一種結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變的檢測方法及試劑盒和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種結(jié)核分枝桿菌利福平 耐藥突變的檢測方法及試劑盒，更具體地說，本發(fā)明涉及一種結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突 變的檢測方法及試劑盒和應(yīng)用。本發(fā)明還提供了設(shè)計在rpoB基因利福平耐藥決定區(qū)相關(guān) 區(qū)域的、具有高度的特異性的引物組。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium1:ube;rculosis)簡稱結(jié)核桿菌（TB),于1882年由 德國細(xì)菌學(xué)家郭霍（RobedKoch)從肺結(jié)核病人姨標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)，是結(jié)核病的病原菌。結(jié)核病 是一種具有強(qiáng)傳染性的慢性消耗性疾病，其發(fā)病率較高，危害性極大，19世紀(jì)時被稱為"白 色癌疫"。世界衛(wèi)生組織（Wffi))已將結(jié)核病與艾滋病、追疾列為二十一世紀(jì)人類需要攻克的 H大傳染性疾病之一，1993年，WHO宣布全球結(jié)核病處于"緊急狀態(tài)"，并于1995年起將每年 的3月24日定為"世界防治結(jié)核病日"，W提醒公眾加深對結(jié)核病的認(rèn)識。據(jù)Wffi)報告，全 球約20億人曾受到結(jié)核分枝桿菌感染，現(xiàn)有肺結(jié)核病人約2000萬，每年新發(fā)病例800萬~ 1000萬，每年死于結(jié)核病的人數(shù)約300萬。我國是結(jié)核病第二大國，僅次于印度，估計全國 現(xiàn)有活動性肺結(jié)核病人450萬，每年新發(fā)病例130萬，相當(dāng)于其他傳染病的總和。
[000引利福平化ifampicin，RFP)是抗結(jié)核聯(lián)合化療中主要的一線藥物，在細(xì)菌中的革己 蛋白為RNA聚合酶目亞基，與之結(jié)合后，阻礙mRNA合成，抑制轉(zhuǎn)錄過程，阻斷細(xì)菌的蛋白質(zhì) 合成，從而達(dá)到抑菌作用。
[0004] 結(jié)核耐藥性快速診斷方法對結(jié)核病的防治具有重要價值?，F(xiàn)有的結(jié)核分枝桿菌利 福平耐藥性檢測所使用的方法，有絕對濃度法、RFLP法和測序法等。
[0005] 其中，絕對濃度法存在著二次培養(yǎng)，每次八周，周期長且污染機(jī)率高；RFLP法由于 采用限制性內(nèi)切酶，而RFP耐藥決定區(qū)內(nèi)缺少合適的酶切位點，導(dǎo)致rpoB基因突變的檢出 率僅為10%，不能滿足臨床診斷的要求；雖然測序法是突變檢測的"金標(biāo)準(zhǔn)"，但敏感性低 (15%~20% )，且陰性率高。
[0006] 在過去的幾十年里涌現(xiàn)出了越來越多的SNPs分析技術(shù)，送些技術(shù)大致可W分為 兩類：等位基因特異性區(qū)分法W及直接測序法。其中，等位基因特異性區(qū)分策略主要是基于 等位基因特異性反應(yīng)，包括：引物延伸、雜交、連接、限制性酶切等方法。但是送些方法都不 夠理想，它們中，有的方法需要復(fù)雜的操作和昂貴的儀器，有的方法靈敏度和特異性不佳， 無法檢測稀有突變，送些都限制了它們的廣泛應(yīng)用。例如，SNP檢測技術(shù)中最常見的等位基 因特異性PCR技術(shù)（allelic-specificPCR，AS-PCR)，雖然引物3' -末端和模板形成了錯配， 但是大部分DNA聚合酶依然能夠催化引物的非特異性延伸，因而無法準(zhǔn)確地判斷所測基因 中是否存在SNP。
[0007]因此，本領(lǐng)域亟待研制和開發(fā)一種高度靈敏、準(zhǔn)確的結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥基 因突變檢測技術(shù)，其對于早期診斷結(jié)核病和防治結(jié)核病的傳播具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的就是提供一種高度靈敏、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)的結(jié)核分枝桿菌利福平耐 藥基因突變檢測手段、檢測試劑盒W及相關(guān)用途和應(yīng)用。
[0009]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥相關(guān)基因的 待測突變位點上是否存在突變的檢測試劑盒，所述試劑盒中包括：
[0010] 正向引物和反向引物，
[0011] 其中，所述正向引物和反向引物中一個引物為辨別性引物，所述辨別性引物W其 3'末端堿基起算第1-8位的任意1個或多個堿基對應(yīng)待測突變位點，但與野生型或突變型 序列相應(yīng)區(qū)段上堿基序列完全匹配，并且所述的辨別性引物的3'末端核巧戊糖3號C的居 基是雙脫氧修飾的C(即ddC);
[0012] 并且所述正向引物和反向引物中另一引物位于基因突變位點下游或上游且與相 應(yīng)區(qū)段上堿基序列完全匹配；
[001引高保真DNA聚合酶；和
[0014] 非高保真DNA聚合酶；
[0015] 其中，所述的正向引物和/或反向引物用于擴(kuò)增含所述待測突變位點的擴(kuò)增產(chǎn) 物；并且所述的待測突變位點選自下組：
[0016] 巧OB基因的對應(yīng)于巧OB蛋白中第516位氨基酸的密碼子序列、第526位氨基酸密 碼子序列、第531位氨基酸的密碼子序列、或其組合。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的待測突變位點上的堿基序列突變形式選自下組；D516V、 冊26Y、冊26R、S531L、或其組合。
[001引在另一優(yōu)選例中，所述的待測突變位點的堿基序列選自下組；GAC-GTC、CAC-TAC、CAC-CGC、TCG-TTG、或其組合。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的辨別性引物選自下組：
