012] 3)在嚴(yán)格條件下與1)限定的核巧酸序列雜交的核巧酸序列。
[0013] 含有上述編碼膚適體的基因表達(dá)載體屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014] 含有前述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015] 本發(fā)明提供了含有膚適體SNP-D4的生物制劑。
[0016] 本發(fā)明提供了含有膚適體SNP-D4的稻攝菌巧調(diào)蛋白括抗劑。
[0017] 本發(fā)明還提供了含有膚適體SNP-D4的農(nóng)藥。
[0018] 本發(fā)明提供了膚適體SNP-D4在植物保護(hù)方面的應(yīng)用和在抑制稻攝菌中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明提供了含有膚適體SNP-D4的生物制劑在在植物保護(hù)方面的應(yīng)用和在抑制 稻攝菌中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明提供了含有膚適體SNP-D4的農(nóng)藥在植物保護(hù)方面的應(yīng)用和在抑制稻攝菌 中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明提供了膚適體SNP-D4在制備抑制稻攝菌的生物制劑或農(nóng)藥中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明提供了膚適體SNP-D4在制備轉(zhuǎn)基因植物方面的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明具有下列優(yōu)點及有益效果：
[0024] 本發(fā)明提供的膚適體SNP-D4(氨基酸序列如SEQIDNo. 1所示，核巧酸序列如SEQ IDNo.2所示）既能與CaM特異性相互作用、又具有抑制稻攝菌抱子發(fā)育功能，可作為稻攝 菌巧調(diào)蛋白括抗劑在植物保護(hù)、抑制稻攝菌生長方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[00巧]圖1為稻攝菌CaMPCR擴(kuò)增產(chǎn)物1 %瓊脂糖電泳圖，其中M為DS5000Marker;1為 空白對照，2為稻攝菌CaM。
[0026] 圖2為顯微鏡下SNP-D4抑制稻攝菌生長的觀察圖。WPBS和挪ase處理組為陰 性對照，1% =環(huán)挫處理組為陽性對照，顯微觀察各組解育化、3h、化后抱子萌發(fā)及芽管形 成的差別。
【具體實施方式】
[0027]W下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0028]若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段； 若未特別指明，實施例中所用試劑均為市售。
[0029] 大腸桿菌E.COliXLl-BlueMRF'、E.COliXLl-BlueMR為實驗室保存菌種。質(zhì)粒 地T、pTRG、PBT-LGF2、pTRG-Galllp為實驗室保存質(zhì)粒。膚適體文庫pTRG-SNP由本實驗室 構(gòu)建。表達(dá)質(zhì)粒祀T32a-CaM已在文獻(xiàn)（馬志斌，劉靜，張紅玉，王立安.稻攝病菌巧調(diào) 素基因的克隆及原核表達(dá)特性研究.中國植物病理學(xué)會2008年學(xué)術(shù)年會論文集.2008. 5 月：249-253頁）中公開。稻攝病菌菌株Magnaportheoryzae為實驗室保存菌株。
[0030] 實施例1稻攝菌CaM基因的克隆 [00引]1、引物設(shè)計
[0032] 根據(jù)稻攝菌CaM核酸序列，使用PrimerPremier5.0和DNAMAN軟件設(shè)計上下游 引物（如表1所示），由上海生工生物工程股份有限公司合成。
[003引 表1稻攝菌CaMPCR擴(kuò)增引物
[0034]
[0035] 2、PCR擴(kuò)增
[003引 PCR反應(yīng)體系巧0 iU):
[0038] ?〇?反應(yīng)程序：94°(：，3111111;941：303,631：453,721：453，共30個循環(huán)，72°(：10111111。 PCR結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0039] 3、PCR產(chǎn)物回收
[0040] 利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒（上海捷瑞）進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化回收，電泳檢測回收的 DNA片段。
[0041] 4、"誘巧"重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0042] 4. 1 酶切
