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      一種提高人金屬硫蛋白MT1b原核表達載體表達量的方法

      文檔序號:9485181閱讀:273來源:國知局
      一種提高人金屬硫蛋白MT1b原核表達載體表達量的方法
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域,特別是涉及一種提高人金屬硫蛋白MTlb原核表達載 體表達量的方法。
      【背景技術(shù)】
      [0002] 金屬硫蛋白(Metallothionein,MT),又稱疏基金屬結(jié)合蛋白。一類非酶蛋白質(zhì), 除含有鎘(Cd)、鋅(Zn)的MT外,在自然界也存在含有銅(Cu)、汞(Hz)、金(Au)、鉍(Bi)等 元素的MT。MT的蛋白分子內(nèi)不含有芳香族氨基酸和組氨酸。讓MT中50%的金屬離子發(fā)生 解離的pH值分別為:Zn-MT:3. 5~4. 5 ;Cd-MT:2. 5~3. 5 ;Cu-MT〈1.0。因MT缺乏芳香族氨 基酸,故在280nm處無吸收峰,然而具有與金屬相關(guān)的吸收峰。去金屬的MT在190nm處有 一個吸收峰。所有脊椎動物、多數(shù)植物和微生物體內(nèi)都含有MT。無論是自然產(chǎn)生還是誘導(dǎo) 產(chǎn)生的MT,其氨基酸組成基本相同、主要不同在所含金屬及其含量。目前產(chǎn)品主要從兔肝、 馬腎、豬肝和微生物(如粗脈孢菌)等中提取。
      [0003] 關(guān)于金屬硫蛋白的功能和開發(fā)利用,自1978年到1999年先后在瑞士、日本、美國 共舉行了四次國際專題研討會,第五次國際專題研討會于2005年10月在北京召開。1987 年我國將MT列入[863]計劃,"八五"、"九五"重大攻關(guān)項目,1994年列入國家級[火炬計 劃];2003年MT項目被國家科技部列為"國家科技成果重點推廣計劃項目,1995年聯(lián)合國 將MT列入向世界各國推薦的生物技術(shù)產(chǎn)品。由此可見從國內(nèi)到國外對MT的研究、開發(fā)、推 廣、應(yīng)用的高度重視。
      [0004] 關(guān)于MT蛋白的生物發(fā)酵生產(chǎn),曾經(jīng)有用大腸桿菌、枯草桿菌、鏈球菌、酵母菌等基 因工程重組方法,但均由于表達量過低而至今未有投入生產(chǎn)。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0005] 鑒于以上表達量不足的缺陷,本發(fā)明的主要目的是利用人工基因全合成的方法將 密碼子優(yōu)化,并且將表達子首尾串聯(lián)重復(fù)4次成為包含4拷貝MT順反子的原核(E.coli) 表達載體,用以提尚表達量。
      [0006] -種提高人金屬硫蛋白MTlb原核表達載體表達量的方法,包括將含經(jīng)密碼子優(yōu) 化后的人金屬硫蛋白分子的編碼區(qū)的串聯(lián)單位在原核表達載體克隆區(qū)串聯(lián)重復(fù)4次形成 包含4拷貝人金屬硫蛋白順反子的串聯(lián)重復(fù)區(qū);將含串聯(lián)重復(fù)區(qū)的原核表達載體轉(zhuǎn)化原核 宿主細胞;培養(yǎng)并大量繁殖該細胞,利用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)導(dǎo)人金屬硫蛋白分子表達。
      [0007] 其中,每個所述的串聯(lián)單位優(yōu)選包括核糖體結(jié)合區(qū)和經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人金屬硫 蛋白MTlb分子。
      [0008] 每個所述的串聯(lián)單位還優(yōu)選包括位于串聯(lián)單位兩端的酶切位點。
      [0009] 經(jīng)密碼子優(yōu)化后的MTlb編碼區(qū)序列優(yōu)選如SEQIDNO. 1所示。
      [0010] 含經(jīng)密碼子優(yōu)化后的MTlb編碼區(qū)的串聯(lián)重復(fù)區(qū)序列如SEQIDNO. 2所示。
      [0011] 經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人金屬硫蛋白MTlb編碼區(qū)基因序列,如SEQIDNO. 1所示。
      [0012] -種用于提尚人金屬硫蛋白MTlb原核表達量的串聯(lián)重復(fù)區(qū),所述的串聯(lián)重復(fù)區(qū) 由串聯(lián)單位重復(fù)串聯(lián)4次組成;所述的串聯(lián)單位包括核糖體結(jié)合區(qū)和經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人 金屬硫蛋白的編碼區(qū)。