[0020] (1)、化sion-D516V-Blocked-F;5'-TGTAGTCCCGTGCATGAAGGCGCCAGCTGAGCC AATTCATGGA-ddC-3'（SEQIDNO: 1);
[0021] 但）、Rision-526-Blocked-F;5'-TGTAGTCCCGTGCATGAAGGCGCTGTCGGGGTTGAC CCA-ddC-3'(SEQIDNO:2)；
[0022] (3)、Rision-S531L-Blocked-F;5'-TGTAGTCCCGTGCATGAAGGCCCCACAAGCGCC GACTGT-ddC-3'(SEQIDNO:3)；
[002引或其組合。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中含有用于檢測二個或多個待測突變位點的二個 或多個辨別性引物，并且與所述辨別性引物配對使用的另一正向引物和/或反向引物是共 用引物。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的共用引物為：
[0026]TB-Primer-R;5,-CCGATGTTGGGCCCCTC-3,（SEQIDNO:4);
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述的共用引物是不經(jīng)任何修飾，或經(jīng)修飾的。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的二個或多個辨別性引物在其5'端設(shè)有通用引物結(jié)合區(qū)。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的通用引物結(jié)合區(qū)的長度為15-2化P。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的通用引物區(qū)為TGTAGTCCCGTGCATGAAGGC(SEQIDNO: 5)。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括W下通用引物：
[0032]Adaptor-TB-F：5'-TGTAGTCCCGTGCATGAAGGC-3'(SEQIDNO: 5)
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒設(shè)有盒體、擴(kuò)增試劑、對照試劑和提取試劑， 所述擴(kuò)增試劑、對照試劑和提取試劑放置在盒體內(nèi)，所述擴(kuò)增試劑包括TB-D516V-Mix、 TB-526-Mix、TB-S531L-Mix和TB-enzyme-Mix，所述對照試劑包括TB-D516V-PC(positive control)、TB-冊26Y-PC、TB-冊26R-PC、TB-S531kPC和TB-NC(negativecontrol)，所述提 取試劑為TBDNA提取液。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，在所述的試劑盒中，
[0035] 1)、所述的TB-D516V-Mix包括IOmMTris-肥1(抑8. 3)、50mMKC1、1.SmMMgC12、 200yMdNTPMixture、0. 2yMAdaptor-TB-F、F^ision-DSlGV-Blocked-F和TB-Primer-R各 0. 3yM;
[0036]2)、所述的TB-526-Mix包括IOmMTris-肥I(p冊.3)、50mMKC1、1. 5mMMgC12、 200yMdNTPMix1:ure、0. 2yMAdaptor-TB-F、F^ision-SSG-Blocked-F和TB-Primer-R各 0. 3yM;
[0037] 3)、所述的TB-S531kMix包括IOmMTris-肥I(抑8.3)、50mMKC1、1. 5mMMgC12、 200yMdNTPMixture、0. 2yMAdaptor-TB-F、F^ision-SSSlX-Blocked-F和TB-Primer-R各 0. 3yM;
[0038]4)、所述的TB-enzymes-Mix包括IUTaq和 0.I抓PrimeSTAR服DNAF*olymerase;
[0039]5)、所述的TB-D516V-PC、TB-冊26Y-PC、TB-冊26R-PC、TB-S531kPC和TB-NC分別 為對應(yīng)位點突變的突變型質(zhì)粒和野生型質(zhì)粒。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述的TB-enzymes-Mix中包括非高保真DNA聚合酶和具有 3' -5'核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶。
[0041]在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒的TB-D516V-Mix、TB-冊26Y-Mix、TB-冊26R-Mix、 TB-S531kMix還含有魏TC然' 9或SYBRGreenI，并且所述試劑盒用于real-timePCR反應(yīng)。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變包括；點突變、插入突變、缺失突變。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述的高保真DNA聚合酶是具有3' -5'外切酶活性的DNA聚合 酶；所述的非高保真DNA聚合酶是不具有3' -5'外切酶活性的DNA聚合酶。
[0044] 在另一優(yōu)選例中，所述的高保真DNA聚合酶包括；P化DNA聚合酶、Prime器TA技黎服 DNA聚合酶、Q5TM超保真DNA聚合酶等。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述的非高保真DNA聚合酶包括；TaqDNA聚合酶、TthDNA聚合 酶。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述的高保真DNA聚合酶與非高保真