一種用于微生物的CRISPR/Cas9基因編輯載體的構(gòu)建及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因編輯領(lǐng)域中一種用于微生物的CRISPR/Cas9基因編輯載體的構(gòu) 建及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，是生物研究領(lǐng)域重要的方法之一。隨著科學(xué)的發(fā)展，出 現(xiàn)了越來越多的基因編輯技術(shù)，從經(jīng)典的EMS隨機(jī)誘變、T-DNA插入誘變或轉(zhuǎn)座子插入失 活到鋅指核酸酶（Zinc-fingernucleases,ZFN)技術(shù)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸 酉每（transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALEN)技術(shù)，這些技術(shù)都大 大地促進(jìn)了基因功能研究的進(jìn)程。但由于ZFN技術(shù)與TALEN技術(shù)需要針對(duì)每一個(gè)目的 基因設(shè)計(jì)特定的內(nèi)切酶，且構(gòu)建過程繁瑣，大大限制了其應(yīng)用范圍。與其它沉默體系相 比，規(guī)律成族間隔短回文重復(fù)（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromic r印eats)，CRISPR)技術(shù)有其無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，逐漸被廣泛地應(yīng)用于基因定點(diǎn)修飾研究中。
[0003] CRISPR/Cas系統(tǒng)最早是在細(xì)菌的天然免疫系統(tǒng)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，其主要功能是對(duì)抗入侵 的病毒及外源DNA，該系統(tǒng)主要依賴于CRISPRRNA(crRNA)與Cas蛋白形成的核糖核蛋白復(fù) 合物識(shí)別祀序列上的原間隔物模塊（protospacer-adjacentmotif,PAM)對(duì)入侵菌體或 質(zhì)粒進(jìn)行特異性切割。CRISPR系統(tǒng)主要有三種類型，其中II型體系僅需要一個(gè)Cas9蛋白、 crRNA與反式激活的crRNA(tracrRNA)就能行使其功能。有研究表明將crRNA與tracrRNA 整合成向?qū)NA(guideRNA，gRNA)并不影響CRISPR/Cas9體系的作用。2013年8月，自然 生物技術(shù)期刊上首次同時(shí)發(fā)表了三篇有關(guān)CRISPR/Cas9體系成功應(yīng)用于植物基因修飾的 研究。之后，CRISPR/Cas9體系被廣泛地應(yīng)用于動(dòng)植物的研究上，而在微生物中的研究較少。 近期有研究報(bào)道將CRISPR/Cas系統(tǒng)應(yīng)用于大腸桿菌的多基因編輯，但是其采用的是多質(zhì) 粒系統(tǒng)，操作復(fù)雜，所需時(shí)間較長(zhǎng)。因此構(gòu)建出操作方便、適用于微生物的CRISPR/Cas9系 統(tǒng)具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何構(gòu)建出利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)大 腸桿菌進(jìn)行編輯的單一載體或谷氨酸棒狀桿菌基因組進(jìn)行編輯的單一載體。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了兩種載體，一種是大腸桿菌CRISPR/Cas9 基因編輯載體，一種是谷氨酸棒狀桿菌CRISPR/Cas9基因編輯載體。
[0006] 本發(fā)明所提供的大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯載體和谷氨酸棒狀桿菌CRISPR/ Cas9基因編輯載體，均包括復(fù)制起始位點(diǎn)（origin)、篩選標(biāo)記基因、Cas9蛋白基因和gRNA 的編碼DNA，所述gRNA識(shí)別受體菌的目的DNA，所述受體菌的目的DNA具有5 ' - (N)x-NGG-3 ' 結(jié)構(gòu)，（N)x表示X個(gè)N，N為A、G、C或T，X可為大于5的一個(gè)自然數(shù)；其特征在于：所述載 體包括同源重組元件和操縱子；
[0007] 所述同源重組元件含有用于進(jìn)行同源重組的DNA片段，所述同源重組元件通過與 所述受體菌的基因組DNA靶位點(diǎn)附近發(fā)生同源重組從而實(shí)現(xiàn)所述靶位點(diǎn)的基因組編輯（包 括刪除、插入、替換等）；
