用于增強(qiáng)植物莖機(jī)械強(qiáng)度的組合物和方法
【專利說明】用于増強(qiáng)植物莖機(jī)械強(qiáng)度的組合物和方法
[0001]相關(guān)專利申請的奪叉引用
[0002] 本專利申請要求提交于2013年3月11日的美國臨時(shí)申請61/775, 801的優(yōu)先權(quán)， 其全部內(nèi)容以引用方式并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開的技術(shù)領(lǐng)域涉及植物育種和遺傳學(xué)，以及具體地涉及用于增強(qiáng)植物莖機(jī)械 強(qiáng)度的重組DNA構(gòu)建體。
【背景技術(shù)】
[0004] 玉米莖倒伏或莖折斷在美國造成了顯著的年產(chǎn)量損失。在玉米植物的營養(yǎng)生長階 段，快速生長削弱了細(xì)胞壁，使得莖組織變脆，并且當(dāng)暴露于突然的強(qiáng)風(fēng)和/或其它天氣條 件時(shí)莖折斷的傾向增加。這種莖倒伏類型稱為未成熟折斷或脆性折斷，通常發(fā)生在V5至 V8階段（當(dāng)玉米植物的生長點(diǎn)從與土接壤處出現(xiàn)時(shí)），或者發(fā)生在V12至R1階段（大約在 抽雄期前兩周至抽絲后）。另一種莖倒伏類型，季末莖倒伏，發(fā)生在接近收獲時(shí)，此時(shí)莖不 能支撐穗的重量。在季末使莖變?nèi)醯囊蛩匕ɡハx侵襲，諸如歐洲玉米螟（Europeancorn borer)侵入莖和穗梗，以及病原體感染，諸如粱炭疽病菌（Colletotrichumgraminicola)， 它是炭疽莖腐病的致病物。不利的秋季天氣條件也導(dǎo)致季末莖倒伏。
[0005] 玉米莖的機(jī)械強(qiáng)度在植物對所有類型的莖倒伏的抗性方面都起到主要作用，因此 對農(nóng)業(yè)從業(yè)者來說價(jià)值巨大。提高玉米莖的總體機(jī)械強(qiáng)度將使得莖在營養(yǎng)發(fā)育期間和季末 強(qiáng)度較高，從而減少產(chǎn)量和谷物質(zhì)量的損失。此外，具有增強(qiáng)的莖機(jī)械強(qiáng)度的玉米植物可在 田間保持較長時(shí)間段，允許農(nóng)業(yè)從業(yè)者如必要的話推遲收割。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 在一個(gè)實(shí)施例中，提供了在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，該重組DNA 構(gòu)建體包含可操作地連接至至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中多核苷酸編碼多肽，基于 ClustalV比對方法，多肽含有在與SEQIDN0:2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、或24進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、 95%或100 %序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建 體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)的莖機(jī)械強(qiáng)度。
[0007] 在另一個(gè)實(shí)施例中，植物可選自：擬南芥、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉、小麥、 苜蓿、棉、稻、大麥、粟、甘鹿和柳枝稷。
[0008] 在另一個(gè)實(shí)施例中，本公開包括本公開植物中的任一種的種子，其中所述種子在 其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至至少一種調(diào)控元 件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，基于ClustalV比對方法，該多肽含有在與SEQ 10吣：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24進(jìn)行比較 時(shí)具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100 %序列同一性的氨基酸序列，并 且其中由所述種子產(chǎn)生的植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)表 現(xiàn)出增強(qiáng)的莖機(jī)械強(qiáng)度。
[0009] 在另一個(gè)實(shí)施例中，提供了增強(qiáng)植物莖機(jī)械強(qiáng)度的方法，該方法包括：(a)將重組 DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至至少一種 調(diào)控序列的多核苷酸，其中多核苷酸編碼多肽，基于ClustalV比對方法，該多肽含有在與 SEQIDN0:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24進(jìn)行 比較時(shí)具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95 %或100 %序列同一性的氨基酸序 列；(b)在步驟（a)之后，由可再生的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中轉(zhuǎn)基因植物在其基因 組中包含重組DNA構(gòu)建體；以及（c)獲得來源于步驟（b)的轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所 述子代植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體并且在與不包含重組DNA構(gòu)建體的對照植物 進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)的莖機(jī)械強(qiáng)度。
