一種強分泌生產克氏原螯蝦pmca蛋白的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高效分泌生產克氏原螯蝦質膜Ca2+-ATPase (PMCA)蛋白的方法，屬于生物工程技術領域。
【背景技術】
[0002]如何實現(xiàn)無/弱副作用的人工卵巢發(fā)育調控一直是經濟蝦蟹養(yǎng)殖的重要難題之一。目前人們雖已摸索出不少促蝦蟹卵巢快速成熟方法，如控溫、控光、強化營養(yǎng)條件、激素處理等，但眼柄切除仍是不少蝦蟹人工育苗生產中促進親蝦卵巢快速成熟及產卵的最常用、最有效方法。目前在蝦蟹繁殖季節(jié)，人工切除雌性蝦蟹的單側眼柄用以促進卵巢同步發(fā)育、快速成熟，提高抱卵量，已在不少國家較為普遍應用于多種海洋和淡水經濟蝦蟹(如斑節(jié)對蝦、大西洋龍蝦、鋸緣青蟹等)的規(guī)?；B(yǎng)殖中。然而，應用實踐中會出現(xiàn)無法避免的副作用:切除眼柄后易致親體蛻皮周期縮短、死亡率上升、卵子質量下降等不良后果。眼柄切除誘導蝦蟹類卵巢快速發(fā)育成熟(簡稱卵巢“眼柄切除效應”)存在相似的分子機制，深入闡明該分子機制將非常有助于發(fā)掘到新的、更合理的人工生殖調控分子靶點，從而指導發(fā)展可替代眼柄切除、無/弱副作用的人工卵巢促熟思路和方法，對于經濟蝦蟹類人工養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有重要價值。克氏原螯4下(Procambarus clarkii)，俗稱龍4下、小龍4下，隸屬節(jié)肢動物門、甲殼綱、十足目，是具較高經濟價值的水產養(yǎng)殖品種之一，是研究蝦蟹類卵巢“目艮柄切除效應”分子機制的一種非常好的代表動物。
[0003]PMCA蛋白在細胞內的主要作用是在Ca2+信號刺激后做精細的排Ca 2+掃尾工作，并長效地維持靜息狀態(tài)下胞內Ca2+濃度，受到CaM的正調控，是鈣信號通路(calciumsignaling pathway)的重要調控分子。我們前期的研究表明calcium signaling pathway在克氏原螯蝦“眼柄切除效應”的卵巢發(fā)育早期很可能發(fā)揮重要調控作用。深入研究克氏原螯4下calcium signaling pathway在“眼柄切除效應”誘導卵巢快速發(fā)育成熟中的作用和調控機制，首先需要獲得大量高活性的PMCA蛋白，并用以制備PMCA蛋白單/多克隆抗體。因此我們采用生物安全級的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)重組表達系統(tǒng)，構建高效分泌表達克氏原螯蝦PMCA蛋白的基因工程菌，同時建立高產量發(fā)酵方法，為后續(xù)深入研究克氏原螯蝦卵巢“眼柄切除效應”的分子機制奠定重要基礎。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種高效分泌表達克氏原螯蝦PMCA蛋白的基因工程菌，是將克氏原螯蝦PMCA基因以pMA0911為表達載體，以枯草芽孢桿菌為宿主構建得到的基因工程菌，所述枯草芽孢桿菌是B.subtilis WB400、WB600或WB800中的一種。
[0005]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述枯草芽孢桿菌是B.subtilis WB600。
[0006]本發(fā)明的第二個目的在于提供上述基因工程菌的構建方法，成功分泌表達了克氏原螯蝦PMCA蛋白，主要包括以下步驟:(I)PCR擴增或化學合成PMCA基因序列，(2)將PMCA基因與表達質粒pMA09ll(wapA)連接，構建重組質粒pMA0911_PMCA ; (3)隨后將pMA0911-PMCA轉化枯草芽孢桿菌表達菌株WB600，篩選驗證獲得陽性轉化子。
[0007]在本發(fā)明的一種實施方式中，表達質粒pMA0911自身信號肽替換為wapA信號肽。
[0008]本發(fā)明的第三個目的在于提供應用上述基因工程菌分泌生產PMCA蛋白的方法，主要包括以下步驟:將重組菌用種子培養(yǎng)基活化后，以5-8%接種量菌液轉入裝液量50% -60%的發(fā)酵罐中，通氣量0.8-1.0vvm，攪拌轉速300_400r/min，pH不作控制，37 °C培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)基成分為玉米淀粉22-32g/L，蛋白胨12-16g/L，酵母抽提物8_12g/L，硫酸銅
0.10-0.15mM0
