一種原位定向拆分制備內(nèi)切菊粉酶的方法及其制備低聚果糖的工藝的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬生物化工中的微生物酶解制糖技術領域，具體涉及菊粉原料經(jīng)微生物分 泌的酶生物降解后，制備功能性食品低聚果糖的技術。
【背景技術】
[0002] 菊粉（inulin)又稱菊糖、土木香粉，為天然聚合物，是由D-呋喃果糖以β-2, 1 糖苷鍵連接而成的長鏈多聚果糖。通常其還原端連接一個葡萄糖基，呈直鏈結構，聚合度 2~60,分子量為3000~5000,其分子大小隨植物種類、氣候條件及收獲季節(jié)不同而異。菊 粉微溶于冷水，在熱水中能很快溶解，與碘不呈顏色反應，無還原性，有旋光性，在水中為左 旋。菊粉在自然界分布很廣，存在于植物、海藻、真菌和細菌中；但主要來源于植物，以能量 形式存在于多種植物和蔬菜，尤其大量存在于菊科植物，例如菊芋（JurusalemArtichoke， 俗稱洋姜）、菊苣（Chicory)、大麗花（dahliapinnata)、牛蒡（arctiumlappa)等中。工業(yè) 上一般多從菊芋根中提取菊粉。
[0003] 低聚果糖（Fructooligosaccharide，簡稱F0S)又稱寡果糖或鹿果低聚糖，是在 蔗糖的果糖殘基的(^位上通過β-1，2-糖苷鍵與1~3個分子的果糖結合而成的低聚 糖，主要是由鹿果三糖（Ι-kestose，簡稱GF2)、鹿果四糖（nystose，簡稱GF3)和鹿果五糖 (l-F-0-fructofranosylnystose,簡稱GF4)組成的混合物。低聚果糖廣泛存在于自然界 中，如梨、蜂蜜、啤酒、細菌、酵母、洋蔥、香蔥、牛蒡、菊芋、菊苣、香蕉、小麥、黑麥、燕麥等都 含有F0S。其中菊粉中的低聚果糖的含量最高，大約占92%左右。低聚果糖是功能性低聚 糖的一種，其主要的生理功能是調(diào)節(jié)人體腸道微生態(tài)環(huán)境和激活相關免疫系統(tǒng)。目前，工業(yè) 化生產(chǎn)低聚果糖的方法有兩種。一是蔗糖經(jīng)果糖轉(zhuǎn)移酶催化制備，產(chǎn)物低聚果糖為GFn型； 二是利用菊粉酶定向水解菊粉制備，產(chǎn)物低聚果糖為GFn與Fm的混合型。在果糖轉(zhuǎn)移酶催 化蔗糖制備低聚果糖中，反應副產(chǎn)物葡萄糖是酶的抑制劑，轉(zhuǎn)化率低，產(chǎn)物中含有大量葡萄 糖和蔗糖，低聚果糖僅占55~60%以下，且工藝復雜成本高。菊粉酶定向水解菊粉制備低 聚果糖是一步單酶反應，工藝簡單，產(chǎn)物中低聚果糖含量高達80%以上。因此，以菊芋為原 料酶法一步水解其中的菊粉制取低聚果糖，具有工藝簡單、轉(zhuǎn)化率高、副產(chǎn)物少的特點。
[0004] 菊粉酶是一類催化菊粉水解的復合酶類，由內(nèi)切菊粉酶（Endoinulinase)和外切 菊粉酶（Exoinulinase)組成。菊粉是在菊粉酶系中內(nèi)切菊粉酶和外切菊粉酶的協(xié)同作用 下被徹底降解成單糖的。菊粉酶水解菊粉的機理是菊粉多糖首先在內(nèi)切菊粉酶從菊粉分子 內(nèi)部隨機切斷β-2, 1-呋喃果糖苷鍵，得到低聚果糖，接著外切菊粉酶從低聚果糖分子的 非還原末端依次水解β-D果糖苷鍵，生成一分子果糖和少一個果糖分子的果聚糖，最終產(chǎn) 物為果糖和葡萄糖。從菊粉酶水解菊粉機理可看出，低聚果糖是菊粉水解成果糖和葡萄糖 過程的中間產(chǎn)物，因此控制水解過程中中間產(chǎn)物低聚果糖的累積，是獲得高得率低聚果糖 的關鍵。從菊粉酶協(xié)同作用機理不難看出，如果菊粉酶酶系中外切菊粉酶的量越低，則菊粉 水解過程中中間產(chǎn)物低聚果糖進一步水解成果糖和葡萄糖的量則越少，菊粉水解成低聚果 糖的得率就越高。
