一種利用光敏基因創(chuàng)制避蔭性玉米種質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 在本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)及作物遺傳育種領(lǐng)域，具體設(shè)及一種利用光敏基因 創(chuàng)制避蔭性玉米種質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著耕地面積的日益減少，人們對(duì)玉米的需求量越來(lái)越大，提高玉米的產(chǎn)量是我 國(guó)主要的生產(chǎn)目標(biāo)。要提高玉米產(chǎn)量，選育優(yōu)良的玉米種質(zhì)是關(guān)鍵，而轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)是與 常規(guī)育種方法相比更為經(jīng)濟(jì)有效的措施之一。
[0003] 在影響玉米產(chǎn)量的多種因子中，光信號(hào)尤為重要，光不僅作為一種能源，還作為一 種重要的環(huán)境信號(hào)。光敏色素在植物個(gè)體發(fā)育過(guò)程中作為主要的光受體，發(fā)揮了重要的作 用。在植物中，光敏色素通常為幾個(gè)同源基因構(gòu)成一基因家族，在各個(gè)物種中都有其獨(dú)特的 基因家族，功能也有一些特殊的變化。
[0004] 從有關(guān)光敏色素研究可W看出光敏色素對(duì)作物的產(chǎn)量有著直接的影響。如：Alexan化a等人利用擬南芥/?片疆因轉(zhuǎn)化馬鈴馨，最終使馬鈴馨塊莖產(chǎn)量增加。 Boccalan化O等人也利用擬南芥巧?術(shù)盛因轉(zhuǎn)化馬鈴馨，轉(zhuǎn)基因植株在田間種植的結(jié)果顯示 可增加光和效率并且高度密植時(shí)避陰性反應(yīng)很弱。Kong等人將擬南芥/?知基因轉(zhuǎn)入水稻 后，都使水稻產(chǎn)量增加，并改善了水稻的農(nóng)藝性狀。但迄今為止，還尚未見(jiàn)到有關(guān)利用光 敏色素基因在玉米株型育種上發(fā)揮作用，培育適應(yīng)合理密植的玉米品種的相關(guān)報(bào)道。
[0005] 本發(fā)明利用光敏色素信號(hào)通路對(duì)玉米光敏色素性狀進(jìn)行改造，將玉米中光敏色素 基因再轉(zhuǎn)入玉米中，提高玉米避蔭性，改良玉米品質(zhì)及特性，進(jìn)而提高其產(chǎn)量。另外，本發(fā)明 選擇的是玉米內(nèi)源的光敏色素基因進(jìn)行研究，其原因是因?yàn)槟壳盀橹?，基本都是通過(guò)轉(zhuǎn)外 源光敏色素基因來(lái)進(jìn)行修飾作物性狀，如將擬南芥的光敏色素轉(zhuǎn)入水稻、小麥、馬鈴馨、棉 花等等。對(duì)于轉(zhuǎn)內(nèi)源光敏色素基因還未有研究。外源基因轉(zhuǎn)入受體中，可能會(huì)造成基因排 斥，使得基因不易轉(zhuǎn)入，即使成功轉(zhuǎn)入也可能會(huì)造成基因沉默。而轉(zhuǎn)內(nèi)源基因大大增加轉(zhuǎn)基 因株系陽(yáng)性率，減小基因沉默的可能。因此，本發(fā)明對(duì)玉米種質(zhì)的發(fā)展及改善玉米避蔭性有 著均有較大的價(jià)值和意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的主要目的就是針對(duì)玉米避蔭性問(wèn)題，提供一種利用光敏色素基因在玉米 中過(guò)表達(dá)，引起植物光信號(hào)機(jī)制的有利變化，從而改良植物的株型和避蔭性的新途徑。
[0007] 本發(fā)明所提供的創(chuàng)制避蔭性玉米種質(zhì)的方法包括將光敏色素基因家族中的 化知厶化知義化_炒7基因分別導(dǎo)入玉米，得到光敏色素基因過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因玉米后，進(jìn)行 田間試驗(yàn)篩選和創(chuàng)制避蔭性優(yōu)良的玉米種質(zhì)的步驟。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下： (1)植基因表達(dá)載體的構(gòu)建： 1)目的基因的獲得：從玉米B73中分別擴(kuò)增得到玉米內(nèi)源光敏色素基因巧?知厶巧?知義 /?片A送公司測(cè)序后將擴(kuò)增序列正確的目的基因產(chǎn)物保存在4°C冰箱備用； 2) 載體大片段的獲得： 植物表達(dá)載體大片段（pTFlOl. 1-化i-r-nos): 在pTFlOl. 1基礎(chǔ)載體上(其中含有《ar基因作為篩選基因)，添加啟動(dòng)子化 終止子T-NOS后構(gòu)建的新的表達(dá)載體，光敏色素基因（/?知A/?知義/?炒。將插入在 pTFlOl. 1-化體T-DNA區(qū)中化W做和況?a/酶切位點(diǎn)間，啟動(dòng)此目的基因表達(dá)的是 玉米泛素化啟動(dòng)子化切心。化終止此目的基因表達(dá)的是/'-COS終止子； 植物表達(dá)載體大片段（pCUbil390): 其T-DNA區(qū)中含有潮霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶（妊W)選擇標(biāo)記基因和啟動(dòng)潮霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶 (妊口7)的仍必口仿啟動(dòng)子，玉米光敏色素基因（化知A化知義化炒。