[0009]在本發(fā)明的一種實施方式中，將重組菌用種子培養(yǎng)基活化后，以7%接種量菌液轉入裝液量1.6L的3L發(fā)酵罐中，通氣量1.2vvm，攪拌轉速400r/min，pH不作控制，37°C培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)基成分為玉米淀粉26g/L，蛋白胨14g/L，酵母抽提物10g/L，硫酸銅0.13mM。
[0010]本發(fā)明還提供一種高效分泌表達克氏原螯蝦PMCA蛋白的方法，以重組表達了克氏原螯蝦PMCA基因的枯草芽孢桿菌為生產菌株，發(fā)酵生產克氏原螯蝦PMCA蛋白。
[0011]在本發(fā)明的一種實施方式中，將PMCA基因與表達質粒PMA09Il(WapA)連接，構建重組質粒pMA0911-PMCA，然后轉化枯草芽孢桿菌表達菌株WB600，獲得重組菌；發(fā)酵培養(yǎng)基成分為玉米淀粉22-32g/L，蛋白胨12-16g/L，酵母抽提物8-12g/L，硫酸銅0.10-0.15mM ;于37 °C通風發(fā)酵。
[0012]本發(fā)明相比現(xiàn)有技術的有益效果:本發(fā)明首次以枯草芽孢桿菌為表達宿主，實現(xiàn)了克氏原螯蝦PMCA蛋白的高效分泌表達，重組PMCA蛋白的表達量約占上清液總蛋白量的60%，產量約1.06mg/mL,目前國際上無任何有關重組表達克氏原螯蝦PMCA蛋白的報道。
【具體實施方式】
[0013]在本發(fā)明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。
[0014]下面結合具體的制備實施例和應用實施例，并參照數據進一步詳細地描述本發(fā)明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0015]在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規(guī)方法。
[0016]實施例1重組質粒pMA0911-PMCA的構建。
[0017]克氏原螯蝦PMCA基因的序列(GenBank登錄號:AY455931)，設計引物PMCA-1:(5' -TCAGGAGTCGACATGGGCGACGATGCCAATAGTTC-3')和 PMCA-2: (5' -ACTGAGAAGCTTTCACAGAGCGAGTGGCATCCCTGAG-3')，利用PCR將PMCA基因的DNA編碼框5 ’和3 ’兩側分別弓丨入Sal I和Hind I II限制性酶切位點(下劃線表示)；通過雙酶切、分子連接等基因操作將PMCA基因插入到表達質粒pMA0911 (wapA)，構建重組質粒pMA0911_PMCA。
[0018]實施例2SDS-PAGE分析B.subtilis WB600基因工程菌分泌表達的克氏原螯蝦PMCA蛋白。
[0019]在卡那霉素濃度為50yg/mL的LB培養(yǎng)基中接種基因菌單克隆，37°C、100r/min培養(yǎng)過夜。隨后將100 μ L過夜培養(yǎng)的菌液接種于10mL (含50 μ g/mL卡那霉素與0.13mM硫酸銅)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C、200r/min搖床培養(yǎng)24h，隨后取出發(fā)酵液，8000r/min離心1min得到上清液，即為粗酶液。進一步利用離子交換層析法對粗酶液進行分離純化。取粗酶液和純化后的酶液進行12 %的SDS-PAGE蛋白電泳。上述相關方法均采用常規(guī)操作步驟。
[0020]實施例3發(fā)酵培養(yǎng)基條件的優(yōu)化。
[0021]對發(fā)酵培養(yǎng)基中的玉米淀粉、蛋白胨及酵母抽提物濃度進行優(yōu)化實驗，并對發(fā)酵最佳溫度進行研究，玉米淀粉濃度為26g/L時PMCA蛋白產量最高，達到0.755mg/mL ;蛋白胨濃度為14g/L、酵母抽提物濃度為10g/L、發(fā)酵溫度37°C時，CaM蛋白產量可進一步提高到
0.910mg/mL 左右。
[0022]實施例4利用摸索出的最優(yōu)發(fā)酵條件進行3L發(fā)酵罐規(guī)模的克氏原螯蝦PMCA蛋白發(fā)酵生產。
[0023]重組菌用種子培養(yǎng)基活化后，菌液轉入(7%接種量)3L發(fā)酵罐，裝液量1.6L，發(fā)酵培養(yǎng)基成分為玉米淀粉26g/L，蛋白胨14g/L，酵母抽提物10g/L，硫酸銅0.13mM。通氣量