      [0013] 用于提高人金屬硫蛋白MTlb原核表達量的串聯(lián)重復(fù)區(qū)序列優(yōu)選自SEQID N0. 2。
      [0014] -種表達人金屬硫蛋白MTlb的原核表達載體,所述的原核表達載體含有本發(fā)明 所述的串聯(lián)重復(fù)區(qū)。
      [0015] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
      [0016] 1、所述人MTlb蛋白的優(yōu)化密碼子提高了大腸桿菌內(nèi)該類密碼的可獲得性。
      [0017] 2、所述MTlb原核表達載體中MTlb表達順反子增加了近3倍,MTlb的表達量由單 拷貝時的4. 1 %增加到平均9. 8%,表達量增加了2. 4倍;
      [0018] 3、所述MT原核表達載體表達的MTlb蛋白為天然單分子,并非融合蛋白。
      【附圖說明】
      [0019] 圖1為本發(fā)明提供的一種MTlb串聯(lián)結(jié)構(gòu)不意圖。
      [0020] 注解:示意圖中所代表的DNA序列為所構(gòu)建的原核表達載體的一部分,以 "T7promoter"開始,以"T7terminator"結(jié)束;"Lac operator"為lacl結(jié)合位點;"RBS"為 核糖體結(jié)合序列。"T7terminator"為T7B策菌體的轉(zhuǎn)錄終止信號序列(下同)。
      【具體實施方式】
      [0021] 以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行進一步說明,但不作對本發(fā)明的限 定。
      [0022] 采用的技術(shù)方案如下:
      [0023] 首先,本發(fā)明第一步將人MTlb蛋白分子翻譯成cDNA序列,然后經(jīng)DNA2.0軟件優(yōu) 化MT cDNA的密碼子,使其更適合于大腸桿菌的密碼子偏好,并且對氨基端的起始15個氨 基酸編碼區(qū)進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,避免強二級結(jié)構(gòu)的形成,經(jīng)密碼子優(yōu)化后的MTlb編碼區(qū)序列如 SEQ ID NO. 1所示。
      [0024] 第二步是用寡核苷酸分步延伸法合成MTlb的全長序列,5'端添加Ncol酶切位點, 3'端依次添加SpelNhel兩個酶切位點,PCR產(chǎn)物經(jīng)Ncol/Nhel雙酶切純化后,定容至 50ng/ul,再將原核表達載體pET28a(+)經(jīng)Ncol/Nhel酶切純化,定容至100ng/ul。
      [0025] 第三步,連接與轉(zhuǎn)化:
      [0026] MTlb 2ul pET28a(+)載體DNA(100ng/u]) :2ul 1(?:XT4DNA連接酶緩沖液 lul T4DNA連接酶(200U/ul) lul 消毒去離子水 4u:l
      [0027] 1300rpm,離心5s,混勻,再同法離心一次,室溫靜置連接2小時。
      [0028] 全部10ul轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)菌,經(jīng)靜置30m,熱激lm,加入1ml LB后,37度震蕩培 養(yǎng)lh后,離心4m(6000rpm,EP離心機),棄上清,懸浮沉淀物,均勾涂布于含卡那霉素的軟 瓊脂平皿上,37度溫箱過夜培養(yǎng)。次日調(diào)取克隆,PCR鑒定陽性重組體,陽性克隆經(jīng)測序分 析正確后,得到包含1拷貝MTlb順反子的克隆。
      [0029] 接著進行第一次串聯(lián)連接:
      [0030] 取正確克隆1株,分別用兩管做酶切:管-1用酶Spel/BamHI雙切,回收大片段 (5. 5kb左右)作為載體;管-2用酶Xbal/BamHI雙切,回收235bps的片段。連接管-1和 管-2的回收產(chǎn)物,經(jīng)鑒定和DNA測序分析后,得到包含2拷貝MTlb順反子的MT重組表達 載體。
      [0031] 第二步串聯(lián)連接:采用第一步串聯(lián)連接產(chǎn)物(包含2拷貝MT順反子的正確克?。?管-1用Spel/Xhol酶切,回收大片段(載體+2拷貝MT順反子);管-2用Xbal/Xhol酶切, 回收537bps的DNA片段(包含2拷貝MT順反子)。再經(jīng)連接鑒定后,即可得到4拷貝MT 順反子的MTlb原核表達載體,其中含經(jīng)密碼子優(yōu)化后的MTlb編碼區(qū)的串聯(lián)重復(fù)區(qū)序列如 SEQ IDN0.2所示。
      [0032] 小量搖瓶表達比較:
      [0033] 分別取pET28a⑴空載體、MTlb單拷貝、2拷貝、4拷貝的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 BL21 (DE3)表達菌株,挑取單菌落分別接種4ml2XYT培養(yǎng)基(含50ug/ml卡那霉素), 37°C,250rpm,震蕩培養(yǎng),待到細菌生長至對數(shù)生長期,分別向各管加入0. 4ulIPTG,25°C誘 導(dǎo)培養(yǎng)6小時。收集lml菌液,離心沉淀,PBS洗一次,再用500ulPBS懸浮,超聲破碎細 胞,12000rpm/15分鐘,4°C離心棄沉淀,取上清上樣20%SDS-PAGE,經(jīng)考馬斯亮藍顯色,脫 色,凝膠成像儀計算目標條帶占總蛋白的比例,結(jié)果(如下)顯示隨拷貝數(shù)增加,表達量增 高(按目標條帶密度占總蛋白密度百分比計算)。
      [0034] 表1.不同MTlb拷貝數(shù)載體在小量搖菌條件下目標條帶密度占總蛋白密度百分比
      [0035]
      【主權(quán)項】
      1. 一種提高人金屬硫蛋白MTlb原核表達載體表達量的方法,其特征在于包括將含經(jīng) 密碼子優(yōu)化后的人金屬硫蛋白MTlb分子的編碼區(qū)的串聯(lián)單位在原核表達載體克隆區(qū)串聯(lián) 重復(fù)4次形成包含4拷貝人金屬硫蛋白順反子的串聯(lián)重復(fù)區(qū);將含串聯(lián)重復(fù)區(qū)的原核表達 載體轉(zhuǎn)化原核宿主細胞;培養(yǎng)并大量繁殖該細胞,利用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)導(dǎo)人金屬硫蛋白分子表 達。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于每個所述的串聯(lián)單位包括核糖體結(jié)合區(qū)和 經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人金屬硫蛋白分子。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于每個所述的串聯(lián)單位還包括位于串聯(lián)單位 兩端的酶切位點。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于經(jīng)密碼子優(yōu)化后的MTlb編碼區(qū)序列如SEQ ID NO. 1 所示。5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項所述的方法,其特征在于含經(jīng)密碼子優(yōu)化后的MTlb編 碼區(qū)的串聯(lián)重復(fù)區(qū)序列如SEQ ID NO. 2所示。6. 經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人金屬硫蛋白分子MTlb編碼區(qū)基因序列,其特征在于序列如SEQ ID NO. 1 所示。7. -種用于提高人金屬硫蛋白MTlb原核表達量的串聯(lián)重復(fù)區(qū),其特征在于所述的串 聯(lián)重復(fù)區(qū)由串聯(lián)單位重復(fù)串聯(lián)4次組成;所述的串聯(lián)單位包括核糖體結(jié)合區(qū)和經(jīng)密碼子優(yōu) 化后的人金屬硫蛋白的編碼區(qū)。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的串聯(lián)重復(fù)區(qū),其特征在于所述的串聯(lián)重復(fù)區(qū)序列為SEQ ID NO. 2 〇9. 一種表達人金屬硫蛋白MTlb的原核表達載體,其特征在于所述的原核表達載體含 有權(quán)利要求9或10所述的串聯(lián)重復(fù)區(qū)。
      【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高人金屬硫蛋白MT1b原核表達載體表達量的方法。該方法包括:人工合成密碼子優(yōu)化的MT1b?DNA分子,該分子還包括DNA內(nèi)切酶識別序列NcoI、SpeI、NheI;將所述DNA分子構(gòu)建到pET28a(+)的NcoI/NheI克隆區(qū);再經(jīng)過系列重組使包含核糖體結(jié)合區(qū)的MT1b編碼基因擴增到4拷貝。本發(fā)明的方法適用于所有小分子多肽(100個氨基酸以內(nèi)的)表達載體的構(gòu)建,整個過程操作簡單,快速,所制備的原核表達載體提高了MT1b蛋白的表達量,降低了成本,提高了工作效率。
      【IPC分類】C12N15/70, C12N15/12, C12N15/69
      【公開號】CN105238803
      【申請?zhí)枴緾N201510703788
      【發(fā)明人】李萬波
      【申請人】盤古基因生物工程(南京)股份有限公司
      【公開日】2016年1月13日
      【申請日】2015年10月26日
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