[0008] 所述操縱子調(diào)控所述Cas9蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，或調(diào)控所述Cas9蛋白基因和所述 gRNA的編碼DNA的轉(zhuǎn)錄。
[0009] 上述大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯載體和上述谷氨酸棒狀桿菌CRISPR/Cas9基 因編輯載體中，所述X具體可為20。
[0010] 上述大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯載體中，含有終止所述Cas9蛋白基因轉(zhuǎn)錄的 終止子和啟動(dòng)所述gRNA的編碼DNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。
[0011] 上述大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯載體中，所述操縱子為阿拉伯糖操縱子，所 述阿拉伯糖操縱子由操縱區(qū)域和調(diào)控蛋白基因組成，所述調(diào)控蛋白基因具體可為AraC蛋 白基因，所述阿拉伯糖操縱子調(diào)控所述Cas9蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和Red同源重組系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄。 [0012] 上述大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯載體為1)-3)中任一種載體：
[0013] 1)所述載體由所述阿拉伯糖操縱子的操縱區(qū)域、與所述操縱區(qū)域連接的所述 Cas9蛋白基因、與所述Cas9蛋白基因連接的所述終止所述Cas9蛋白基因轉(zhuǎn)錄的終止子、 與所述終止所述Cas9蛋白基因轉(zhuǎn)錄的終止子連接的所述啟動(dòng)所述gRNA的編碼DNA轉(zhuǎn)錄的 啟動(dòng)子、與所述啟動(dòng)所述gRNA的編碼DNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子連接的所述gRNA的編碼DNA、與所 述gRNA的編碼DNA連接的所述復(fù)制起始位點(diǎn)、與所述復(fù)制起始位點(diǎn)連接的所述阿拉伯糖操 縱子、與所述阿拉伯糖操縱子連接的同源重組系統(tǒng)、與所述同源重組系統(tǒng)連接的〇rf60a基 因，與所述〇rf60a基因連接的所述同源重組元件、與所述同源重組元件連接的所述篩選標(biāo) 記基因組成；
[0014] 2)所述載體包括Red同源重組系統(tǒng)；
[0015] 3)所述載體的核苷酸序列為SEQIDNo. 1。
[0016] 上述大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯載體中，1)所述載體的所述復(fù)制起始位點(diǎn)可 包括oriRlOl基因和r印A101基因；所述同源重組元件含有與所述受體菌的基因組DNA靶 位點(diǎn)附近發(fā)生同源重組的上游同源臂和下游同源臂，或含有與所述受體菌的基因組DNA靶 位點(diǎn)附近發(fā)生同源重組的上游同源臂、敲入基因和與所述受體菌的基因組DNA靶位點(diǎn)附近 發(fā)生同源重組的下游同源臂；所述阿拉伯糖操縱子的操縱區(qū)域具體可為SEQIDNo. 1的第 7333-7684位的核苷酸序列或SEQIDNo. 1的第11516-11867位的核苷酸序列；所述orf60a 基因具體可為SEQIDNo. 1的第9566-9748位所示的核苷酸序列。
[0017] 上述大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯載體中，2)所述載體的所述Red同源重組系 統(tǒng)由λ卩策菌體exo、bet、gam三個(gè)基因組成，它們分別編碼Exo、Beta、Gam三種蛋白質(zhì)。