將插入在T-DNA區(qū)中 化Mffi和成el酶切位點(diǎn)間，啟動(dòng)目的基因表達(dá)的是玉米泛素化啟動(dòng)子化切心。卻終止目的 基因表達(dá)的是終止子； 3) 準(zhǔn)備好上述DNA片段后，再將化知A化知義化_炒7的DNA片段與載體大片段分別經(jīng) 酶切，于16°C連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物經(jīng)酶切驗(yàn)證后送公司測(cè)序；將測(cè)序結(jié)果正確的連接產(chǎn) 物熱激轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，用壯觀素、利福霉素抗性培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌，挑取單 菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定；將驗(yàn)證后的農(nóng)桿菌菌液保存?zhèn)溆茫?(2) 通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織： 1) 浸染： 將含有構(gòu)建好的植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌接種到含50mg/L利福平和50mg/L壯觀霉 素的Y邸培養(yǎng)基，于28°C培養(yǎng)2天；挑取單個(gè)菌落于含相應(yīng)抗生素的1mLY邸培養(yǎng)基中， 28°C、180r/min振蕩培養(yǎng)12h，再將其加入含相應(yīng)抗生素的50mL培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)至 0成。。=0. 5 ;4°C、4000r/min離屯、10min收集菌體，用等體積的液體浸染培養(yǎng)基懸浮；將待 轉(zhuǎn)化優(yōu)良玉米自交系的愈傷組織分別浸入含乙酷下香酬（AS)的浸染培養(yǎng)液，黑暗浸染3 mi打； 2) 共培、恢復(fù)和篩選： 將已浸染了農(nóng)桿菌的愈傷組織置于含滅菌紙的培養(yǎng)皿上，吸干多余水分后放空皿培 養(yǎng)，21°C暗培養(yǎng)3d;3d后的愈傷組織接種到恢復(fù)培養(yǎng)基上25°C暗培養(yǎng)7d;恢復(fù)培養(yǎng)后 的愈傷組織轉(zhuǎn)接到含1.5mg/L除草劑草下麟的選擇培養(yǎng)基上；25d后將抗性愈傷組織轉(zhuǎn) 接到新鮮的篩選培養(yǎng)基上；連續(xù)篩選3代，除草劑濃度按1.5mg/L、3mg/L、4. 5mg/L遞增； 每次轉(zhuǎn)接都淘汰褐化的愈傷組織； 3) 轉(zhuǎn)基因植株的再生： 選取抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，2-3周后，將分化出的幼苗轉(zhuǎn)移到生根壯苗 培養(yǎng)基上，生根壯苗培養(yǎng)基為：MS鹽和維生素+肌醇100mg/L+生根粉ABT0.25 g/L+薦 糖30g/L+瓊脂6 g/L pH 6.0;26°C光照培養(yǎng)16小時(shí)/d,即得到T。轉(zhuǎn)基因再生植株； 對(duì)再生植株進(jìn)行PCR檢測(cè)、測(cè)序等分子檢測(cè)，篩選出陽(yáng)性T。植株自交留種； (3) 按隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)高低不同密度種植方案，種植轉(zhuǎn)基因植株W及其與常用自 交系的（3至5個(gè)）雜交組合，調(diào)查測(cè)定相關(guān)數(shù)據(jù)，對(duì)田間試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，篩選獲得避蔭 性W及產(chǎn)量?jī)?yōu)良的轉(zhuǎn)基因玉米種質(zhì)。
[0009] 截至目前，本發(fā)明已成功獲得高代轉(zhuǎn)基因玉米植株，田間實(shí)驗(yàn)證明，光敏色素基因 的過(guò)量表達(dá)，對(duì)玉米株型有顯著影響。
[0010] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是： 迄今為止，尚未見(jiàn)到有關(guān)利用光敏色素基因在玉米株型育種上發(fā)揮作用的相關(guān)報(bào)道。 玉米光敏色素基因轉(zhuǎn)入玉米，導(dǎo)致過(guò)表達(dá)，支持了重要農(nóng)業(yè)作物過(guò)表達(dá)光敏色素具有重要 作用的假設(shè)。近年來(lái)，生物技術(shù)方法嘗試減少避蔭反應(yīng)來(lái)提高高密度種植作物的產(chǎn)量。一 個(gè)有效的策略是通過(guò)光敏色素的過(guò)表達(dá)來(lái)抑制伸長(zhǎng)反應(yīng)。由于光敏色素控制植物的生理過(guò) 程，過(guò)表達(dá)光敏色素基因?qū)χ参锷磉^(guò)程的調(diào)控機(jī)制有所影響。