1.2vvm,攪拌轉速400r/min，pH不作控制，37°C培養(yǎng)40h后發(fā)酵結束，此時發(fā)酵液中克氏原螯蝦PMCA蛋白產量最高，約1.06mg/mL。SDS-PAGE分析發(fā)酵上清液總蛋白顯示明顯特異表達條帶，條帶分子量與預期大小分子量?131.0kD—致。在此條件下，重組克氏原螯蝦PMCA蛋白的表達量約占上清液總蛋白量的60 %，全為可溶性活性狀態(tài)。
[0024]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1.一種高效分泌生產克氏原螯蝦質膜Ca 2+-ATPase (PMCA)蛋白的基因工程菌，其特征在于，是將克氏原螯蝦PMCA基因以pMA0911為表達載體，以枯草芽孢桿菌為宿主構建得到的基因工程菌，所述枯草芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌WB400、WB600或WB800中的一種。2.根據權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述PMCA基因的序列為GenBank登錄號:AY455931。3.根據權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌是B.subtilisffB600o4.一種構建權利要求1-3任一所述基因工程菌的方法，其特征在于，主要包括以下步驟:(I)PCR擴增或化學合成PMCA基因序列；(2)將PMCA基因與表達質粒pMA0911連接，構建重組質粒pMA0911-PMCA ； (3)將重組質粒pMA0911-PMCA轉化枯草芽孢桿菌，篩選驗證獲得陽性轉化子。5.權利要求1-3任一所述基因工程菌在分泌生產PMCA蛋白中的應用方法。6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，主要包括以下步驟:將重組菌用種子培養(yǎng)基活化后，以5-8%接種量菌液轉入裝液量50% -60%的發(fā)酵罐中，通氣量0.8-1.0vvm，攪拌轉速300-400r/min，pH不作控制，37°C培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)基成分為玉米淀粉22_32g/L，蛋白胨 12-16g/L，酵母抽提物 8-12g/L，硫酸銅 0.10-0.15mM。7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，將重組菌用種子培養(yǎng)基活化后，以7%接種量菌液轉入裝液量1.6L的3L發(fā)酵罐中，通氣量1.2vvm，攪拌轉速400r/min，pH不作控制，37°C培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)基成分為玉米淀粉26g/L，蛋白胨14g/L，酵母抽提物10g/L，硫酸銅0.13mM08.一種高效分泌表達生產克氏原螯蝦PMCA蛋白的方法，其特征在于，以重組表達了克氏原螯蝦PMCA基因的枯草芽孢桿菌為生產菌株，發(fā)酵生產PMCA蛋白。9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，將PMCA基因與表達質粒pMA0911連接，構建重組質粒pMA0911-PMCA，然后轉化枯草芽孢桿菌表達菌株WB600，獲得重組菌；發(fā)酵培養(yǎng)基成分為玉米淀粉22-32g/L，蛋白胨12-16g/L，酵母抽提物8-12g/L，硫酸銅0.10-0.15mM，于37 °C通風發(fā)酵。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效分泌生產克氏原螯蝦質膜Ca2+-ATPase(PMCA)蛋白的方法，屬于生物工程技術領域。本發(fā)明以克氏原螯蝦PMCA基因，構建分泌表達載體pMA0911-PMCA并轉化枯草芽孢桿菌表達菌株WB600中，通過培養(yǎng)條件優(yōu)化，實現(xiàn)了高效分泌表達生產。本發(fā)明利用基因工程方法高效制備出高活性重組克氏原螯蝦PMCA蛋白，為后續(xù)針對克氏原螯蝦卵巢“眼柄切除效應”分子機制的深入研究奠定了重要基礎。
【IPC分類】C12N1/21, C12N9/14, C12N15/75, C12N15/55, C12R1/125
【公開號】CN105219690
【申請?zhí)枴緾N201510651855
【發(fā)明人】管政兵, 水燕, 廖祥儒, 蔡宇杰, 戴紫雯
【申請人】江南大學
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2015年10月10日