酶解制備薯蕷皂素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種薯蕷皂素的制備方法，是以黃姜為原料經(jīng)酶解制取薯蕷皂素的方法，屬于酶工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]薯蕷皂素，簡稱皂素，亦稱薯蕷皂苷元、地奧配基，英文名d1sgenin (CASN0.512-04-9)，是合成留體激素和留體避孕藥的重要前體化合物，被冠以“藥用黃金”及“激素之母”的稱號(hào)。薯蕷皂素為起始母體加以修飾，可合成性激素、腎上腺皮質(zhì)激素及其他甾族化合物等多達(dá)300種化合物。除作為藥物前體外，薯蕷皂素本身亦具有抑菌，抗病毒，抗血栓，抗骨質(zhì)疏松、促進(jìn)骨生成，治療心血管疾病、糖尿病，抗癌、抗氧化等生物活性和藥用功能。
[0003]目前工業(yè)生產(chǎn)廣泛使用傳統(tǒng)的酸解法，該法又稱為Rothrok法。該工藝使用高濃度的酸水解薯蕷皂苷，促使皂苷元與糖基分離，產(chǎn)物經(jīng)大量水沖洗至中性，再對(duì)薯蕷皂素進(jìn)行有機(jī)溶劑提取。該方法雖然工藝過程簡單，操作方便，設(shè)備投資少。但該工藝中使用高濃度的酸作為水解催化劑，過程中產(chǎn)生的污水若不經(jīng)處理直接排放，會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。并且該方法亦不考慮黃姜中其他成分(淀粉、纖維素、半纖維素)的利用，使得植物資源利用不充分，不能很好地產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)價(jià)值。另一方面，酸解用酸一般使用硫酸和鹽酸，這兩種酸催化的過程都有副反應(yīng)發(fā)生:硫酸容易使生成的皂素發(fā)生脫水，形成3，5- 二烯結(jié)構(gòu)，也容易使皂素的F環(huán)開環(huán)，造成皂素母體結(jié)構(gòu)的破環(huán)；鹽酸催化容易發(fā)生羥基鹵代化反應(yīng)，引起副產(chǎn)物的生成。近年來，國家加倍關(guān)注環(huán)保問題，薯蕷皂素不環(huán)保的傳統(tǒng)工藝導(dǎo)致我國部分薯蕷皂素生產(chǎn)廠家關(guān)閉。因此傳統(tǒng)工藝急需有切實(shí)可行的新環(huán)保生產(chǎn)工藝的取代。
[0004]在已知生物制備薯蕷皂素方法領(lǐng)域中，原料要求嚴(yán)格，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，工藝控制點(diǎn)繁多，嚴(yán)重制約了薯蕷皂素的提取制備。例如，中國專利CN1441059A介紹了生物酶催化協(xié)同浸取提取薯蕷皂素的方法，其中涉及到的部分酶來源為黃姜內(nèi)源酶，受黃姜原料產(chǎn)地、生長狀況、運(yùn)輸條件影響較大，對(duì)穩(wěn)定生產(chǎn)有比較大的影響；再如中國專利CN101397582A介紹了一種環(huán)保無污染全酶法生產(chǎn)薯蕷皂素的方法，其中所使用的復(fù)配酶制劑成分多，酶配比復(fù)雜，有兩個(gè)復(fù)配酶，所涉及到的酶有8種之多，操作環(huán)節(jié)較多，這在一定程度增大了生產(chǎn)難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有提取方法得率低及復(fù)雜工藝等問題，本發(fā)明的目的在于提供一種簡易可行的制備方法，以提高薯蕷皂素的收率。
[0006]本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:一種酶解制薯蕷皂素的方法，將粉碎的黃姜浸泡在乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中依次進(jìn)行纖維素酶I酶解、β -葡萄糖苷酶I酶解，收集酶解殘?jiān)?、提純制得署預(yù)阜素。
[0007]黃姜按1:10?1:30固液比浸于乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中。
[0008]纖維素酶I較適宜的用量優(yōu)選為1%?10%黃姜重量，β -葡萄糖苷酶I加入量以液體體積計(jì)100?600U/ml。
[0009]在酶解過程中:
[0010]酶解過程優(yōu)選在pH值4?6酸性條件下為宜。