[004引 （1)稻攝菌CaM基因片段雙酶切
[0044] ①稻攝菌CaM基因片段，酶切體系如下：
[0045]
[0046] ②37 °C酶切化。純化，溶于30yITE緩沖液。
[0047] 似"誘巧"表達(dá)載體地T雙酶切 [004引①地T載體雙酶化體系如下：
[0049]
[0050] ②37°C酶切化，取0.加1 1XCIP處理30min?；厥?、純化，溶于30y1TE緩沖液。
[0051] 4. 2連接反應(yīng)
[005引按照載體/基因片段摩爾比為1:3或者1:4,使用T4DNAligase進(jìn)行連接反應(yīng)，反 應(yīng)體系（10iU)如下；
[0053]
[0054]
[00巧]16°C處理4h后，存放于-20°c用于后續(xù)實驗
[0056] 4. 3XL1-BLUEMRF'感受態(tài)細(xì)胞的制備
[0057] 采用化Clz法制備化I-BL肥MRF'大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。
[005引4. 4熱激轉(zhuǎn)化
[0059] (1)向大腸桿菌XLl-BL肥MRF'的化化感受態(tài)細(xì)胞中加1y1重組質(zhì)粒DNA，輕 輕搖勻，冰上放置30min;
[0060] (2) 42°C水浴熱激90s，立即放入冰上冷卻2min;
[0061] (3)加SOOul LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床溫育1-化；
[0062] (4)取 200ul菌液涂布于Cam/IPTG/X-gal平板上，37°C培養(yǎng) 12h。
[0063] 4. 5陽性克隆的篩選
[0064] 挑取Cam/IPTG/X-gal平板上長出的白色菌落劃線，37°C培養(yǎng)12h。
[0065] 4.6菌落PCR驗證陽性克隆
[0066] 分別采用CaM上下游引物CaM-F/CaM-R和地T載體上游引物地T-F 5'TCCGTTGTGGGGAAAGTTATC3'與CaM下游引物CaM-R兩對引物對陽性克隆進(jìn)行菌落PCR驗 證。
[0067]PCR驗證體系①：細(xì)菌裂解上清 1y1，CaM-FO. 5y1，CaM-R0. 5y1，2XPCRmix 6y1，(1地2〇 4y1，總體積 12y1。
[0068]PCR程序：94°CSmin;94°C30s, 63°C45s, 72°C45s,共 25 個循環(huán)；72°ClOmin。
[0069]PCR驗證體系②：細(xì)菌裂解上清Iy1，pBT-F0. 5y1，CaM-RO. 5y1，2XPCRmix 6yI，(1地2〇 4yI，總體積 12yI。
[0070]PCR程序：94°CSmin;94°C30s, 57°C45s, 72°C45s,共 25 個循環(huán)；72°ClOmin。 [007。 選用引物CaM-F/R，W質(zhì)粒祀T32a-CaM為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳 檢測PCR產(chǎn)物，如圖1所示，在分子量450bp處出現(xiàn)一條與預(yù)期分子量大小一致的目的片 段。將獲得的陽性克隆送往生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果見SEQIDNO. 3。將 pBT-CaM測序結(jié)果進(jìn)行NCBI-BLAST分析化ttp://www.nicbi.nlm.gov/)。結(jié)果顯示，測序 結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的稻攝菌巧調(diào)蛋白（Calmcxlulin，CaM)基因序列（GenBanK序列號： FJ865430. 1)匹配率為100%。由此說明，"誘巧"重組質(zhì)粒地T-CaM構(gòu)建成功。
[0072] 實施例2對稻攝菌抱子具有抑制功能的膚適體的篩選
[0073] 1、細(xì)菌雙雜交篩選特異性膚適體
[0074] (1)37°C預(yù)熱SOC培養(yǎng)液，并于-20°C預(yù)冷電轉(zhuǎn)杯和1. 5ml離屯、管若干；
[0075] 似取出-80°C保存的XLl-BLUEMRF'甘油感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍15min左
[007引做設(shè)置電轉(zhuǎn)化參數(shù)（電壓1.化V，電阻400Q，電容25y巧；
[0077] (4)添加50ng實施例1獲得的誘巧質(zhì)粒地T-CaM和50ngpTRG-SNP膚適體文庫。 該膚適體文庫構(gòu)建方法為：
[007引 1)提取葡萄球菌基因組分別用5SNA及3SNA，5SNB及3SNB進(jìn)行PCR，用對應(yīng)酶切， 連接到載體pTRG上，構(gòu)建成pTRG-SN。
[0079] 5SNA: 5'-GGATCCGCGGCCGCAATGGGTTACCCATACGACGTTC-3' 度amHI位點）
[0080] 3SNA:5'-GTACTTA