[0005] 大多數(shù)有工業(yè)應用潛力的、能合成菊粉酶的微生物，其分泌的菊粉酶酶系中都含 有一定數(shù)量的外切菊粉酶。而低聚果糖的制備，對菊粉酶的要求是其外切菊粉酶含量（或 活力）越低越好，即要求低外切菊粉酶活力的菊粉酶。為了在微生物酶法制備低聚果糖的 工藝中，盡可能地降低外切菊粉酶的活力，國內(nèi)外主要采取以下途徑開展研究并取得了一 定的進展：
[0006] (1)采用物理、化學誘變或基因工程的方法改造微生物，以期獲得新的突變株或工 程菌，它們可以分泌低外切菊粉酶含量的菊粉酶酶系；
[0007] (2)通過調(diào)控發(fā)酵的手段改變微生物的培養(yǎng)條件，以降低微生物對外切菊粉酶的 分泌；

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術問題是針對一般的微生物分泌的菊粉酶在降解菊粉制備 低聚果糖時的不足，尋找一種由微生物產(chǎn)天然菊粉酶系制備內(nèi)切菊粉酶的新方法。
[0009] 本發(fā)明還要解決的技術問題是將上述方法應用于酶法制備低聚果糖的新工藝。
[0010] 研究表明，自然界中大多數(shù)微生物所產(chǎn)菊粉酶為由內(nèi)切菊粉酶和外切菊粉酶組成 的混合酶，且多數(shù)表現(xiàn)高外切酶活性。菊粉是在菊粉酶系中內(nèi)切菊粉酶和外切菊粉酶的協(xié) 同作用下被徹底降解成單糖的，菊粉酶水解菊粉的機理是菊粉多糖首先在內(nèi)切酶的作用下 主要形成低聚果糖，低聚果糖繼而在外切酶的作用下被徹底降解成果糖和葡萄糖。因此，以 菊粉為原料制備的目標產(chǎn)品不同，對菊粉酶的酶系結構的要求不同，以果糖為目標產(chǎn)品的 工藝要求菊粉酶系中內(nèi)切酶和外切酶比例適當，有利于協(xié)同作用；而以低聚果糖為目標產(chǎn) 品的工藝要求菊粉酶系中外切酶含量盡量低，以提高低聚果糖的水解得率和降低水解產(chǎn)物 中無生理活性的單糖含量。
[0011]因此，篩選低外切酶活力的菊粉酶生產(chǎn)菌株、或?qū)ふ揖辗鬯膺^程中抑制外切酶 活力的方法、或開發(fā)適合工業(yè)化規(guī)模的內(nèi)切菊粉酶制備方法將是利用菊粉生產(chǎn)低聚果糖的 關鍵。
[0012] 為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下：
[0013] -種原位定向拆分制備內(nèi)切菊粉酶的方法，將含纖維素的底物與微生物產(chǎn)天然菊 粉酶混合，加入pH緩沖液混合至固液質(zhì)量比為lg: 7~50mL，體系pH值控制在4~6,于 5~55°C條件下吸附0. 5~2h，體系經(jīng)固液分離，棄去固形物，保留清液，即得內(nèi)切菊粉酶 液。
[0014] 其中，所述的含纖維素的底物為低聚木糖生產(chǎn)廢渣、微晶纖維素、脫脂棉和含纖維 素的紙漿中的任意一種或者幾種的組合。上述含纖維素的底物可以進行預處理再使用，預 處理的目的是提高含纖維素的底物中纖維素對菊粉酶的可及度，可以采用物理、化學、生物 或以上幾種方法聯(lián)合應用的預處理方法。
[0015] 其中，所述的微生物產(chǎn)天然菊粉酶是由曲霉屬（Aspergillussp.)或青霉屬 (Penicilliumsp.)分泌的菊粉酶。