[0011] 此外，本發(fā)明選擇了玉米內(nèi)源基因進(jìn)行研究，目前為止，現(xiàn)有研究基本都是通過(guò)轉(zhuǎn) 外源光敏色素基因來(lái)進(jìn)行修飾作物性狀，如將擬南芥的光敏色素轉(zhuǎn)入水稻、小麥、馬鈴馨、 棉花等等。對(duì)于轉(zhuǎn)內(nèi)源光敏色素基因還未有研究。外源基因轉(zhuǎn)入受體中，可能會(huì)造成基因排 斥，使得基因不易轉(zhuǎn)入，即使成功轉(zhuǎn)入也可能會(huì)造成基因沉默。而轉(zhuǎn)內(nèi)源基因大大增加轉(zhuǎn)基 因株系陽(yáng)性率，減小基因沉默的可能。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米，改良玉 米品質(zhì)及特性，培育出具有優(yōu)良避蔭性的玉米轉(zhuǎn)基因植株，并在玉米株型育種上發(fā)揮作用， 從根本上解決玉米種植密度受限的問(wèn)題，顯著提高玉米產(chǎn)量，提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0012]
【附圖說(shuō)明】
[001引圖1為擴(kuò)增目的基因化知A化知滿]電泳圖； 圖2為擴(kuò)增目的基因/?炒7的電泳圖； 圖3為圖玉米幼胚誘導(dǎo)出的愈傷組織圖； 圖4為圖玉米愈傷組織的分化圖； 圖5為圖分化出的幼苗轉(zhuǎn)生根培養(yǎng)圖； 圖6為拔節(jié)期轉(zhuǎn)基因株系的對(duì)照差異圖，左邊為轉(zhuǎn)基因18-5993::7皿％知7株系，右邊 為轉(zhuǎn)基因18-599R::通?化炒7株系； 圖7為抽雄期轉(zhuǎn)基因株系的對(duì)照差異圖。
[0014]
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明的上述
【發(fā)明內(nèi)容】
作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0016] 但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述實(shí)施例。在不脫離本發(fā)明上 述技術(shù)思想情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，做出各種替換和變更，均應(yīng)包括 在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0017] 實(shí)施例1 本實(shí)施例為光敏色素基因化知厶化知義/?炒7的克?。?1.化知A化知滿]克隆： 用PrimerPrimier5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，將合成的全長(zhǎng)引物稀釋為10ymol濃度， 對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物CDNA利用LATaq酶進(jìn)行PCR，退火溫度為62 °C。
[0018]AlF:5'TCGGATCCGAATTCATGTCTTCCTTGAGGCC3'， AlR:5'GTCGAGACTAGTTCAATGTCCAGCTGCTGA3' ； A2F:5'TCGGTACCGGATCCGAATTCATGTCTTCCTCGAG3'， A2R:5'GTCGAGACTAGTTCATCGTCCAACTGCTGA3'。
[0019] 擴(kuò)增體系（20JiL)為：
反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物在1.0 %瓊脂糖上檢測(cè)（圖1)，并回收目的條帶，送公司測(cè) 序，結(jié)果正確。
[0020] 2. /?炒7的克隆
在上游引物添加化W"/酶切位點(diǎn)（下劃線堿基)，下游引物添加況731酶切位點(diǎn)（下劃線 堿基)。酶切位點(diǎn)之前添加3個(gè)保護(hù)堿基。
[0021] 擴(kuò)增體系（50JiL)為： SXpsBuffer 10yL dNTRnix 4 yL 上游引物 2 iiL 下游引物 2 iiL DNA模板 5yL 局保真酶 0. 6JiL d地20 26. 4yL 擴(kuò)增程序?yàn)椋?94°C，3min;98°C，10s;72°C，90s;：M個(gè)循環(huán)；72°C，8min;12°C保持 反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物在1.0 %瓊脂糖上檢測(cè)（圖2)，并回收目的條帶，送公司測(cè) 序，結(jié)果正確。
[002引 實(shí)施例2 本實(shí)施例為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米過(guò)程： 1.農(nóng)桿菌熱擊感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 (1)取-70°C保存的100yL農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)室中已保存)，置于冰上解凍至冰 水混合物狀態(tài)。
[0023] (2)加入1yL構(gòu)建好的植物表達(dá)載體，輕輕搖勻后，放置冰上30min。
[0024] (3)置于液氮中速凍1min, 37°C水浴5min,然后加1血YEB液體培養(yǎng)基(含50 mg/血利福平)，28〇C慢速振蕩培養(yǎng)4h。
[00巧](4)將100yL培養(yǎng)物涂于含利福平（50mg/mL)和壯觀霉素（50mg/mL)的YEB平板上，正面向上放置30min,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，28°C培養(yǎng)大約48 h。
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