[0010] 在另一個(gè)實(shí)施例中，提供了選擇增強(qiáng)的植物莖機(jī)械強(qiáng)度的方法，該方法包括：(a) 獲取轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，重組DNA構(gòu)建體包 含可操作地連接到至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，基于所述 ClustalV比對方法，該多肽含有在與SEQIDN0:2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、或24進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、 95%或100%序列同一性的氨基酸序列；(b)使（a)部分的轉(zhuǎn)基因植物生長；以及（c)選擇 相比于不包含重組DNA構(gòu)建體的對照植物具有增強(qiáng)的莖機(jī)械強(qiáng)度的（b)部分的轉(zhuǎn)基因植 物。
[0011] 在另一個(gè)實(shí)施例中，在本公開方法中的任一個(gè)中，植物可選自：擬南芥、玉米、大 豆、向日葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉、稻、大麥、粟、甘蔗和柳枝稷。
【附圖說明】 [0012] 和序列表
[0013] 根據(jù)以下的詳細(xì)描述和附圖以及序列表，可以更全面地理解本公開，以下的詳細(xì) 描述和附圖以及序列表形成本申請的一部分。
[0014] 圖1示出了與其WT(野生型）近親并排的bk4突變體植物（bk4_l等位基因）的 代表性圖像。A)莖B)根
[0015] 圖2是示出了相比于其het或wt近親的bk4突變體的平均節(jié)間長度和莖直徑的 圖。
[0016] 圖3是示出了相比于其het或WT近親的bk4突變體的莖機(jī)械強(qiáng)度的圖。
[0017] 圖4示出了玉米Bk4(也被稱為ZmCtll)基因和在bk4-l、bk4-2、和bk4-3突變品 系中Mu插入序列的位點(diǎn)的示意圖。外顯子由填充的矩形表示，并且內(nèi)含子由線條表示。
[0018] 圖5示出了使用十天幼苗和Zm-Ctll特異性引物的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR) 分析。結(jié)果示出了在與其WT近親進(jìn)行比較時(shí)，在純合突變體中丟失的轉(zhuǎn)錄物。
[0019] 圖6是示出了編譯自內(nèi)部專有MPSS數(shù)據(jù)庫中的玉米Ctll基因在不同組織中表達(dá) 的圖。
[0020] 圖7是示出了bk4突變體植物和其WT近親的莖的糖成分的圖（從最深至最淺是 阿拉伯糖％、半乳糖％、葡萄糖％、木糖％、和甘露糖％ )。
[0021] 圖8是示出了在Bk4突變體和WT近親玉米植物的干燥的莖組織中對香豆酸和阿 魏酸水平的差異的圖。
[0022] 圖9是示出了在野生型近親和bk4突變體之間玉米莖中木質(zhì)素分布的差異的圖。 相比于其WT近親，在遍布bk4突變體的桿的環(huán)形厚角組織細(xì)胞和束狀纖維中木質(zhì)素染色存 在顯著減少。在bk4突變體的木髓中的變形絲束是常見的。
[0023] 圖10A-10F呈現(xiàn)了如SEQ ID NO :2-24所示的多肽的氨基酸序列的比對。
[0024] 圖11A和11B呈現(xiàn)了在圖10A-10F中呈現(xiàn)的每對序列的百分比序列同一性和趨異 度值。
[0025] 圖12示出了相比于陰性對照具有增大的最大撓曲負(fù)荷的過表達(dá)ZmCtll的T1植 物。
[0026] 圖13示出了相比于陰性對照增加了平均阿魏酸含量的過表達(dá)ZmCtll的T1植物。
[0027] 圖14示出了相對于對香豆酸水平過表達(dá)ZmCtll與陰性對照類似的T1植物。
[0028] 圖15示出了相對于葡萄糖和木糖成分過表達(dá)ZmCtll與陰性對照類似的T1植物。
[0029] 圖16示出了相對于阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖成分過表達(dá)ZmCtll與陰性對照類 似的T1植物。
[0030] 圖17示出了相對于木糖％ /阿拉伯糖％的比率過表達(dá)ZmCtll與陰性對照類似的 T1植物。
[0031] SEQIDN0 :1是野生型玉米（Zeamays)Ctll基因組的核苷酸序列。
[0032] SEQIDN0:2是野生型玉米（Zeamays)CTLl(ZmCTLl)蛋白的氨基酸序列。
[0033] SEQ ID N0 :3 是來自玉米（Zea mays) (NCBI G1 No. 2265〇〇888)的一種未表征蛋 白的氨基酸序列。
[0034] SEQIDN0 :4 是來自高粱（Sorghumbicolor)(NCBIG1No. 242045186)的一種假 定蛋白的氨基酸序列。
