一種源自酪蛋白的抗氧化肽及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物活性膚技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種源自酪蛋白的富含堿性氨基酸的 抗氧化膚混合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 低密度脂蛋白（lowdensitylipoprotein,簡稱LDL)是一種運(yùn)載膽固醇進(jìn)入外周 組織細(xì)胞的脂蛋白顆粒，可被氧化成氧化型低密度脂蛋白（0X-LDL)，當(dāng)?shù)兔芏戎鞍?，尤?是經(jīng)氧化修飾的低密度脂蛋白過量時，它攜帶的膽固醇便會積存在動脈壁上，從而引起動 脈粥樣硬化。因此，通過補(bǔ)充額外的抗氧化劑來抑制LDL的氧化是一種非?？尚械念A(yù)防動 脈粥樣硬化的方法。人工合成的抗氧化劑雖然高效、廉價，但由于有副作用，人們更青睞于 選擇天然的抗氧化劑。例如抗氧化膚，由于其W預(yù)防疾病、保護(hù)健康的良好功效W及蛋白來 源豐富和其自身的安全性而備受矚目。
[0003] 抗氧化膚，是來源于蛋白質(zhì)的一類具有清除自由基、供氨/供電子、馨合金屬離 子、澤滅單線態(tài)氧、分解過氧化物、抑制脂肪氧合酶活力和抑制脂質(zhì)過氧化等功效的活性 膚。酪蛋白是牛乳中的主要蛋白質(zhì)，約占80%。酪蛋白不僅是優(yōu)質(zhì)的乳源蛋白，更是多種重 要生物活性膚的良好來源。但是運(yùn)些生物活性膚經(jīng)口服到達(dá)血液循環(huán)前，會受到一系列的 阻礙，如胃中的低酸環(huán)境和胃蛋白酶，W及腸道中堿性環(huán)境和膜蛋白酶、膚酶等，運(yùn)些因素 都會影響抗氧化膚的吸收從而影響其在生物體內(nèi)的生理活性?？寡趸w進(jìn)入血液循環(huán)到達(dá) 祀點是其發(fā)揮功能的前提條件。因此，要想利用來自牛奶酪蛋白的抗氧化膚來預(yù)防動脈粥 樣硬化的發(fā)生，不僅需要運(yùn)些膚具有較好的抑制LDL氧化的能力，還需要其能夠耐受胃腸 道的消化和吸收。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，提供一種源自酪蛋白富含 堿性氨基酸的抗氧化膚混合物，該抗氧化膚混合物不僅具有抑制低密度脂蛋白氧化功能， 而且能夠耐受胃腸道的吸收和消化而不被降解，因此，其適于應(yīng)用于保健食品和預(yù)防動脈 粥樣硬化的藥物領(lǐng)域中。 陽〇化]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)之不足，提供一種源自酪蛋白 富含堿性氨基酸的抗氧化膚混合物的制備方法。
[0006] 本發(fā)明提供的一種源自酪蛋白富含堿性氨基酸的抗氧化膚混合物的技術(shù)方案 為：該抗氧化膚混合物為KEMPFPK、RGPFPIIV、VYPFPGPIHN、??呢LQDKIHP、KAVPYPQ畑MPIQ、 VYP巧GPIHNSUQ、QPHQPUPTVMFPPQ、HQPHQPUPTVMFPPQ、MHQPHQPUPTVMFPPQ、KNQDKTEIPT、 冊P冊PLPPT、Μ冊P冊PLPPT、冊P冊PLPPTVM、NLHLPLPL、LHLPL化和MPFPK氨基酸序列中的至 少一種。
[0007] 本發(fā)明提供一種源自酪蛋白富含堿性氨基酸的抗氧化膚混合物的制備方法采用 的主要技術(shù)方案為，其包括W下步驟：
[0008] a、將酪蛋白浸泡于水中，制得酪蛋白樣品溶液，w便加酶進(jìn)行水解；
[0009] b、向步驟a中所制得的酪蛋白樣品液中加入蛋白酶進(jìn)行水解，水解結(jié)束后進(jìn)行酶 的純化，制得富含抗氧化膚的水解液；
[0010] C、將步驟b中制得的水解液的抑采用0. 5-1M鹽酸溶液將其調(diào)節(jié)至6. 5~7. 0,然 后對其進(jìn)行真空濃縮，得到濃縮液；
[0011] t將步驟C中得到的酪蛋白水解物濃縮液采用離子交換柱層析設(shè)備進(jìn)行分離純 化，得到富含堿性氨基酸的膚組分，即為具有顯著抑制低密度脂蛋白氧化的高活性抗氧化 性的抗氧化膚；
[0012] e、將步驟d中得到的抗氧化膚進(jìn)行冷凍干燥或噴霧干燥，得到富含堿性氨基酸的 酪蛋白抗氧化膚干粉。
[0013] 本發(fā)明提供的一種源自酪蛋白富含堿性氨基酸的抗氧化膚混合物的制備方法還 采用如下附屬技術(shù)方案：
[0014] 步驟a中酪蛋白樣品液的制備方法為將酪蛋白浸泡于抑為2. 0~8. 0的水中，然 后在30~60°C的水浴中預(yù)熱10~15min，目的是使酪蛋白樣品液達(dá)到蛋白酶的最佳酶解 條件；其中，所述酪蛋白與水的比例為Ig: 10~20mL。
[0015] 步驟a中，所述水優(yōu)選為純凈水、去離子水或蒸饋水；所述酪蛋白優(yōu)先選用牛奶、 羊奶的酪蛋白提取物。
[0016] 步驟b中，所述蛋白酶與所述酪蛋白的質(zhì)量比為1 : 20~100。
[0017] 步驟b中所述蛋白酶為胃蛋白酶、膜液素、膜蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng) 味蛋白酶或地衣芽抱桿菌蛋白酶。
[001引步驟b中酶的純化方法為將所述富含抗氧化膚的水解液加熱至85~100°C，并維 持10~20min，即完成酶的純化過程，同時也起到殺滅微生物的作用。