[0011]纖維素酶I酶解的溫度條件優(yōu)選40?55°C，酶解時(shí)間優(yōu)選24?48小時(shí)。
[0012]β -葡萄糖苷酶I酶解的溫度條件優(yōu)選40?50°C，酶解時(shí)間優(yōu)選30?48小時(shí)。
[0013]提純可以參考如下方法進(jìn)行:將殘?jiān)?0°C烘干，加入濃度為50%?80%乙醇加熱回流提取，殘?jiān)|(zhì)量與乙醇體積比為1:15?1:25，50?70°C提取20?60min，根據(jù)用途，可以將所得的含有薯蕷皂素成分的濾液保持原狀，或濃縮到適當(dāng)濃度后在液體狀態(tài)下使用。當(dāng)需要獲得的薯蕷皂素成分為粉末形式時(shí)，可將濾液用冷凍干燥等方法進(jìn)行干燥。
[0014]本發(fā)明提供的酶法制備薯蕷皂素的方法具有以下特點(diǎn):
[0015]1、本發(fā)明首次完全利用商品化酶纖維素酶I及β -葡萄糖苷酶I將黃姜轉(zhuǎn)化為薯蕷皂素，纖維素酶I在酶解第一階段起到了去除包裹在皂苷外層的淀粉果膠等物質(zhì)的作用，并且斷裂了纖維素木質(zhì)素與皂苷的結(jié)合鍵，使得皂苷從束縛狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x狀態(tài)，暴露了皂苷糖苷鍵，而第二階段，再加入葡萄糖苷酶I，與纖維素酶I起到了協(xié)同作用，斷裂多種皂苷糖苷鍵，將皂苷轉(zhuǎn)化為皂素。經(jīng)過兩步酶解，皂素產(chǎn)量最高可達(dá)到傳統(tǒng)酸解法的90%。
[0016]2、以酶解法代替?zhèn)鹘y(tǒng)酸解工藝，減少了副產(chǎn)品的生成。回收酶解液的上清液可得葡萄糖液，濃縮結(jié)晶可得全糖，亦可用以生產(chǎn)酒精，實(shí)現(xiàn)了植物資源的完全利用，并且，將經(jīng)過本發(fā)明生產(chǎn)得到的薯蕷皂素用HPLC、MS檢測(cè)分析，與標(biāo)準(zhǔn)品薯蕷皂素對(duì)比，證實(shí)得到產(chǎn)物確為薯蕷皂素。
[0017]3、本發(fā)明中以酶解代替了傳統(tǒng)酸解工藝，實(shí)現(xiàn)了酸性廢水零排放，有效解決了皂素生產(chǎn)中的水污染問題，并在酶解工藝基礎(chǔ)上提出一鍋法概念，操作工藝簡單，為酶法制備薯蕷皂素清潔生產(chǎn)工藝的工業(yè)化實(shí)現(xiàn)提供理論支持和依據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面進(jìn)一步描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但要求保護(hù)的范圍并不局限于所述。下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的闡述，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不局限于實(shí)施例表示的范圍。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非用于限制本發(fā)明的范圍。此外，在閱讀本發(fā)明的內(nèi)容后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種修改，這些等價(jià)變化同樣落于本發(fā)明所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0019]以下實(shí)施例中，所用材料:
[0020]黃姜，洗凈，烘干，粉碎，過40?60目篩，備用；
[0021]纖維素酶I和β -葡萄糖苷酶I均購于白銀賽諾公司；
[0022]0.2mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液
[0023]實(shí)施例1
[0024]將lg黃姜粉置于100ml錐形瓶，加入0.2mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液10mL，pH值調(diào)節(jié)為4.0，加入0.0lg纖維素酶I，在水浴搖床條件下，40°C酶解48小時(shí)。加入β -葡萄糖苷酶I，加入量以液體體積計(jì)100U/ml，40°C酶解48小時(shí)。在5000r.min-1條件下離心15min，使固液分離，得上清液和固體殘?jiān)?。將固體殘?jiān)娓?，?:25固液比加入濃度為50%的乙醇，50°C提取60min。結(jié)晶得到薯蕷皂素31.68mg。