[0016] 其中，所述的pH緩沖液為0. 1M的乙酸/乙酸鈉緩沖液。
[0017] 其中，所述的固液分離，其手段為離心或板框過濾。
[0018] -種制備低聚果糖的工藝，它包括如下步驟：
[0019] (1)含纖維素的底物原位定向拆分：將含纖維素的底物與微生物產(chǎn)天然菊粉酶混 合，加入pH緩沖液混合至固液質(zhì)量比為lg: 7~50mL，體系pH值控制在4~6,于5~ 55°C條件下吸附0. 5~2h，體系經(jīng)固液分離，棄去固形物，保留清液，即得內(nèi)切菊粉酶液；
[0020] (2)水解制備低聚果糖：將步驟（1)得到的內(nèi)切菊粉酶液中，加入菊粉和pH緩沖 液，使固液質(zhì)量比為lg: 7~50mL，pH值控制在4~6,內(nèi)切菊粉酶酶活與菊粉質(zhì)量的比 例控制在1~50IU/g，在45~55°C的條件下水解24~72h，將水解混合物進行固液分離， 所獲得的清液即為低聚果糖溶液。
[0021] 步驟（1)中，所述的含纖維素的底物為低聚木糖生產(chǎn)廢渣、微晶纖維素、脫脂棉和 含纖維素的紙漿中的任意一種或者幾種的組合。上述含纖維素的底物可以進行預處理再 使用，預處理的目的是提高含纖維素的底物中纖維素對菊粉酶的可及度，可以采用物理、化 學、生物或以上幾種方法聯(lián)合應用的預處理方法。
[0022] 步驟（1)中，所述的微生物產(chǎn)天然菊粉酶是由曲霉屬（Aspergillussp.)或青霉 屬（Penicilliumsp.)分泌的菊粉酶。一個菊粉酶活力的單位（IU/mL)定義為標準反應條 件下每分鐘生成1μmol還原糖的酶量。
[0023] 步驟（1)中，優(yōu)選加入pH緩沖液混合至固液質(zhì)量比為lg: 10mL。
[0024] 步驟（1)和⑵中，所述的pH緩沖液為0. 1M的乙酸/乙酸鈉緩沖液。
[0025] 步驟⑵中，優(yōu)選加入菊粉和pH緩沖液，使固液質(zhì)量比為lg: 50mL。
[0026] 步驟（1)或（2)中，所述的固液分離，其手段為離心或板框過濾。
[0027] 有益效果：本發(fā)明采用含纖維素的底物原位定向拆分天然菊粉酶系中的外切菊粉 酶以后，由于水解體系中的外切菊粉酶活力大幅度降低，提高制備低聚果糖的的選擇性，因 而進一步提高菊粉降解成低聚果糖的得率和產(chǎn)物中低聚果糖的含量，降低了產(chǎn)物中無生理 活性的單糖（果糖）的含量，為微生物天然產(chǎn)菊粉酶制備低聚果糖工藝提供了一個高效、低 成本的新途徑。
【附圖說明】
[0028] 圖1為底物種類對底物吸附內(nèi)切菊粉酶和外切菊粉酶的影響曲線，其中，1-紙漿， 2_低聚木糖生產(chǎn)廢渣，3-微晶纖維素，4-脫脂棉，5-菊粉；其實驗條件為：底物加入量為 10g/100mL，酶用量0.lmL，pH值4. 6,吸附時間1. 5h，吸附溫度為4°C;
[0029] 圖2為吸附時間對底物吸附內(nèi)切菊粉酶和外切菊粉酶的影響曲線，其實驗條件 為：底物加入量為l〇g/l〇〇mL，酶用量0·lmL，pH值4. 6,溫度為4°C;
[0030] 圖3為溫度對底物吸附內(nèi)切菊粉酶和外切菊粉酶的影響曲線，其實驗條件為：底 物加入量為l〇g/l〇〇mL，酶用量0.lmL，pH值4. 6,吸附時間lh。
【具體實施方式】
[0031] 根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本 發(fā)明。