[0019] 步驟b中，使用蛋白酶對酪蛋白進(jìn)行水解的條件視酶的活力和種類而定，W便在 最佳條件下水解生成更多的抗氧化膚；例如使用堿性蛋白酶進(jìn)行水解，在酶解過程中，酶與 酪蛋白的比例為1~2 % (w/w)，水解液抑值為8. 0，溫度控制在60 °C，水解時間為4h，水解 過程中每30min調(diào)節(jié)水解液的抑至8. 0(因為在酪蛋白水解過程中，由于水解產(chǎn)生的膚和 游離氨基酸，使水解液的抑會降低到5~6左右，為了維持堿性蛋白酶水解的最佳抑，需要 用1M化0H將水解液的抑調(diào)回至8. 0);
[0020] 步驟（C)所述酪蛋白水解液真空濃縮的溫度為40~60°C。
[0021] 步驟d中酪蛋白抗氧化膚的分離純化方法，采用離子交換色譜柱法。包括W下步 驟：
[0022] (I)采用緩沖液平衡柱子2~3體積，其中，柱層析填料為SPSe地adexC-25或 DEAE-S巧hadexA-25離子交換樹脂填料；
[002引 （Π)將酪蛋白水解物溶于所述緩沖液，使其濃度為100~500mg/血，然后用 0. 45μm的水系濾膜過濾； 陽024] (III)取一定量濾液加到離子交換柱填料上方，在0. 5~5mL/min的流速下進(jìn)行分 離，收集富含堿性氨基酸的抗氧化膚組分。
[0025] 步驟（III)中，離子交換柱洗脫程序前半部分的洗脫液為緩沖液；后半部分洗脫 液為緩沖液+0. 5~1M的氯化鋼。
[00%] 步驟（III)中將收集的富含堿性氨基酸的抗氧化膚組分，繼續(xù)進(jìn)行處理的制備方 法為：采用0. 5~1. 5M的氨氧化鋼溶液將收集組分的抑調(diào)節(jié)為6. 5~7. 0,將調(diào)節(jié)抑后 的收集組分真空濃縮至干物質(zhì)含量為15~40 %，接著用填料為Se地adexG15柱層析或 D-SaltExcellulosePlasticDesalting柱進(jìn)行脫鹽處理，然后對脫鹽后的抗氧化膚溶液 進(jìn)行真空濃縮，將所述濃縮液進(jìn)行噴霧或冷凍干燥，得到富含堿性氨基酸的酪蛋白抗氧化 膚。
[0027] 所述的富含堿性氨基酸的抗氧化膚混合物在保健食品和預(yù)防動脈粥樣硬化的藥 物領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0028] 對制得抗氧化膚進(jìn)行體外模擬胃腸消化的方法
[0029] 稱取60.Omg抗氧化膚溶于5. 5血濃度為0.OlOmol/L的鹽酸溶液中。按照酶/底 物巧/S) = 1 : 50的比例用0.OlOmol/L鹽酸溶液作為溶劑配制濃度為2. 4mg/mL的胃蛋 白酶溶液（抑=2. 0)，將待消化的底物溶液與胃蛋白酶溶液分別置于37°C預(yù)熱15min，然后 取0. 5mL胃蛋白酶溶液加入待消化的底物溶液中，置于37°C恒溫水浴振蕩器中，計時模擬 胃消化化；
[0030] 按照酶/底物巧/巧=1 : 25配制濃度為8mg/m的膜酶溶液，待上述模擬胃消化 結(jié)束后，用0. 9mol/L的Na肥〇3溶液將消化液抑值調(diào)節(jié)至5. 3,再用2.Omol/L的化0H溶液 將其抑值繼續(xù)調(diào)節(jié)至7. 5,然后取0.ImL膜酶溶液加入上述消化液中，置于37°C恒溫水浴 振蕩器中，計時模擬腸消化化；
[0031] 模擬胃腸消化結(jié)束后，消化液立即置于沸水浴中滅酶lOmin，待其冷卻至室溫，用 0. 01M的肥1溶液將其抑值調(diào)至7. 0,8000g離屯、15min后，取上層清液冷凍干燥。
[0032] 對制得抗氧化膚進(jìn)行體外模擬腸吸收的方法
[0033] 模擬腸吸收采用化CO-2細(xì)胞模型，W含20% (V/V)胎牛血清、1 % (V/V)非必需 氨基酸、1% (V/V)雙抗（lOOU/mL的青霉素和0.Img/mL的鏈霉素組成的雙抗）的培養(yǎng)液 值U化ecco'SModifiedEagleMedium,簡稱DMEM)作為Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)基，將Caco-2 細(xì) 胞置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中（細(xì)胞培養(yǎng)面積為25cm2)，于37 °C、相對濕度為90 %、5 %的C〇2培養(yǎng) 箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每兩天換一次細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)融合至80%左右時，用含 有0. 05 %邸TA的膜酶進(jìn)行消化，將細(xì)胞消化懸液吹打均勻后W4-5X105個/mL的密度接 種于6孔化answell板的上側(cè)（AP側(cè)），同時下側(cè)度L側(cè)）加入3mL細(xì)胞培養(yǎng)基，于細(xì)胞培 養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，接種后每兩天更換一次細(xì)胞培養(yǎng)基，并通過Millicell電阻儀測定細(xì)胞 單層的跨膜電阻值，待細(xì)胞培養(yǎng)21天并且跨膜電阻達(dá)到400Ω.cm2W