[0035] SEQIDN0 :5 是來自水稻（Oryzasativa)(NCBIG1No. 115479911)的一種假定 蛋白的氨基酸序列。
[0036] SEQIDN0 :6 是來自二糖短柄草（Brachypodiumdistachyon)(NCBIG1 No. 357159137)的殼多糖酶樣蛋白1樣的氨基酸序列。
[0037] SEQIDN0 :7 是來自綠蘿（Epipremnumaureum)(NCBIG1No. 283〇46278)的一種 推定的殼多糖酶的氨基酸序列。
[0038] SEQIDN0 :8 是來自油棕（Elaeisguineensis)(NCBIG1No. 342151641)的I類 殼多糖酶的氨基酸序列。
[0039] SEQIDN0 :9 是來自油棕（Elaeisguineensis)(NCBIG1No. 409191689)的一種 殼多糖酶樣蛋白的氨基酸序列。
[0040] SEQ ID N0 :10 是來自高粱（Sorghum bicolor) (NCBI G1 No. 242082217)的一種 假定蛋白的氨基酸序列。
[0041] SEQ ID N0 :11 是來自多棱大麥（Hordeum vulgare) (NCBI G1 No. 326529205)的 一種預(yù)測蛋白的氨基酸序列。
[0042] SEQIDN0 :12 是來自水稻（Oryzasativa)(NCBIG1No. 115477370)的一種假定 蛋白的氨基酸序列。
[0043] SEQIDN0 :13 是來自水稻（Oryzasativa)(NCBIG1No. 125562231)的一種假定 蛋白的氨基酸序列。
[0044] SEQIDNO:14是來自蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula)(NCBIG1No. 357502783) 的一種內(nèi)殼多糖酶的氨基酸序列。
[0045] SEQIDNO:15 是來自葡萄（Vitisvinifera)(NCBIG1No. 225431904)的一種殼 多糖酶樣蛋白的氨基酸序列。
[0046] SEQIDN0 :16 是來自豌豆（Pisumsativum)(NCBIG1No. 37051096)的一種I類 殼多糖酶的氨基酸序列。
[0047] SEQIDN0 :17 是來自百脈根（Lotusjaponicas)(NCBIG1No. 388492432)的一 種未知蛋白的氨基酸序列。
[0048] SEQIDN0 :18 是來自大豆（Glycinemax)(NCBIG1No. 3638〇7428)的一種未表 征蛋白的氨基酸序列。
[0049] SEQIDN0 :19 是來自大豆（Glycinemax)(NCBIG1No. 356526631)的一種殼多 糖酶樣蛋白1樣同工型1的氨基酸序列。
[0050] SEQIDN0 :20是來自擬南芥（Arabidopsisthaliana)(NCBIG1No. 15221283)的 一種殼多糖酶樣蛋白1的氨基酸序列。
[0051] SEQIDN0 :21 是來自蓖麻（Ricinuscommunis)(NCBIG1No. 255549220)的一種 推定的殼多糖酶的氨基酸序列。
[0052] SEQIDN0 :22 是來自擬南芥（Arabidopsisthaliana)(NCBIG1No. 225897882) 的一種假定蛋白的氨基酸序列。
[0053] SEQIDN0 :23 是來自琴葉擬南芥（Arabidopsislyrata)(NCBIG1 No. 297848858)的一種pom-poml蛋白的氨基酸序列。
[0054] SEQIDN0 :24 是來自寇阿相思木（Acaciakoa)(NCBIG1No. 425886500)的一種 lb類殼多糖酶的氨基酸序列。
[0055] 序列描述和附接至此的序列表遵循適用于專利申請中的核苷酸和/或氨基酸序 列公開的規(guī)定，如37C.F.R. § 1.821 1.825中所列。
[0056] 序列表包含用于核苷酸序列字符的單字母密碼和用于氨基酸的三字母密碼，其定 義符合在NucleicAcidsRes. 13 :3021 3030 (1985)和BiochemicalJ. 219 (No. 2):345 373(1984)中所述的IUPACIUBMB標(biāo)準(zhǔn)（其以引用方式并入本文）。用于核苷酸和氨基酸 序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式遵循37C.F.R. § 1. 822所示的規(guī)定。
【具體實(shí)施方式】
[0057] 本文所列的每篇參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容均據(jù)此全文以引用方式并入本文。
[0058] 除非上下文另外明確規(guī)定，否則如本文和所附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式"一 個(gè)"、"一種"以及"所述"包括復(fù)數(shù)涵義。因此，例如，"一株植物（aplant)"的涵義包括多 株此類植物，"一個(gè)細(xì)胞（acell)"的涵義包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞以及它們?yōu)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員 所知的等同物，諸如此類。
[0059] 如本文所用：
[0060] 植物殼多糖酶推測是水解甲殼質(zhì)（一種