[0025]實(shí)施例2
[0026]取lg黃姜粉置于100ml錐形瓶，加入乙酸-乙酸鈉緩沖液20mL，pH值調(diào)節(jié)為5.0，加入0.05g纖維素酶I，在水浴搖床條件下，50°C酶解38小時(shí)。加入β -葡萄糖苷酶I，加入量以液體體積計(jì)300U/ml，45°C酶解40小時(shí)。離心去掉濾液，得殘?jiān)?。?000r.min-1條件下離心15min，使固液分離，得上清液和固體殘?jiān)?。將固體殘?jiān)娓桑?:20固液比加入濃度為60%的乙醇，60°C提取30min。結(jié)晶得到薯蕷皂素24.5mg。
[0027]實(shí)施例3
[0028]取lg黃姜粉置于100ml錐形瓶，加入乙酸-乙酸鈉緩沖液30mL，pH值調(diào)節(jié)為6.0，加入0.lg纖維素酶I，在水浴搖床條件下，55°C酶解24小時(shí)。加入β-葡萄糖苷酶I，加入量以液體體積計(jì)600U/ml，50°C酶解30小時(shí)。離心去掉濾液，得殘?jiān)?。?000r.min-1條件下離心15min，使固液分離，得上清液和固體殘?jiān)?。將固體殘?jiān)娓桑?:15固液比加入濃度為70%的乙醇，70°C提取20min。結(jié)晶得到薯蕷皂素31.3mg。
[0029]此工藝可達(dá)到最大薯蕷皂素產(chǎn)量為31.68mg/g，并聯(lián)產(chǎn)葡萄糖230mg/g。本工藝首次完全的使用商品化酶將黃姜中薯蕷皂苷轉(zhuǎn)化為薯蕷皂素，實(shí)現(xiàn)了傳統(tǒng)酸解方法90%皂素侍率。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種酶解制備薯蕷皂素的方法，其特征在于:所述方法是將粉碎的黃姜浸泡在乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中依次進(jìn)行纖維素酶I酶解、β -葡萄糖苷酶I酶解，收集酶解殘?jiān)?、提純制得署預(yù)阜素。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶解制備薯蕷皂素的方法，其特征在于:所述黃姜按1:10?1:30固液比浸于乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶解制備薯蕷皂素的方法，其特征在于:所述纖維素酶I用量為1%?10%黃姜重量，β -葡萄糖苷酶I加入量以液體體積計(jì)100?600U/ml。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶解制備薯蕷皂素的方法，其特征在于:所述酶解pH值為4?6。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶解制備薯蕷皂素的方法，其特征在于:所述纖維素酶I酶解的溫度條件為40?55°C，酶解時(shí)間為24?48小時(shí)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶解制備薯蕷皂素的方法，其特征在于:所述β-葡萄糖苷酶I酶解的溫度條件為40?50°C，酶解時(shí)間為30?48小時(shí)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種薯蕷皂素的制備方法，是以黃姜為原料經(jīng)酶解制取薯蕷皂素的方法，屬于酶工程領(lǐng)域。一種酶解制備薯蕷皂素的方法，將粉碎的黃姜浸泡在乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中依次進(jìn)行纖維素酶I酶解、β-葡萄糖苷酶I酶解，收集酶解殘?jiān)?、提純即制得薯蕷皂素。這種提取薯蕷皂素的方法，提取工藝簡單，環(huán)境污染小，適合大范圍推廣。
【IPC分類】C12P33/20
【公開號(hào)】CN105238840
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510707592
【發(fā)明人】袁其朋, 王雙, 閆美屹, 張基明
【申請(qǐng)人】遵義市倍緣化工有限責(zé)任公司
【公開日】2016年1月13日
【申請(qǐng)日】2015年10月27日