[0018] 上述大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯載體中，3)所述載體的SEQIDNo. 1的第 10577-11371位的核苷酸序列為卡那霉素抗性基因；SEQIDNo. 1的第11868-4059位的核 苷酸序列為所述Cas9蛋白基因；SEQIDNo. 1的第4060-4114位的核苷酸序列為所述終 止Cas9蛋白基因轉(zhuǎn)錄的終止子；SEQIDNo. 1的第4115-4158位的核苷酸序列為所述啟動(dòng) gRNA的編碼DNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子；SEQIDNo. 1的第4183-4260位的核苷酸序列為所述gRNA 的編碼DNA;SEQIDNo. 1的第4494-6188位的核苷酸序列為所述復(fù)制起始位點(diǎn)（origin)， 所述復(fù)制起始位點(diǎn)（origin)包括所述oriRlOl基因和所述repAlOl基因，SEQIDNo. 1的 第4494-5444位的核苷酸序列為所述r印A101基因，SEQIDNo. 1的第5448-6188位的核 苷酸序列為所述oriRlOl基因；SEQIDNo. 1的第6452-7684位的核苷酸序列為所述阿拉 伯糖操縱子，SEQIDNo. 1的第6452-7330位所示的核苷酸序列為所述AraC蛋白基因，SEQ IDNo. 1的第7333-7684位的核苷酸序列和SEQIDNo. 1的第11516-11867位的核苷酸 序列均為所述操縱區(qū)域；SEQIDNo. 1的第7658-9569位的核苷酸序列為所述Red同源重 組系統(tǒng)；SEQIDNo. 1的第9566-9748位的核苷酸序列為orf60a基因；SEQIDNo. 1的第 9842-10436位的核苷酸序列為所述同源重組元件的上游同源臂和下游同源臂。
[0019] 上述谷氨酸棒狀桿菌CRISPR/Cas9基因編輯載體中，含有終止所述Cas9蛋白基因 轉(zhuǎn)錄的終止子、啟動(dòng)所述gRNA的編碼DNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子和終止所述gRNA的編碼DNA轉(zhuǎn)錄 的終止子。
[0020] 上述谷氨酸棒狀桿菌CRISPR/Cas9基因編輯載體中，所述操縱子為乳糖操縱子， 所述乳糖操縱子由laclq基因和Ptrc啟動(dòng)子組成，調(diào)控所述Cas9蛋白基因的轉(zhuǎn)錄。
[0021] 上述谷氨酸棒狀桿菌CRISPR/Cas9基因編輯載體為1)或2)的載體：
[0022] 1)所述載體由所述乳糖操縱子、與所述乳糖操縱子連接的所述Cas9蛋白基因、 與所述Cas9蛋白基因連接的所述終止所述Cas9蛋白基因轉(zhuǎn)錄的終止子、與所述終止所述 Cas9蛋白基因轉(zhuǎn)錄的終止子連接的所述啟動(dòng)所述gRNA的編碼DNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、與所述 啟動(dòng)所述gRNA的編碼DNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子連接的所述gRNA的編碼DNA、與所述gRNA的編碼 DNA連接的所述終止所述gRNA的編碼DNA轉(zhuǎn)錄的終止子、與所述終止所述gRNA的編碼DNA 轉(zhuǎn)錄的終止子連接的per基因，與所述per基因連接的所述復(fù)制起始位點(diǎn)、與所述復(fù)制起始 位點(diǎn)連接的所述篩選標(biāo)記基因、與所述篩選標(biāo)記基因連接的所述同源重組元件組成；
[0023] 2)所述載體的核苷酸序列為SEQIDNo. 2。
[0024] 上述谷氨酸棒狀桿菌CRISPR/Cas9基因編輯載體中，1)所述的載體的所述復(fù)制 起始位點(diǎn)可為r印A101基因；所述同源重組元件含有與所述受體菌的基因組DNA靶位點(diǎn) 附近發(fā)生同源重組的上游同源臂和下游同源臂；所述per基因具體可為SEQIDNo.2的第 5422-5367位所示的核苷酸序列。
[0025] 上述谷氨酸棒狀桿菌CRISPR/Cas9基因編輯載體中，2)所述的載體的SEQID No. 2的第11351-12735位的核苷酸序列為所述乳糖操縱子，SEQIDNo. 2的第11351-12433 位的核苷酸序列為乳糖操縱子中的laclq基因，SEQIDNo. 2的第12490-12735位的核苷 酸序列為乳糖操縱子中的Ptrc啟動(dòng)子；SEQIDNo. 2的第12755-4069位的核苷酸序列為 所述Cas9蛋白基因；SEQIDNo. 2的第4070-4124位的核苷酸序列為所述終止Cas9蛋白 基因轉(zhuǎn)錄的終止子；SEQIDNo. 2的第4125-4168位的核苷酸序列為所述啟動(dòng)gRNA的編碼 DNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子；SEQIDNo. 2的第4193-4270位的核苷酸序列為所述gRNA的編碼DNA; SEQIDNo. 2的第4271-4701位的核苷酸序列為所述終止gRNA的編碼DNA轉(zhuǎn)錄的終止子； SEQIDNo. 2的第5422-5367位的核苷酸序列為per基因；SEQIDNo. 2的第6280-7743位 的核苷酸序列為所述復(fù)制起始位點(diǎn)（origin)，所述復(fù)制起始位點(diǎn)（origin)為repAlOl基 因；SEQIDNo. 2的第8273-9067位的核苷酸序列為卡那霉素抗性基因